李慶偉， 張 撼， 逄 越

(1.遼寧師范大學 生命科學學院, 遼寧 大連 116081； 2.遼寧師范大學 七鰓鰻研究中心, 遼寧 大連 116081)

鈣調(diào)蛋白結構、性質(zhì)及其細胞生物學功能的研究進展

李慶偉1，2， 張 撼1,2， 逄 越1,2

(1.遼寧師范大學 生命科學學院, 遼寧 大連 116081； 2.遼寧師范大學 七鰓鰻研究中心, 遼寧 大連 116081)

鈣調(diào)蛋白(calmodulin，簡稱CaM)是普遍存在于真核生物中且高度保守的一類鈣離子結合蛋白，在不同物種中，其氨基酸的同源性非常高.作為典型的EF-hand家族蛋白成員，CaM可以結合Ca2+，形成Ca2+-CaM復合體，從而調(diào)節(jié)細胞代謝及靶酶的功能.CaM與多種靶蛋白結合，調(diào)節(jié)靶蛋白的活性，激活下游細胞凋亡、自噬等細胞反應.CaM能夠調(diào)控微管的解聚.此外，CaM還可以影響細胞增殖，促進DNA的合成，調(diào)控細胞周期的進程.就CaM的結構、性質(zhì)及細胞生物學功能進行綜述,以期為從事該領域研究的科研人員提供有益參考.

鈣調(diào)蛋白；微管解聚；細胞增殖；細胞周期

早在1965年，Ebashi等[1]在細胞中發(fā)現(xiàn)了一種可以結合并傳遞鈣離子信號的蛋白，短期內(nèi)引起了很大的轟動；后來美籍華人張槐耀博士[2]對這個鈣結合蛋白的結構和功能進行了深入的研究，并將此類蛋白命名為“鈣調(diào)蛋白”.

CaM被認為是真核細胞中重要的調(diào)節(jié)器[3].Ca2+作為動植物及微生物中重要的第二信使[4]，在細胞內(nèi)行使多種細胞生理反應的同時[5]，也是細胞內(nèi)重要的離子之一.作為離子信號分子的Ca2+需要與下游的離子受體結合才能行使相關生化功能和諸多細胞反應，研究表明，Ca2+最重要的離子受體就是CaM.空載的CaM不具有任何酶活性，只有當CaM結合了Ca2+，形成了Ca2+-CaM復合體后，才能引起CaM構型發(fā)生改變，暴露疏水區(qū)，CaM的活性才能被激活.CaM在生物進化中是高度保守的一類重要的調(diào)節(jié)型蛋白，無論是高低等生物，其同源性都非常高.通過近50 a時間的探索，對CaM的結構、性質(zhì)的研究已經(jīng)有了飛躍性的突破，同時在功能方面，對細胞周期調(diào)控、細胞增殖、微管解聚[6]、以及與下游靶酶、靶蛋白的結合等領域也獲得了可喜的成果.本文就CaM的結構、性質(zhì)以及細胞生物學功能進行綜述.

1 CaM的結構

CaM是由148個氨基酸殘基組成的、且在不同物種中高度保守的一類小分子蛋白質(zhì)，其相對分子質(zhì)量為16.7 kD.CaM屬于典型的EF-hand型家族，N末端和C末端都有一相似的EF-hand結構域，這2個結構域是通過一個長而富有彈性的中央Linker連接而成[7].EF-hand不會單獨出現(xiàn)，而是成對存在,除了CaM含有4個EF-hand外，還有2、6個EF-hand 2種類型.CaM外形似啞鈴，兩端具有可以結合鈣離子的2個球形末端(圖1),每個EF-hand的球形末端可以結合2個Ca2+，這樣1個CaM就可以結合4個Ca2+.

CaM一級結構非常穩(wěn)定，有研究表明，無論是脊椎生物，還是無脊椎動物，其氨基酸水平都具有很高的同源性.Ca2+結合到CaM的部位受體系中Ca2+濃度調(diào)控，每個球形末端對Ca2+的親和性是不同的，其中一個位點親和性較高，而另一個親和性則相對較低，Ca2+通常結合在親和性較低的球形末端.

