劉 震，徐 風(fēng)，王靜哲，劉廣學(xué)，尚明英，蔡少青（北京大學(xué)藥學(xué)院，北京 100191）

·實(shí)驗(yàn)研究·

哈巴苷在大鼠體內(nèi)代謝產(chǎn)物的鑒定與分析Δ

劉 震＊，徐 風(fēng)，王靜哲，劉廣學(xué)，尚明英#，蔡少青（北京大學(xué)藥學(xué)院，北京 100191）

目的：研究玄參活性成分哈巴苷在大鼠體內(nèi)的代謝產(chǎn)物及其分布、代謝類(lèi)型和其可能的活性。方法：4只SD大鼠隨機(jī)分為空白組（超純水）和給藥組（哈巴苷對(duì)照品溶液），每組2只，ig給藥，160 mg/kg，每日2次，連用3 d。于給藥前及首次給藥后每12 h收集各組大鼠尿液和糞便，最后1次給藥后0.5、1 h穿心取血8 mL并取出心、肝、脾、肺、腎、胃和小腸等組織，分別制備血液、尿液、糞便及各組織樣品溶液。采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法檢測(cè)和鑒定哈巴苷在大鼠體內(nèi)的代謝產(chǎn)物并推測(cè)其代謝途徑，采用Pharm Mapper軟件預(yù)測(cè)代謝產(chǎn)物活性。結(jié)果：從大鼠體內(nèi)鑒定出哈巴苷代謝產(chǎn)物12種，其原型及代謝產(chǎn)物主要分布在心、肝、脾、肺、腎、胃和小腸中，其代謝類(lèi)型主要包括水解、脫水、還原、甲基化、硫酸酯化、葡萄糖醛酸結(jié)合、一級(jí)香豆酸結(jié)合等。12種化合物可能具有治療癲癇、肌萎縮側(cè)索硬化、糖尿病、腦中風(fēng)等活性。結(jié)論：哈巴苷可能是以原型和代謝產(chǎn)物的形式發(fā)揮藥效的。本研究為歸屬玄參體內(nèi)代謝產(chǎn)物來(lái)源、研究玄參顯效形式、闡明玄參藥理作用機(jī)制和炮制機(jī)制提供了依據(jù)。

玄參；哈巴苷；液質(zhì)聯(lián)用；代謝產(chǎn)物；代謝途徑；活性

玄參為我國(guó)傳統(tǒng)常用中藥材，為玄參科植物玄參Scrophularia ningpoensis Hemsl.的干燥根，具有清熱涼血、滋陰降火、解毒散結(jié)之功效[1]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，玄參具有抗炎[2]、免疫調(diào)節(jié)[3]、神經(jīng)保護(hù)[4]和抗腦缺血等活性[5]。環(huán)烯醚萜類(lèi)化合物為玄參中重要的化學(xué)成分類(lèi)型，其中哈巴苷是玄參主要的環(huán)烯醚萜苷類(lèi)成分之一。大量研究表明，哈巴苷的藥理活性與玄參傳統(tǒng)功效相關(guān)，哈巴苷可促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞-刀豆蛋白A誘導(dǎo)的增殖反應(yīng)[6]，具有神經(jīng)保護(hù)作用[7]和抑制血小板凝聚作用[8]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，傳統(tǒng)的產(chǎn)地加工和炮制手段可降低玄參中的哈巴俄苷含量[9]，升高哈巴苷含量[10]。2015年版《中國(guó)藥典》（一部）規(guī)定玄參中哈巴俄苷和哈巴苷的總含量不得少于0.45%[1]。因此，進(jìn)行哈巴苷的體內(nèi)代謝研究有助于闡明其代謝產(chǎn)物及其分布、代謝途徑以及代謝產(chǎn)物可能的活性，揭示其體內(nèi)存在形式和發(fā)揮藥效的機(jī)制，為歸屬玄參體內(nèi)代謝產(chǎn)物來(lái)源、闡明藥理作用機(jī)制和炮制機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

高效液相色譜-離子阱-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用（HPLCESI-IT-TOF-MS）儀，包含2個(gè)LC-20AD輸液泵、1個(gè)LC-20AB輸液泵、CBM-20A系統(tǒng)控制器、脫氣單元DGU-20A3、可制冷自動(dòng)進(jìn)樣器SIL-20AC、柱溫箱CTO-20A、二極管陣列檢測(cè)器SPD-M20A、ESI離子源、ESIIT-TOF-MS系統(tǒng)（日本Shimadzu公司）；BP211D十萬(wàn)分之一電子天平（德國(guó)Sartorius公司）。

