周毓麟，李蘭洲，胡文繼，滕偉卓，鄭德慶，劉 洋,*

(1 吉林大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，長(zhǎng)春 130012；2 吉林省長(zhǎng)春市沐石河鎮(zhèn)中心校，長(zhǎng)春 130508)

蝙蝠蛾擬青霉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及免疫活性研究

周毓麟1，李蘭洲1，胡文繼1，滕偉卓1，鄭德慶2，劉 洋1,*

(1 吉林大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，長(zhǎng)春 130012；2 吉林省長(zhǎng)春市沐石河鎮(zhèn)中心校，長(zhǎng)春 130508)

目的：建立蝙蝠蛾擬青霉菌100 L發(fā)酵菌絲體質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，并驗(yàn)證其安全性和免疫調(diào)節(jié)活性.方法：采用高效液相色譜等方法，在測(cè)定菌絲體產(chǎn)量和腺苷含量的基礎(chǔ)上，測(cè)定其水分、一般雜質(zhì)、酸不溶性雜質(zhì)和重金屬含量.此外，進(jìn)行了小鼠免疫增強(qiáng)實(shí)驗(yàn).結(jié)果：菌絲體產(chǎn)量不少于20.80 g/L，菌絲體中腺苷含量不少于0.27%，水分含量不超過(guò)6.71%，總灰分含量不超過(guò)1.26%，酸不溶性灰分含量不超過(guò)0.15%，重金屬含量少于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)計(jì)入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)正文.小鼠免疫增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)顯示，發(fā)酵菌絲體顯著提高小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)，并對(duì) IL-10、IL-12、IL-12R、IFN-α 等炎癥相關(guān)因子水平具有上調(diào)作用.結(jié)論：初步建立了蝙蝠蛾擬青霉菌100 L發(fā)酵菌絲體質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，并證實(shí)其在小白鼠體內(nèi)的安全性和免疫調(diào)節(jié)活性.

蝙蝠蛾擬青霉；發(fā)酵；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；免疫調(diào)節(jié)

冬蟲夏草(Ophiocordycepssinensis)是蟲草菌寄生于蝙蝠蛾類昆蟲的幼蟲后形成的蟲菌結(jié)合體，包括了蝙蝠蛾幼蟲的蟲體殘骸和真菌的子座[1].冬蟲夏草良好且廣泛的生物學(xué)活性，吸引越來(lái)越多的研究者投入其研究開發(fā)中[2].但冬蟲夏草嚴(yán)格的寄生性與特殊的生存環(huán)境依賴性制約其產(chǎn)業(yè)化發(fā)展[3]，同時(shí)掠奪性挖掘和環(huán)境的破壞使冬蟲夏草野生資源瀕臨枯竭.野生冬蟲夏草的生長(zhǎng)環(huán)境開放等原因還導(dǎo)致蟲草質(zhì)量差異巨大、重金屬含量超標(biāo)等問(wèn)題[4,5].為此，國(guó)內(nèi)外學(xué)者在尋找質(zhì)量可控的冬蟲夏草代用品方面做了大量工作.

蝙蝠蛾擬青霉(Paecilomyceshepiali)是從天然冬蟲夏草中分離得到的具有相似化學(xué)成分的真菌，其多糖、蟲草酸、蟲草腺苷(冬蟲夏草中的主要有效成分)和蟲草素均具有顯著的藥理活性[1,6,7]，有望成為野生蟲草的替代產(chǎn)品[8,9].

目前關(guān)于蝙蝠蛾擬青霉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究主要集中于菌絲體產(chǎn)量和其有效成分如腺苷、甘露醇和多糖等的含量上[10,11].并且，產(chǎn)業(yè)化必須的大規(guī)模發(fā)酵方面的研究報(bào)道還很少.本文在菌絲體產(chǎn)量和腺苷含量的基礎(chǔ)上，通過(guò)對(duì)水分、灰分、酸不溶性灰分和重金屬等含量的測(cè)定，建立了蝙蝠蛾擬青霉100 L發(fā)酵菌絲體質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，并利用小鼠免疫增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)對(duì)菌絲體動(dòng)物安全性和免疫調(diào)節(jié)活性進(jìn)行評(píng)估，為進(jìn)一步的放大發(fā)酵規(guī)模奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株

蝙蝠蛾擬青霉SY02菌株(本實(shí)驗(yàn)室選育).