α螺旋和β折疊的相互作用形成了CaM獨特的二級結構.CaM含有7個α螺旋，4個Ca2+結合位點和2個短的、反向平行的雙鏈β折疊[8].作為EF手型家族蛋白成員的CaM，具有獨特的螺旋-環(huán)-螺旋結構[9].2個相互垂直的α螺旋由一個鈣結合環(huán)連接，細胞內(nèi)的Ca2+就結合在這個結合環(huán)上(圖1)，CaM結構的穩(wěn)定性依賴于α螺旋的氫鍵和疏水鍵作用的強度.

圖1 鈣調(diào)蛋白結構

CaM的三級結構通常情況下很穩(wěn)定，對高溫、酸性條件具有良好的耐受作用，DNA酶、RNA酶對CaM的活性也不會造成嚴重的影響.研究發(fā)現(xiàn)，CaM的4個Ca2+結合位點與Ca2+/CaM復合物之間有正向的協(xié)同作用[10].Ca2+-CaM復合體具有催化活性，其原因就在于，在同一個結構域內(nèi)構象發(fā)生了變化，每個螺旋之間的相對方向改變，導致Ca2+結合結構域從閉合的構象變?yōu)榇蜷_的構象，這樣一來就形成了一個疏水口袋，進而增強了與CaM結合蛋白的親和性.有報道稱，Apo鈣調(diào)蛋白(Ca2+空載CaM)的C端結構域即使在缺少Ca2+的情況下，也具有與靶蛋白作用的能力，這與Apo鈣調(diào)素C端結構域呈半開半閉的動態(tài)平衡是分不開的.Holo鈣調(diào)蛋白(Ca2+飽和鈣調(diào)蛋白)中呈α螺旋的中央Linker通過C端結構域第一個螺旋和N端結構域最后一個螺旋連接成一個更長的螺旋，當時認為這是導致CaM呈啞鈴形狀的主要原因，而后來的研究表明，形成這種特殊構象的原因是晶體堆積造成的.CaM一個顯著性的特點就是其結構的高度靈活性，這是由于CaM不含有易于氧化的半胱氨酸和羥脯氨酸，使得肽鏈定型不受其他因素的影響，并且在溫度很高的情況下依然可以保持活性.

2 CaM的性質(zhì)

CaM普遍存在于真核生物細胞中，位于人類第14號染色體上，等電點為4.0左右，分布廣泛，為進化上高度保守的一類鈣離子受體蛋白[11]，且在已知的脊椎動物中，CaM的氨基酸水平極其相似，同源性也非常高[12](圖 2)，其理化性質(zhì)和生物學活性的相似度也很高，這對于維持多種多樣的CaM結合蛋白家族的相互作用可能是相當重要的[13].CaM是一種酸性的水溶性熱穩(wěn)定蛋白，可以在外界溫度很高的情況下仍可保持其良好的生物活性.李朝軍等[14]的研究表明，成熟期的CaM主要存在于細胞核中，并在核內(nèi)進行一系列信號應答反應.在植物中，外界環(huán)境刺激，如鹽離子濃度、高溫、低溫、干旱等非生物脅迫可以改變生物體內(nèi)Ca2+水平[15]，而細胞內(nèi)的與CaM調(diào)節(jié)有關的靶酶活性與Ca2+水平之間存在正相關.Ca2+-CaM復合物調(diào)節(jié)細胞代謝的方式主要有2種：一種是直接與靶標酶起作用，一種是通過激活Ca2+-CaM復合物相關蛋白激酶的活性，從而調(diào)節(jié)細胞代謝[16].