1.2 藥材與試劑

哈巴苷對(duì)照品（成都曼思特生物科技有限公司，批號(hào)：15031605，純度：＞98.00%）；甲醇、乙腈均為色譜純；水為超純水。

1.3 動(dòng)物

清潔級(jí)SD大鼠4只，♂，體質(zhì)量200～250 g，購(gòu)于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物科學(xué)部，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（京）11-00-0006。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均得到北京大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的許可，倫理審查許可證號(hào)：LA2015-007。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與質(zhì)譜條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Kromasil 100-5 C18（250 mm× 4.6 mm，5 μm）；保護(hù)柱：Zorbax SBC18；流動(dòng)相：純水（A）-乙腈（B），梯度洗脫（洗脫程序：0～10 min，1%B；10～15 min，1%～2%B；15～20 min，2%～3.5%B；20～25 min，3.5%B；25～35 min，3.5%～6.5%B；35～40 min，6.5%B；40～48 min，6.5%～9%B；48～60 min，9%～11.5%B；60～70 min，11.5%B；70～75 min，11.5%～40.5%B；75～81 min，40.5%B；81～95 min，40.5%～100%B；95～105 min，100%B）；柱溫：35℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；進(jìn)樣量：10 μL；流速：1 mL/min。

2.1.2 質(zhì)譜條件 檢測(cè)范圍：MS1～MS3m/z 100～1 000；離子累積時(shí)間：30 ms；N2流速：1.5 L/min；曲型脫溶劑裝置溫度：200℃；檢測(cè)壓力：1.7 kV；干燥器電壓：98.0 kV；最大壓力：30 MPa；檢測(cè)模式：負(fù)離子切換檢測(cè)。

2.2 哈巴苷對(duì)照品溶液的制備

稱(chēng)取哈巴苷對(duì)照品適量，用超純水溶解，制成質(zhì)量濃度為40 mg/mL的哈巴苷對(duì)照品溶液，備用。

2.3 分組與給藥

4只SD大鼠隨機(jī)分為空白組和給藥組（“2.2”項(xiàng)下哈巴苷對(duì)照品溶液），每組2只。適應(yīng)性飼養(yǎng)6 d后，給藥組大鼠ig給藥，160 mg/kg（給藥劑量根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定），每日上午9：00、晚21：00各1次，連用3 d；空白組大鼠ig等體積超純水。給藥期間正常喂食、喂水。收集給藥組大鼠給藥前的尿液、糞便，冷藏保存于4℃冰箱，與給藥后進(jìn)行比較。

2.4 樣品的收集與處理

首次給藥后，每12 h收集1次大鼠尿液和糞便，冷藏保存于4℃冰箱。末次給藥后，分別在給藥0.5、1 h后ip水合氯醛麻醉（380 mg/kg），穿心取血8 mL。取血后迅速取出心、肝、脾、肺、腎、胃、小腸組織，以生理鹽水灌洗，于－30℃冰箱冷凍保存。

將各組大鼠血液于4℃離心（離心半徑為 20 cm，5 000 r/min）15 min，取上清液，加5倍量甲醇超聲沉淀蛋白，離心（離心半徑為20 cm，10 000 r/min）15 min，取上清液，N2吹至干，加入1/4倍量甲醇復(fù)溶，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，進(jìn)樣分析。

將各組大鼠尿液樣品濃縮，蒸干。取0.5 g尿液樣品蒸干物，加2 mL 50%甲醇復(fù)溶，即得質(zhì)量濃度為250 mg/mL的尿液樣品溶液，過(guò)0.45 μm濾膜，進(jìn)樣分析。

將各組糞便樣品于50℃烘干，研磨，取7 g研磨粉，用20倍50%甲醇于20℃超聲提取30 min，過(guò)濾后濃縮，蒸干。取0.5 g糞便樣品蒸干物，加入2 mL 50%甲醇復(fù)溶，即得質(zhì)量濃度為250 mg/mL的糞便樣品溶液，過(guò)0.45 μm濾膜，進(jìn)樣分析。

取各組大鼠內(nèi)臟組織，用生理鹽水洗凈血液并去除周?chē)窘M織，稱(chēng)取相同組織10 g，用50 mL 50%甲醇勻漿3 min，20℃超聲30 min，離心（離心半徑為20 cm，12 000 r/min）15 min，取上清液，減壓濃縮，蒸干。取0.25 g內(nèi)臟組織蒸干物，加1 mL甲醇復(fù)溶，即得質(zhì)量濃度為250 mg/mL的內(nèi)臟組織溶液，過(guò)0.45 μm濾膜，進(jìn)樣分析。