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

昆明種小鼠，體重20～22 g，(購(gòu)自長(zhǎng)春生物制品研究所)許可證號(hào)：SCXK-(吉)2014-0005.

1.1.3 試劑

腺苷標(biāo)準(zhǔn)品、甲醇(色譜純，Sigma 公司)，金水寶膠囊(江西濟(jì)民可信公司)，IL-10、IL-10R、IL-12、IL-12R、IFN-α、NF-κB 等ELISA試劑盒及綿羊紅細(xì)胞(SRBC)(上海源葉生物科技有限公司)，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純.

1.1.4 儀器

臺(tái)式恒溫?fù)u床(INNOVA 4000，美國(guó))，高速冷凍離心機(jī)(GentrifuGe5810R，德國(guó) Eppendorf)，真空冷凍凍干機(jī)(HLPHA-1-4，德國(guó) Christ)，高效液相色譜儀(SPD-10A，日本島津)，紫外分析儀(UV-1V，北京新技術(shù)公司).

1.2 蝙蝠蛾擬青霉菌絲體質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立

1.2.1 菌粉制備

培養(yǎng)基組成(1 L)：30 g蔗糖，10 g蛋白胨，18 g酵母浸粉，3 g KH2PO4·3H2O，3 g MgSO4·7H2O，0.235 g VB1，0.011 g ZnCl2，10 g (NH4)2SO4.

菌種活化：100 mL搖瓶裝液40 mL培養(yǎng)基，接種斜面保存的蝙蝠蛾擬青霉SY02菌株，培養(yǎng)溫度26 ℃，轉(zhuǎn)速150 r/min，培養(yǎng)時(shí)間3 d，既得蝙蝠蛾擬青霉種子培養(yǎng)基.

菌粉制備：100 L發(fā)酵罐裝液70 L培養(yǎng)基，接入5%種子培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，26 ℃(150 r/min)培養(yǎng)5 d，得到的發(fā)酵培養(yǎng)液4000 r/min離心10 min，沉淀凍干，即得蝙蝠蛾擬青霉菌絲體凍干粉末，備用.

1.2.2 蝙蝠蛾擬青霉性狀鑒別實(shí)驗(yàn)

通過(guò)直接觀察菌粉的形態(tài)、顏色、氣味、質(zhì)地來(lái)鑒別.

1.2.3 蝙蝠蛾擬青霉菌絲體產(chǎn)量

取5批發(fā)酵菌絲體凍干粉末，稱量計(jì)算每升發(fā)酵液菌粉質(zhì)量，即為菌絲體產(chǎn)量.

1.2.4 腺苷含量的測(cè)定

采用高效液相色譜法(中國(guó)藥典2010年版一部附錄Ⅵ D)測(cè)定腺苷含量.

取5批樣品，依法制備供試品溶液，每批2份，每份平行進(jìn)樣2針，精密吸取供試品溶液 20 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積，計(jì)算5批樣品中腺苷含量.

1.2.5 一般雜質(zhì)含量測(cè)定

水分含量測(cè)定：取5批樣品，按照水分測(cè)定法(《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄Ⅸ H 第二法)測(cè)定，計(jì)算供試品中含水量(%).

總灰分含量測(cè)定：取5批樣品，按照總灰分測(cè)定法(《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄Ⅸ K)測(cè)定，計(jì)算供試品中總灰分的含量(%).

酸不溶性灰分測(cè)定：取5批樣品，按照酸不溶性灰分測(cè)定法(《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄Ⅸ K)測(cè)定，計(jì)算供試品中酸不溶性灰分的含量(%).

1.2.6 重金屬檢查

取5批樣品，測(cè)定其鉛、汞、鉻、鎘、砷重金屬含量，均采用食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB5009現(xiàn)行執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)檢查.