圖2 鈣調(diào)蛋白在不同物種中的同源序列比對

3 CaM與靶蛋白的結合

CaM本身無任何酶活性，但可以與靶蛋白相互作用并調(diào)節(jié)靶蛋白的活性[5]，而這一過程是通過與其下游的靶蛋白——鈣調(diào)素結合蛋白(calmodulin-binding proteins，CaMBPs)的作用來完成的.CaM分布于所有的真核生物中，而CaMBPs主要在神經(jīng)元細胞類型中表達[17].對CaMBPs的研究能夠幫助更好地探明Ca2+-CaM在信號轉(zhuǎn)導中發(fā)揮的作用.結合CaM的靶蛋白有很多[18](表1)，一旦CaM與靶蛋白結合后就會引起諸如細胞增殖、遷移、凋亡、自噬等反應.縱觀這些靶蛋白之間的最明顯的共同點是呈堿性，除此之外，包括序列、結構和功能上都沒有相似之處.CaM的靶蛋白通常分為3種：①動物中與CaM同系物相似的蛋白；②植物所特有的CaM靶蛋白；③具有獨立的CaM結合區(qū)域的動物同系物類似蛋白.CaM對其靶蛋白的激活機制也有3種：CaM通過與其靶蛋白的結合使靶蛋白的活性位點重組，釋放了靶蛋白的自動抑制區(qū)以及使靶蛋白二聚體化，從而激活靶蛋白[19].靶蛋白的CaM結合區(qū)表現(xiàn)極端的序列可變性，這反映了CaM調(diào)節(jié)的柔性[20]，這與CaM序列的保守性是截然相反的.CaM識別靶蛋白的機制是根據(jù)靶蛋白的類型決定的，通常情況下，CaM與其靶蛋白是通過15～30個堿基對組成的肽段將彼此連接起來，這個連接區(qū)域的肽段一般情況下都含有一個自動的抑制區(qū)，識別機制也會隨著靶蛋白的改變而變化.通過對CaMBPs氨基酸序列進行分析，將CaMBPs歸納成兩類3種CaMBD基序(motif)，包括一個不依賴于Ca2+的基序(IQ)和2個依賴于Ca2+的基序，分為1-5-10和1-8-14兩種區(qū)域模式，最前面和最后面的數(shù)字表明這2個疏水性錨的堿基位置，而中間的數(shù)字表示另一個額外的疏水性堿基的位置[5].CaM的靶蛋白在基因調(diào)控[21]、抗病性[22]、代謝、離子運輸[23]、脅迫耐受性和細胞骨架的組建[24]具有重要的作用.

表1 鈣調(diào)蛋白結合蛋白參與細胞增殖、凋亡、自噬和腫瘤相關功能的進展

4 CaM的細胞生物學功能

4.1 CaM調(diào)控細胞增殖及細胞周期

真核生物的細胞增殖過程遠比原核生物復雜得多.研究發(fā)現(xiàn)，在細胞增殖和細胞周期的過程中，CaM具有重要的調(diào)節(jié)作用.CaM在細胞中的分布并非永恒不變，會隨著細胞周期的進行而遷移.在G1期，CaM主要分布在細胞質(zhì)中，可與含肌動蛋白的微絲束組裝結合；當細胞分裂進行到S期時，發(fā)現(xiàn)CaM開始向細胞核中遷移；當分裂進行到G2期時，CaM集中在細胞核中；而在M期(分裂期),CaM主要聚集在極粒和染色體之間的半紡錘體上，說明了在不同時期，CaM在細胞中存在的位置是不同的(圖3A).有資料顯示，在G1期向S期轉(zhuǎn)變以及G2期向M期過渡過程中,CaM的濃度會增加近1倍，說明CaM是在晚G1期合成的.

影響細胞增殖的一個重要指標就是CaM水平，而激活CaM依賴性激酶所需的Ca2+閾濃度隨CaM濃度變化而變化.線性回歸方程分析表明，CaM水平與G1期長短以及進入S期細胞的百分數(shù)有直接的相關性，說明CaM濃度水平對G1期向S期過渡起關鍵作用[40].在化學致癌物、病毒以及激素誘發(fā)的轉(zhuǎn)化細胞中，G1期都大大縮短了，CaM含量提高了2～3倍[41].在動植物中,CaM所參與的周期調(diào)控有明顯的不同，說明細胞增殖在物種不同進化水平上存在顯著的差異.CaM除了可以調(diào)控胞內(nèi)細胞增殖，在胞外同樣可以促使細胞增殖.早在1988年,Crocker等首次報道了CaM在胞外可以促進人白血病淋巴細胞增殖，說明CaM不僅可以在胞內(nèi)影響細胞增殖，在胞外同樣具有促進細胞分裂的作用.

