林玉芳 封志純

氣道內(nèi)干預在大鼠支氣管肺發(fā)育不良模型的應用

林玉芳 封志純

目的 探索一種簡便可行的氣道內(nèi)干預方式，應用到動物支氣管肺發(fā)育不良(bronchopulmonary dysplasia，BPD)模型。方法 新生1d Sprague-Dawley大鼠24只平均分為兩組，一組為空氣對照組，一組置于75%氧環(huán)境建立高氧誘導新生鼠BPD模型。于生后14d建模成功后，脫離氧環(huán)境，兩組均采用自制氣管插管，經(jīng)聲門氣管插管方式，氣道內(nèi)給予2 μL/g 生理鹽水，觀察兩組新生鼠體重、氣管插管時間、干預后一周新生鼠存活率，新生鼠活力，并于生后21d處死，取肺組織行HE染色，觀察其結(jié)構(gòu)形態(tài)學變化。結(jié)果 氧誘導BPD模型建立后，高氧組新生大鼠體重低于空氣對照組，所需插管時間高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且體重越大，所需插管時間越短(r=-0.719，P<0.05)，高氧組新生鼠一周后存活率低于對照組(83.3% vs 100%)，但均高于80%。高氧組新生鼠活力較對照組差，HE染色提示對照組肺組織結(jié)構(gòu)無明顯異常，高氧組出現(xiàn)肺結(jié)構(gòu)損害，肺泡數(shù)目下降。結(jié)論 經(jīng)聲門氣管插管，氣道內(nèi)給予2 μL/g干預體積的干預方式，簡單易行，所需成本較低，干預后新生鼠存活率高，可以推廣應用到需氣道內(nèi)給藥的動物實驗研究。

高氧；新生大鼠；氣管插管；支氣管肺發(fā)育不良

氣管肺發(fā)育不良(bronchopulmonary dysplasia，BPD)是早產(chǎn)兒常見慢性呼吸系統(tǒng)疾病，其發(fā)病機制尚不明確，且隨著產(chǎn)前糖皮質(zhì)激素應用、產(chǎn)后使用肺表面活性物質(zhì)、機械通氣方式改進及早產(chǎn)兒營養(yǎng)支持，早產(chǎn)兒BPD發(fā)生率呈逐年增高趨勢[1]?？紤]BPD是肺部局部病變，關(guān)于其治療的相關(guān)研究，宜于采用氣管插管，氣道內(nèi)干預方法。動物實驗中，由于老鼠繁殖快，成本低，易于飼養(yǎng)等特點，被廣泛應用于基礎研究。氣管插管機械通氣的方式，已較多應用于老鼠的心梗模型及需氣道內(nèi)干預等的相關(guān)研究中[2-3]。本實驗，通過75%氧誘導新生SD大鼠BPD模型[4-5]，采用自制氣管插管，通過經(jīng)聲門氣管插管的方式，探索2 μL/g干預體積在新生大鼠BPD模型應用中的可行性。

資料與方法

一、實驗動物及分組

清潔級健康SD孕鼠2只(購自北京華阜康生物科技有限公司),足月分娩后收集不同窩別鼠仔24只，混合后隨機重新分窩，一組為空氣對照組，一組為75%氧誘導BPD模型組，兩組出生體重差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

二、動物BPD模型建立

自制塑料容器 60cm×45cm×25cm為氧箱，容器內(nèi)設有 3 個不同孔區(qū)，一個是進氣孔，另一個是由多個小孔組成的出氣孔，第三孔與測氧儀(KY-2F型控氧儀，浙江省建德市新安江分析儀器二廠)相連。容器內(nèi)放入鈉石灰以吸附二氧化碳，箱內(nèi)溫度 22-30℃，濕度 65%-75%?？諝鈱φ战M將1d新生SD大鼠置于常規(guī)飼養(yǎng)環(huán)境中，高氧組將1d新生SD大鼠置于氧箱中，持續(xù)輸入氧氣，氧流量為1L/min 左右，維持氧濃度75%，持續(xù) 14d, 測氧儀每日監(jiān)測3次，每天定時開箱 1h，添加水和飼料，更換墊料鈉石灰。