2.5 哈巴苷質(zhì)譜裂解規(guī)律

哈巴苷具有4-去甲基環(huán)烯醚萜苷的典型結(jié)構(gòu)特征，其HPLC-MS/MS裂解規(guī)律見(jiàn)圖1[11]。哈巴苷在負(fù)離子模式（NI）下會(huì)出現(xiàn)更多質(zhì)譜離子碎片信息，且在中等強(qiáng)度碰撞電壓（120 V）下，質(zhì)譜圖中易觀察到[M+HCOO]－的加合離子基峰；較高的碰撞電壓（320 V）下，易出現(xiàn)[MH]－的基峰[10]。本研究以NI信息為主進(jìn)行哈巴苷及其代謝產(chǎn)物的解析，發(fā)現(xiàn)本試驗(yàn)條件下的準(zhǔn)分子離子多為[M-H]－峰，此外還發(fā)現(xiàn)了[M+Cl]－峰。哈巴苷典型的裂解方式可概括為丟失葡萄糖與水分子形成m/z 201、183特征性碎片離子；此外，結(jié)構(gòu)中的半縮醛環(huán)易開(kāi)裂形成m/z 157、139特征碎片離子。結(jié)合上述哈巴苷質(zhì)譜裂解數(shù)據(jù)，筆者在大鼠血液、尿液、糞便和組織中都發(fā)現(xiàn)了哈巴苷，其具體裂解信息如下。

圖1 哈巴苷的裂解規(guī)律Fig 1 Cracking rule of harpagide

哈巴苷（保留時(shí)間為29.925 min），負(fù)離子一級(jí)質(zhì)譜中顯示準(zhǔn)分子離子峰[M-H]－為m/z 363.131 8，預(yù)測(cè)分子式為C15H24O10。二級(jí)質(zhì)譜碎片主要有m/z 201.076 3、183.064 6、165.063 6、157.059 2、139.042 3。其中，m/z 201.076 3為[M-H-glucosyl]－，m/z 183.064 6為[M-H-glucosyl-H2O]－，m/z 165.063 6為[M-H-glucosyl-2H2O]－，m/z 157.059 2為[M-H-glucosyl-CH3CHO]－，m/z 139.042 3為[M-H-glucosyl-CH3CHO-H2O]－。

2.6 哈巴苷代謝產(chǎn)物的分析鑒定

采用HPLC-ESI-IT-TOF-MS分析技術(shù)對(duì)“2.4”項(xiàng)下樣品在NI下進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果在NI模式下的基峰色譜（BPC）圖中，發(fā)現(xiàn)了血液中代謝產(chǎn)物1種、尿中代謝產(chǎn)物10種、糞便中代謝產(chǎn)物3種。NI模式下各組織的BPC圖見(jiàn)圖2。去除重復(fù)代謝產(chǎn)物，共鑒定出代謝產(chǎn)物12種，詳見(jiàn)表1。

圖2 NI模式下各組織的BPC圖Fig 2 Base peak chromatogram of each sample in negative ion mode

12種化合物均屬首次報(bào)道，分別為哈巴苷水解形成的哈巴苷苷元（HM1）、哈巴苷水解并與香豆酸結(jié)合產(chǎn)物（HM2）、哈巴苷脫水并與葡萄糖醛酸結(jié)合產(chǎn)物（HM3）、哈巴苷苷元脫水硫酸酯化產(chǎn)物（HM4、HM5、HM7）、哈巴苷苷元還原甲基化產(chǎn)物（HM6、HM12）、哈巴苷水解并還原產(chǎn)物（HM8）、哈巴苷水解并脫水產(chǎn)物（HM9、HM10）、哈巴苷苷元裂解并與葡萄糖醛酸結(jié)合產(chǎn)物（HM11）。

HM1在小腸、肝和糞便中檢測(cè)到，負(fù)離子一級(jí)質(zhì)譜中顯示準(zhǔn)分子離子峰[M-H]－為m/z 201.075 2，預(yù)測(cè)其分子式為C9H14O5。根據(jù)文獻(xiàn)[10]中哈巴苷的裂解規(guī)律可知，m/z 201.075 2為哈巴苷脫去葡萄糖基后形成的特征性裂解碎片離子；二級(jí)質(zhì)譜中可見(jiàn)m/z 157.135 4[M-HCH3CHO]－，與哈巴苷的特征裂解碎片離子[Harpagide-H-glucosyl-CH3CHO]－一致[11]。推測(cè)該代謝產(chǎn)物為哈巴苷脫去葡萄糖基后形成的水解產(chǎn)物哈巴素（Harpagenin），HM1既是哈巴苷的代謝產(chǎn)物，也是玄參中的原型成分[10]，作為代謝產(chǎn)物未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。