在細胞增殖的過程中，CaM只是調(diào)控機制中的一個重要環(huán)節(jié)，影響增殖不是單因素決定的，而是多種因素相互作用產(chǎn)生的結果.總而言之，CaM調(diào)控細胞增殖的特點可歸納為以下幾點：①啟動DNA合成，促進G1/S期過渡；②促進G1/M期過渡；③調(diào)控染色體的移動，并促進細胞進入有絲分裂后期(圖3B).

圖3 A.在細胞中，鈣調(diào)蛋白各個時期的分布;B.鈣調(diào)蛋白調(diào)節(jié)細胞增殖示意圖

4.2 CaM參與調(diào)控靶酶活性

同CaM的靶蛋白類似，復合體Ca2+-CaM也同樣具有結合并調(diào)控下游靶酶的功能.國內(nèi)外學者利用CaM這個特性，獲得許多與其結合的靶酶，為生命科學的發(fā)展提供了重要的資源.現(xiàn)已確定的靶酶有磷酸化酶激酶、鳥苷酸環(huán)化酶、磷脂酶A2、肌球蛋白輕鏈激酶、磷酸二酯酶、Ca2+依賴蛋白激酶、輔酶Ⅰ激酶、Ca2+-ATP酶、腺苷酸環(huán)化酶等多種酶的活性.鈣調(diào)蛋白激酶(CaMK)是一類重要的CaM靶酶，尤其是CaMKⅡ是研究最深的一類鈣調(diào)蛋白激酶.當體內(nèi)CaMKⅡ含量達到一定水平時，可導致心臟肥大、心律不齊以及房顫等癥狀[42].Ca2+-CaM復合體形成后，下游的靶酶的活力會有不同程度的增加，例如氧化物歧化酶含量可提高50%以上，乳酸脫氫酶活力可提高30%左右.在動物中，CaM在腎上腺和腦中cAMP的合成與降解的過程中扮演重要的角色；在植物中，CaM參與調(diào)節(jié)葉綠素光合作用的進行，CaM在植物體內(nèi)NAD激酶對濃度的要求極高，若低于一定濃度，NAD激酶的催化活性會被抑制或停滯.有資料顯示，Ca2+-CaM激活NAD激酶是調(diào)節(jié)光合作用的重要環(huán)節(jié).李翠鳳[43]等在研究Ca2+-CaM依賴性蛋白激酶對胰腺蛋白磷酸化時發(fā)現(xiàn)，當CaM的濃度為60 μmol/L時，Ca2+對磷酸化最大激活濃度為15 nmol/L；當體系中的Ca2+過量時，CaM磷酸化水平會有很大程度增加.Seubert[44]等的研究表明,CaM和類紅細胞血影蛋白參與神經(jīng)功能的調(diào)節(jié).

在CaM眾多的靶酶中，在細胞中起到的作用、結合與活化的部位都有不同程度差異，結合CaM的靶酶不能證明靶酶被活化，但靶酶的活化卻是CaM與靶酶結合的結果.

4.3 CaM調(diào)節(jié)微管解聚

微管(microtubule, MT)是細胞骨架的主要成分之一， 在細胞內(nèi)主要參與充當分子馬達分選、細胞內(nèi)部結構有序性的保持、 運輸細胞組分的運動軌道和細胞形態(tài)的維持[45].微管的組裝需要微管結合蛋白和Tau因子共同作用，由于依賴CaM激酶的底物而被磷酸化，導致MT的解聚.當體系中存在一定的Ca2+時，CaM就會與微管Tau因子競爭結合，微管的聚合就會被抑制，細胞的生理活動恢復正常.在體外和活細胞中，MT對冷和諾達考唑比較敏感，有MT存在的情況下，MAP6/STOP家族成員會阻止冷和諾達考唑介導的微管解聚[46]，并且MAP6蛋白的MT活性受CaM抑制[47-48].早期的研究證明[49]，利用顯微注射的方法注入CaM，可以有效地延長有絲分裂中期持續(xù)的時間，這是由于紡錘體中微管的瞬時解聚造成的；同時大量證據(jù)表明，細胞在行使有絲分裂的時候，紡錘體的裝配與去裝配能夠調(diào)控染色體向兩極移動，而在此過程中，處于中期的CaM對微管的穩(wěn)定性具有調(diào)節(jié)作用，這種調(diào)節(jié)作用是通過翻轉(zhuǎn)機制(flip-flop)來完成的.通常情況下，微管蛋白在聚合與解聚之間處于動態(tài)的隨機轉(zhuǎn)換.有研究表明，微管的解聚有助于DNA的合成，說明微管解聚與細胞增殖之間可能存在正向協(xié)同作用.