三、氣管插管的構(gòu)建及插管方法

考慮新生鼠體重較小，聲門較窄，本實驗采用9號腰椎穿刺針(揚州市江洲醫(yī)療器械有限公司)，將針芯抽出，尖端截短磨鈍，并套上24G靜脈留置針軟套管(江蘇蘇云醫(yī)療器材有限公司)，構(gòu)建成新生大鼠專用氣管插管。將高氧組新生大鼠于生后14d脫離氧環(huán)境，兩組均稱重，考慮嚙齒類動物對急性缺氧的耐受性較低,對麻醉所致呼吸抑制作用比較敏感,麻醉過深易造成實驗動物發(fā)生呼吸抑制,如不能盡快完成氣管插管極易致實驗動物死亡，麻醉過淺則可能在插管過程中造成強烈應激,如肢體扭動、呼吸節(jié)律紊亂、聲門關(guān)閉等。強行插管易造成口咽部水腫、聲帶損傷、喉痙攣、會厭或上氣道出血等并發(fā)癥,嚴重影響實驗動物生理狀態(tài),干擾拔管后進食時間,影響實驗結(jié)果的準確性，即掌握合適的麻醉深度是成功完成氣管插管的前提。本實驗采用腹腔注射10%水合氯醛(北京軍區(qū)總醫(yī)院制劑中心)3mL/kg，注射后3min左右，新生大鼠出現(xiàn)肌張力減弱，牽拉舌體無明顯抵抗。將新生鼠腹部朝上，四肢固定于自制操作臺上，并用細絲線固定上門牙，以防止頭部活動，將操作臺平面固定與地面成45°角，在操作臺上方放置一冷光源。測定大鼠門齒據(jù)其上肢端距離作為氣管插管深度，并在自制插管上做相應標記，左手的拇指和食指將新生鼠舌頭輕輕拉向左側(cè)，使用小號挖耳勺將舌根輕輕抬起，大鼠頸部在冷光源照射下，肉眼可看到舌根附近一透亮區(qū)域，使用自制的氣管插管輕輕撥動該區(qū)域，即可看到聲門口一張一合，在新生鼠吸氣瞬間，將氣管插管輕輕插入，插入深度以插管上標記作為參考。

四、插管正確性判斷及干預物體積選擇

新生小鼠安靜狀態(tài)下以腹式呼吸為主，氣管插管經(jīng)過聲門時，新生鼠會出現(xiàn)一定刺激反應，操作者能感受到插管阻力稍增大，存在一定摩擦感，當插管進入氣道后，新生鼠呼吸轉(zhuǎn)為胸式呼吸，且將置于-20°冰箱預冷2min的鏡子光面，置于氣管插管口，可觀察到圓形霧氣形成(預冷時間不宜過長，防止脫離低溫，鏡子光面即形成一層水霧)，將一細小纖毛放置在導管口處,亦可見纖毛隨呼吸擺動。而氣管插管滑入食道，則無上述現(xiàn)象?？紤]氣道內(nèi)干預物體積過大，容易導致窒息，參照相關(guān)文獻，本實驗采用氣道內(nèi)給予2 μL/g生理鹽水[6]，并追加50 μL左右空氣，利于生理鹽水在氣道分布。

五、實驗標本的采集

兩組新生大鼠均于生后21d，腹腔注射10%水合氯醛(8mL/Kg)處死，快速剪開胸腔，取出左側(cè)肺臟，生理鹽水沖洗后，浸于4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋，常規(guī)5μm切片，蘇木素 - 伊紅(HE)染色進行肺組織形態(tài)(光鏡)觀察。

六、觀察指標

新生鼠入組時的體重及造模后體重，氣管插管時間，插管一周后存活率，體重與插管時間相關(guān)性，并觀察兩組新生鼠的活力和肺組織結(jié)構(gòu)方面的差異。

七、統(tǒng)計學處理

實驗結(jié)果

一、新生鼠體重、插管時間、插管存活率及體重和插管時間相關(guān)性

入組時空氣組新生鼠體重和高氧組差異無統(tǒng)計學意義(7.40±0.43 vs 7.44±0.31，P>0.05),生后14d空氣組新生鼠體重高于高氧組，差異有統(tǒng)計學意義(28.54±1.63 vs 18.42±1.59，P<0.05)?？諝饨M插管時間低于高氧組，差異有統(tǒng)計學意義(37.90±7.57 vs 47.89±6.27，P<0.05)?？諝饨M干預后1周存活率100%，高氧組干預后一周內(nèi)，死亡1只，存活率83.8%。插管時間和體重存在一定負相關(guān)，體重越大，所需插管時間越短。(見表1，圖1)。

表1 兩組新生鼠體重及插管時間的比較±s)

注：aP<0.05，與空氣對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義

二、新生鼠活力及肺組織結(jié)構(gòu)

入組時兩組新生鼠活力無明顯差異，高氧組生后14d，新生鼠表現(xiàn)為毛發(fā)蓬松、粗糙，光澤差；活力下降，反應明顯變差，少動不活潑，體格較對照組明顯較小。且脫離氧環(huán)境一周后(生后21d)，仍可觀察到高氧組鼠體格較空氣組小，活力較空氣組稍差。21d處死后，肺組織HE染色觀察到，空氣組生理鹽水干預后，肺組織結(jié)構(gòu)無明顯異常改變，肺泡結(jié)構(gòu)清楚，肺泡腔較小，肺泡數(shù)目較多，肺泡間隔較厚；高氧組肺泡均呈不規(guī)則改變，腔隙較大，部分肺泡融合，整體數(shù)量減少(見圖2)。