1.3 蝙蝠蛾擬青霉免疫調(diào)節(jié)活性研究

1.3.1 小鼠分組及給藥

將120只雌雄各半的健康小鼠，根據(jù)體重平均分為5組.即空白對(duì)照組、0.6 g/kg金水寶膠囊粉組、3.0 g/kg蝙蝠蛾擬青霉組、1.5 g/kg蝙蝠蛾擬青霉組和0.3 g/kg蝙蝠蛾擬青霉組，空白對(duì)照組予同等體積蒸餾水，連續(xù)灌胃15 d.

1.3.2 小鼠臟器指數(shù)測(cè)定

取灌胃15 d的各組小鼠，于末次給藥2 h后，稱重，脫頸處死.取脾臟，剔除結(jié)締組織，用濾紙吸干脾臟表面液體，稱重、記錄，由下式計(jì)算脾臟指數(shù)(%).

脾臟指數(shù)=(脾臟重量g/小鼠體重g)×100.

1.3.3 遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)實(shí)驗(yàn)

取各組灌胃15 d的小鼠，每組各12只，雌雄各半.制備2% SRBC懸液(V /V)，于每只受試小鼠腹腔注射0.2 mL，致敏后4 d，用游標(biāo)卡尺測(cè)量左后足跖的厚度.制備20% SRBC懸液(V /V)，在每只鼠測(cè)量部位處皮下注射20 μL.注射24 h后再次測(cè)量該足跖厚度, 連續(xù)測(cè)定3次，計(jì)算平均值.

1.3.4 免疫相關(guān)細(xì)胞因子測(cè)定

取灌胃15 d的各組小鼠，在最后一次灌胃2 h后眼球取血，室溫放置0.5 h，3000 r/min離心5 min，取上清液，上清液再次3000 r/min離心5 min,取2次離心上清液備用.按照檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書要求檢測(cè)IL-10、IL-10R、IL-12、IL-12R、IFN-α、NF-κB等含量.

2 結(jié)果與分析

2.1 性狀鑒別結(jié)果

菌粉呈粉末狀，米黃色至深黃色，粉末無(wú)明顯氣味，觸感細(xì)膩.

2.2 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 發(fā)酵菌絲體產(chǎn)量

根據(jù)5批樣品測(cè)定結(jié)果，菌絲體產(chǎn)量在23.11～27.31 g/L區(qū)間.以5批樣品平均產(chǎn)量的85%作為下限列入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，因此暫定每升發(fā)酵液中菌粉干重不少于20.80 g.

2.2.2 腺苷含量

腺苷色譜結(jié)果(圖1)所示，在10 min時(shí)腺苷標(biāo)準(zhǔn)品與菌粉都有吸收峰.

5批樣品腺苷測(cè)定結(jié)果，含量范圍在2.93～3.41 g/kg之間，以最低含量的85%計(jì)入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，因此暫定腺苷含量不少于0.27%.

a 樣品;b 腺苷對(duì)照品 圖1 樣品和腺苷對(duì)照品色譜圖Fig.1 The chromatograms of Paecilomyces hepialid and adenosine reference substance

2.2.3 一般雜質(zhì)含量

表1為一般雜質(zhì)檢查結(jié)果，以5批樣品中雜質(zhì)平均含量的150%作為上限列入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn).將水分含量不超過(guò)6.71%，總灰分含量不超過(guò)1.26%，酸不溶性灰分含量不超過(guò)0.15%列入本品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)正文檢查項(xiàng)下.

表1 蝙蝠蛾擬青霉一般雜質(zhì)含量Tab.1 The normal impurity content of Paecilomyces hepiali

2.2.4 重金屬含量結(jié)果

菌粉中重金屬含量檢測(cè)結(jié)果(表2)，含量均小于國(guó)家保健(功能)食品通用標(biāo)準(zhǔn)GB16740—1997規(guī)定或低于中國(guó)藥典標(biāo)準(zhǔn)，故重金屬未列入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)正文檢查項(xiàng)下.

表2 蝙蝠蛾擬青霉重金屬含量Tab.2 The heavy metals content of Paecilomyces hepiali

2.3 小鼠免疫增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 小鼠臟器指數(shù)測(cè)定結(jié)果

0.3、1.5、3.0 g/kg蝙蝠蛾擬青霉組小鼠的脾臟指數(shù)與空白對(duì)照組比較均無(wú)顯著性差異(圖2)，蝙蝠蛾擬青霉對(duì)小鼠脾臟指數(shù)無(wú)顯著影響(p>0.05).