5 展 望

作為調(diào)節(jié)型的CaM,在進化上非常保守，不同物種之間的同源性也非常高，說明了CaM對細胞功能的調(diào)節(jié)發(fā)揮了重要的作用[50].除了野甘草之外(只有一個)，無論是脊椎動物還是無脊椎動物，無論是高等生物還是低等生物，編碼CaM的基因都有3個，這3個基因在不同的物種間也是高度保守的[51].利用CaM可以結合下游靶蛋白的特性，可以找到更多的相關蛋白，這對分析研究CaM的功能是一個很好的途徑.CaM對外界刺激的耐受性很強.在植物中，CaM及其相關激酶的存在可以影響植物的生長、發(fā)育等非生物脅迫，但是對植物的生長發(fā)育究竟產(chǎn)生了哪些影響，以及對下游的通路產(chǎn)生什么樣的影響，影響的方式又是怎樣的，目前還不是很清楚.現(xiàn)階段研究CaM最多的就是CaM在細胞增殖過程中的一些調(diào)控機制，包括對G1長短的調(diào)控、M期CaM集中于紡錘體的原因，此外，CaM可以調(diào)節(jié)微管解聚，但是影響微管解聚的機制與方式，卻知之甚少，還有待進一步探究.有報道稱，CaM可能參與了腫瘤機制的調(diào)節(jié)[52].在Alzheimer’s疾病中可能是重要的鈣穩(wěn)態(tài)介體[53]，在許多疾病中，CaM都充當一個重要的角色，而調(diào)控這一過程是通過一系列的信號通路來完成的[11].例如，功能缺陷的CaM可以破壞心臟重要的鈣離子信號，從而影響細胞膜通道以及誘發(fā)心律失常等病癥[54].近年來，CRISPR/CAS9基因敲入、基因敲除技術的日益成熟，以及其他生物科技的研發(fā)，這些問題會在不久的將來得到解決.隨著研究的深入，CaM越來越多的功能會被科學家們發(fā)掘，不僅推動了社會的進步與發(fā)展，對相關疾病的治療也有著同樣重要的意義.

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The structure, properties and celluar biological functions of CaM

LIQingwei1,2,ZHANGHan1,2,PANGYue1,2

(1.College of Life Science, Liaoning Normal University, Dalian 116081, China；2.Research Center of Lampetra Japonica, Liaoning Normal University, Dalian 116081, China)

Calmodulin (CaM) is a kind of universal existence in all eukaryotic cells and highly conserved calcium binding protein.The homology of amino acid is very high in different species.The protein has two approximately symmetrical globular domains each containing a pair of EF-hand motifs (the N- and C-domain) separated by a flexible linker region for a total of four Ca2+binding sites, and then CaM can bind to Ca2+to form a Ca2+-CaM complex.Actived CaM regulates cell metabolism and function of the target enzyme.Calmodulin binds a wide variety of target proteins, modulates the activity of target proteins, and activates cell apoptosis, autophagy and other cellular responses.CaM can modulate microtubule depolymerization.In addition, CaM can also affect cell proliferation and DNA synthesis and regulation of cell cycle progression.In this review, we summarize the structure, properties and cell biological function of CaM，which provides valuable information for the future research in this field.

calmodulin；microtubule depolymerization；cell proliferation；cell cycle

文后參考文獻中的文獻類型和標志代碼

2016-12-02 基金項目：國家重大基礎研究發(fā)展規(guī)劃(973)計劃資助課題(2013CB835304)；全國海洋公益資助項目(20130501);國家自然科學基金資助項目(31170353;31202020)；遼寧省高等學校杰出青年學者成長計劃資助項目(LJQ2014117)；大連市科技計劃資助項目(2013E11SF056)

李慶偉(1955-)，男，遼寧大連人，遼寧師范大學教授，博士，博士生導師.E-mail:liqw@263.net

1000-1735(2017)01-0074-09

10.11679/lsxblk2017010074

Q786

A