圖1 插管時間與新生鼠體重散點圖

注：橫軸代表新生鼠體重(單位g)，縱軸代表插管時間(單位s)，二者pearson線性相關(guān)分析r=-0.719，P=0.000，體重越小，所需插管時間越長

圖2 肺組織HE染色(100×)

注：空氣組無明顯肺損傷，肺泡結(jié)構(gòu)清楚，肺泡腔較小，肺泡數(shù)目較多，肺泡間隔較厚；高氧組肺組織結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡壁較薄，肺泡大小不均，數(shù)目明顯減少，肺泡腔直徑明顯增大

討 論

采用經(jīng)聲門氣管插管，氣道內(nèi)給予2 μL/g干預體積，干預后動物存活率高，且無肺水腫、肺出血等不良反應。體積小的動物氣管較細,聲門較窄，氣管插管的方法嚴重影響小鼠成活率。氣管切開法存在損傷較大,通常發(fā)生氣管塌陷、氣管切口出血、分泌物增多引起小鼠窒息死亡及術(shù)后氣管狹窄等系列并發(fā)癥，而直視下經(jīng)聲門氣管插管由于創(chuàng)傷較小、安全性高、便于術(shù)后恢復等優(yōu)點，是構(gòu)建人工氣道最常用的方法[7-8]。判定插管是否正確應在插管完成后隨即進行,一旦判斷插管不成功，即應迅速拔管重新插管,避免麻醉大鼠發(fā)生嚴重呼吸抑制。

目前關(guān)于小動物氣管插管方面研究，多需要特殊設備輔助[5]，該實驗干預方法不需特殊設備,簡便易行,自制氣管插管材料簡單，成本較低，并可根據(jù)研究動物體重不同，改變腰穿針及靜脈留置針型號，構(gòu)建適合的氣管插管。不足之處在于，照明不足、暴露不良的情況下，若不能準確觀察到開合的聲門就容易將插管送入食管，因此該技術(shù)對操作者熟練度有一定要求。關(guān)于高氧組新生鼠存活率低于對照組，考慮和高氧導致肺損傷有一定相關(guān)性[9]。氣道內(nèi)干預物體積過大，容易引起肺損傷，嚴重者導致窒息。目前關(guān)于小動物氣道內(nèi)干預物體積的研究較少，且干預用量不一[6, 10]。本實驗探索15-35g體重小動物，證實氣道內(nèi)給予2 μL/g干預體積具有可行性，無明顯肺損傷。該實驗表明，此種氣道內(nèi)干預方法可推廣應用到支氣管肺發(fā)育不良干預研究中。

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Application of airway intervention in rat model of bronchopulmonary dysplasia

LIUYu-fang,FENGZhi-ChunDepartmentofNeonatalIntensiveCareUnit,BayiChildren'sHospital

AffiliatedtoClinicalMedicalCollegeinArmyGeneralHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei,Anhui230000,China

Objective To explore a simple and feasible way of airway intervention, and to apply to the model of pulmonary dysplasia in animals. Methods 24 one-day old neonatal SD rats were divided into 2 groups, the air control group and the group of 75% oxygen environment in the establishment of a high oxygen induced neonatal rat BPD model. After 14 days, the neonatal rats were taken out of the oxygen environment. The two groups were made by self-made endotracheal intubation, through the way of the trachea intubation, 2ul/g physiological saline was given in the airway. The body weight, the intubation time, the survival rate of newborn rats after intervention, and neonatal rat vigor in the two groups were observed. After the birth of 21day, these rats were killed, and their lung tissue was taken for HE staining, and the morphological changes were observed. Results After BPD model was established, the body weight of newborn rats in the high oxygen group was lower than that of the air control group, the intubation time was longer than that of the control group (P<0.05). The larger the body weighted, the shorter he time required (r=-0.719,P<0.05). The survival rate of neonatal rats in the high oxygen group was lower than that of the control group (83.3% vs 100%), but all above 80%. Compared with the control group, the activity of neonatal rats in the high oxygen group was less, HE staining suggested lung tissue damaged, and alveolar declined. But in the control group, there was no abnormal lung tissue structure. Conclusion The airway intervention method which 2ul/g physiological saline is given in rats airway through endotracheal intubation, is simple, with the advantages of low cost and high survival rate of newborn rats, which can be applied to the animal experimental study of the need for airway administration.

high oxygen; neonatal rats; tracheal intubation; bronchopulmonary dysplasia

10.3969/j.issn.1009-6663.2017.05.023

230000 安徽 合肥，安徽醫(yī)科大學陸軍總醫(yī)院臨床學院

封志純，E-mail:zhjfengzc@126.com

2016-09-13]