許海波

摘要：目的 探討肝細(xì)胞癌患者外周血CD4+CD25high Treg細(xì)胞表達(dá)頻率及其臨床意義。方法 選取28例診斷及分期明確的肝細(xì)胞癌患者及健康對(duì)照20例，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血CD4+CD25high Treg細(xì)胞表達(dá)頻率，并進(jìn)項(xiàng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果 肝細(xì)胞癌患者Treg細(xì)胞比例顯著高于健康對(duì)照組[（4.91±2.37）% vs （1.62±0.73）%，P<0.05]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。且其隨肝細(xì)胞癌進(jìn)展不斷增加，III期患者顯著高于I和II期患者，且均高于健康對(duì)照組，組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 肝細(xì)胞癌患者CD4+CD25high Treg細(xì)胞表達(dá)頻率顯著升高且與臨床分期相關(guān)，提示Treg可能參與肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展。

關(guān)鍵詞：肝細(xì)胞癌；調(diào)節(jié)性T細(xì)胞；表達(dá)

Abstract：Objective To investigate the clinical significance of the expression of CD4+CD25high and the frequency of Treg cells in peripheral blood of hepatocellular carcinoma patients. Methods 28 cases of diagnosis and staging of hepatocellular carcinoma patients and healthy control group in 20 cases，the frequency of peripheral blood CD4+CD25high expression of Treg cells were detected by flow cytometry，and the input statistics analysis. Results The proportion of liver cells cancer cells in patients with Treg was significantly higher than that in healthy control group[（4.91±2.37）% vs （1.62± 0.73）%，P<0.05]，the difference was statistically significant.With the increasing development of hepatocellular carcinoma，III patients was significantly higher than that in patients with I and II，and were higher than the healthy control group，the differences between groups were statistical significance （P<0.05）. Conclusion The expression frequency of CD4+CD25high Treg cells in hepatocellular carcinoma was significantly increased and correlated with clinical stage，suggesting that Treg may be involved in the occurrence and development of hepatocellular carcinoma

Key words：Hepatocellular carcinoma；Regulatory T cells；Clinical phase

肝細(xì)胞癌是全球主要健康問題之一，平均每年有超過60萬(wàn)患者死于此病[1]。越來越多的證據(jù)顯示腫瘤與免疫功能紊亂間的密切關(guān)系，在肝細(xì)胞癌中常見的腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞表明腫瘤觸發(fā)了免疫反應(yīng)。既往研究已經(jīng)證實(shí)腫瘤微環(huán)境中不同T淋巴細(xì)胞亞群扮演不同的作用[2]。CD4+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）可通過抑制效應(yīng)T細(xì)胞進(jìn)而負(fù)性調(diào)控抗腫瘤免疫[3]。類似腫瘤相關(guān)免疫反應(yīng)也在肝細(xì)胞癌微環(huán)境中存在，提示為肝細(xì)胞癌開發(fā)免疫療法具有理論基礎(chǔ)。肝細(xì)胞癌常規(guī)療法并不能徹底治愈，因?yàn)橛?0%以上患者會(huì)在3年內(nèi)復(fù)發(fā)?；谝陨显?，開發(fā)可通過誘導(dǎo)或增強(qiáng)現(xiàn)有腫瘤特異性免疫反應(yīng)而為患者提供更加有效且靶向腫瘤細(xì)胞的免疫療法顯得尤為迫切。而明確不同種類免疫細(xì)胞在肝細(xì)胞癌患者中的具體作用可能為新的免疫療法制定提供有效線索。Treg細(xì)胞可通過誘導(dǎo)細(xì)胞-細(xì)胞間聯(lián)系、TGF-β及IL-10等免疫抑制細(xì)胞因子分泌等多途徑抑制CD4+和CD8+ T細(xì)胞反應(yīng)，其在乙肝患者中的作用已經(jīng)獲得證實(shí)[4]，但關(guān)于其在與乙肝密切相關(guān)的肝細(xì)胞癌患者中的表達(dá)情況研究較少。據(jù)此，本研究主要探究肝細(xì)胞癌患者中Treg細(xì)胞表達(dá)頻率及臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2014年10月～2016年2月于本院肝病科就診且確診為肝細(xì)胞癌的患者28例，平均（59.26±16.69）歲，其中男16例，女12例；其中I期10例，II期11例，III期7例。所有患者診斷及分期依據(jù)中國(guó)抗癌協(xié)會(huì)制定的原發(fā)性肝細(xì)胞癌診斷及分期標(biāo)準(zhǔn)[5]。同時(shí)選取同期健康體檢者20例作為對(duì)照組，平均（58.33±13.21）歲，男12例，女8例。肝細(xì)胞癌患者組和對(duì)照組間一般資料均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。