2.3.2 遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)

足趾腫脹度(DTH)結(jié)果顯示(圖3)，0.3 g/kg、1.5 g/kg和3.0 g/kg蝙蝠蛾擬青霉給藥組與空白對(duì)照組相比腫脹程度差異顯著(p<0.01)，沒(méi)有明顯的劑量依賴性.表明蝙蝠蛾擬青霉具有增強(qiáng)機(jī)體遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的作用.

2.3.3 免疫細(xì)胞因子測(cè)定結(jié)果

從表3可以看出，蝙蝠蛾擬青霉對(duì)IL-10、IL-12、IL-12R、IFN-α 等細(xì)胞因子水平有顯著上調(diào)作用(p<0.05)，其中3.0 g/kg蝙蝠蛾擬青霉組效果最顯著.

圖2 小鼠脾臟指數(shù)測(cè)定結(jié)果Fig.2 Spleen index in mice

與空白對(duì)照組相比，**p<0.01

表3 免疫相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)測(cè)定結(jié)果Tab.3 Expressions of immune related cytokines

注：與空白對(duì)照組相比，*p<0.05，**p<0.01

3 結(jié)語(yǔ)

本文建立了蝙蝠蛾擬青霉100 L發(fā)酵菌絲體質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn).將菌絲體產(chǎn)量不少于20.80 g/L，腺苷含量不少于0.27%，水分含量不超過(guò)6.71%，總灰分含量不超過(guò)1.26%，酸不溶性灰分含量不超過(guò)0.15%，重金屬含量少于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)計(jì)入蝙蝠蛾擬青霉100 L發(fā)酵菌絲體的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)正文.

本文利用小鼠免疫增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)蝙蝠蛾擬青霉100 L發(fā)酵菌絲體的免疫增強(qiáng)活性，結(jié)果顯示100 L發(fā)酵菌絲體對(duì)小鼠脾臟指數(shù)無(wú)顯著影響，且能顯著增強(qiáng)小鼠超敏反應(yīng)，提高IL-10、IL-12、IL-12R、IFN-α 等炎癥因子含量，證實(shí)蝙蝠蛾擬青霉100 L發(fā)酵菌絲體體內(nèi)安全性和有提高小鼠細(xì)胞免疫功能，減輕機(jī)體炎癥反應(yīng)的作用.

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Research on the Quality Standard and the Immunoregulation Function ofPaecilomycesHepialid

ZhouYulin1,LiLanzhou1,HuWenji1,TengWeizhuo1,ZhengDeqing2,LiuYang1

(1 College of Life Sciences, Jilin University, Changchun 130022,China;2 Centre School of Mushihe Town,Changchun 130508,China)

Objective: Aim to establish the quality standard of the 100 L FermentationPaecilomyceshepialidmycelium, and study on the safety and immunoregulation activity.Methods: With HPLC and other methods，detect the content of moisture, the general impurities, acid insoluble impurities and heavy metals basing on the output and adenosine concent of the mycelium to set up the quality standard.At the same time, the safety and immune regulation activity were determined by the immunological experiment of mice.Results: Mycelium yield is more than 20.80 g/L, adenosine is more than 0.27%, moisture content is less than 6.71%, total ash is less than 1.26% and acidinsoluble ash is less than 0.15% and heavy metal is less than mandatory standard as the quality standard.Meanwhile, the immunological experiment results show thatPaecilomyceshepialidmycelium could observably improve the DTH reaction and improve the content of IL-10, IL-12, IL-12R and IFN-α.Conclusions: The quality standard of 100 L FermentationPaecilomyceshepialidmycelium is established, and the safety and immunoregulation function in mice are approved.

Paecilomyceshepialid;fermentation;quality standard;immunoregulation

2017-02-15 *通訊作者 劉 洋，研究方向：生理藥理研究.E-mail:llz1604397692@163.com

周毓麟(1983-)，男，工程師，博士，研究方向：藥劑與分子藥理研究.E-mail: zhouyl133@jlu.edu.cn

吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(20130201006ZY)

TQ920.1;R932；R927.11

A

1672-4321(2017)01-0024-04