1.2標(biāo)本采集及測(cè)定 抽取體檢者體檢當(dāng)日及肝細(xì)胞癌患者入院確診后且未進(jìn)行治療時(shí)清晨空腹靜脈血于EDTA抗凝管中，用于測(cè)定Treg細(xì)胞比例，所有測(cè)試均在采血后2 h內(nèi)完成。

1.3主要試劑及儀器 CD45-PC7、CD4-FITC、CD25-PC5單抗購(gòu)自ebioscience公司；FC500流式細(xì)胞儀（美國(guó)Beckman公司）。

1.4流式細(xì)胞檢測(cè)CD4+CD25high Treg細(xì)胞比例 取肝細(xì)胞癌患者和健康對(duì)照者EDTA抗凝靜脈血50 μL于流式檢測(cè)管底，加入CD4和CD25抗體各20 μL室溫避光孵育20 min，加800 μL紅細(xì)胞裂解液混勻，室溫避光15 min，離心去上清；用PBS 洗2次去上清，加500 μL PBS重懸上機(jī)，根據(jù)CD45和SSC圈定淋巴細(xì)胞群，再對(duì)CD4+ T淋巴細(xì)胞進(jìn)行設(shè)門，圈定CD4+CD25high Treg細(xì)胞群，同時(shí)設(shè)置同型對(duì)照，數(shù)據(jù)收集及分析采用 CXP Cytometer處理。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 以SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）形式表示，組間Treg細(xì)胞平均水平比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05視為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1肝細(xì)胞癌患者外周血Treg細(xì)胞比例 分析肝細(xì)胞癌和健康對(duì)照者外周CD4+CD25high Treg細(xì)胞比例，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞癌患者Treg細(xì)胞比例顯著高于健康對(duì)照組[（4.91±2.37）% vs （1.62±0.73）%，P<0.05]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2肝細(xì)胞癌患者外周血Treg細(xì)胞比例與臨床分期間的關(guān)系

進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)Treg細(xì)胞隨肝細(xì)胞癌進(jìn)展比例不斷增加，III期患者顯著高于I和II期患者，且均高于健康對(duì)照組，組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

3 討論

免疫平衡紊亂與腫瘤的發(fā)生發(fā)展間存在密切關(guān)聯(lián)，腫瘤發(fā)生是腫瘤細(xì)胞免疫逃逸的結(jié)果，而免疫效應(yīng)細(xì)胞在此過程扮演重要角色，近年來大量研究證實(shí)Treg與腫瘤免疫監(jiān)視及促進(jìn)腫瘤發(fā)生進(jìn)展密切相關(guān)。CD4+CD25high Treg細(xì)胞是維持免疫耐受的重要因素之一，其主要功能即限制T細(xì)胞的活化，調(diào)控免疫反應(yīng)，進(jìn)而保護(hù)機(jī)體避免自身免疫性疾病發(fā)生。目前已經(jīng)證實(shí)Treg細(xì)胞介導(dǎo)的免疫逃逸是腫瘤免疫中至關(guān)重要環(huán)節(jié)，其也是抗腫瘤治療失敗的主要原因之一。Treg細(xì)胞可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移[6]。

本研究通過對(duì)肝細(xì)胞癌患者及健康對(duì)照體內(nèi)Treg細(xì)胞比例測(cè)定發(fā)現(xiàn)癌癥患者外周CD4+CD25high Treg細(xì)胞比例顯著高于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞比例與臨床分期相關(guān)，隨著肝細(xì)胞癌臨床進(jìn)展不斷增加。

以上研究結(jié)果提示肝細(xì)胞癌患者CD4+CD25high Treg細(xì)胞比率明顯高于健康組，說明肝細(xì)胞癌患者Treg升高，機(jī)體細(xì)胞免疫功能受到抑制，可能與CD4+CD25high Treg細(xì)胞的免疫抑制作用導(dǎo)致肝細(xì)胞癌患者抗腫瘤免疫應(yīng)答受到抑制有關(guān)，使機(jī)體無法對(duì)現(xiàn)有腫瘤細(xì)胞進(jìn)行有效清除。

參考文獻(xiàn)：

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編輯/羅茗柯