HM2為給藥大鼠尿液中檢測(cè)到的代謝產(chǎn)物，負(fù)離子一級(jí)質(zhì)譜中顯示準(zhǔn)分子離子峰[M-H]－為m/z 347.141 3，預(yù)測(cè)其分子式為C19H24O6。二級(jí)質(zhì)譜可見(jiàn)碎片離子m/z 319.155 6、201.113 6、145.120 2。其中m/z 319.155 6[MH-CO]－是準(zhǔn)分子離子峰通過(guò)丟失CO形成的碎片離子，m/z 201.113 6[M-H-cumaric acid]－為哈巴苷苷元的特征性離子，m/z 145.120 2[Cumaric acid-H-H2O]－是香豆酸的特征性碎片離子。這表明該代謝產(chǎn)物含有香豆酸和哈巴苷苷元結(jié)構(gòu)單元，且m/z 347可能為[8-O-courmaroyl harpagide-H-glucosyl]－，8-O-courmaroyl harpagide又是玄參中的化學(xué)成分[11]，根據(jù)質(zhì)譜信息并對(duì)比文獻(xiàn)[11-12]推測(cè)該化合物可能為8-O-courmaroyl harpagenin。

表1 哈巴苷在大鼠體內(nèi)的代謝產(chǎn)物液質(zhì)聯(lián)用分析結(jié)果（負(fù)離子模式下）Tab 1 Results of LC-MS analysis of harpagide metabolites in rats in vivo（negative ion mode）

HM3為給藥大鼠尿液中檢測(cè)到的代謝產(chǎn)物，負(fù)離子一級(jí)質(zhì)譜中顯示準(zhǔn)分子離子峰[M-H]－為m/z 359.095 7，預(yù)測(cè)其分子式為C15H20O10。二級(jí)質(zhì)譜中可見(jiàn)碎片離子m/z 183.064 7、175.025 4、147.045 6。其中，m/z 183.064 7為母離子中性丟失葡萄糖醛酸基（176 Da）形成的碎片離子，且與哈巴苷苷元脫水形成的碎片離子一致；m/z 175.025 4為[Glucuronicacid-H-H2O]－，m/z 147.045 6為[Glucuronic acid-H-H2O]－，均為葡萄糖醛酸的特征性碎片離子。根據(jù)哈巴苷的裂解規(guī)律[11]，哈巴苷苷元母核上C-5位上羥基更容易脫水形成穩(wěn)定的共軛結(jié)構(gòu)，確定脫水的位置在5、9位，根據(jù)上述信息結(jié)合文獻(xiàn)數(shù)據(jù)推測(cè)該代謝產(chǎn)物為哈巴苷苷元脫水后的葡萄糖醛酸化產(chǎn)物5，9-dehydration-harpagenin glucuronide。

HM4為給藥大鼠尿液中檢測(cè)到的代謝產(chǎn)物，負(fù)離子一級(jí)質(zhì)譜中顯示準(zhǔn)分子離子峰[M-H]－為m/z 263.023 5，預(yù)測(cè)其分子式為C9H12O7S。二級(jí)質(zhì)譜中可見(jiàn)m/z 183.068 0[M-H-SO3]－碎片離子，說(shuō)明該化合物可能為硫酸酯化的代謝產(chǎn)物。對(duì)比文獻(xiàn)[11]發(fā)現(xiàn)該碎片離子與哈巴苷失去葡萄糖基后再脫去1分子的水所形成的特征性結(jié)構(gòu)單元m/z 183[Harpagide-H-glucosyl-H2O]－一致，故推測(cè)該代謝產(chǎn)物為哈巴苷苷元脫水后形成的硫酸酯化產(chǎn)物5，9-dehydration-harpagenin sulfate。

HM5、HM7為給藥大鼠尿液、糞便、胃和小腸中檢測(cè)到的代謝產(chǎn)物，負(fù)離子一級(jí)質(zhì)譜中均顯示準(zhǔn)分子離子峰[M-H]－為m/z 245.01，預(yù)測(cè)其分子式均為C9H10O6S。負(fù)離子模式下，二級(jí)碎片離子均可見(jiàn)m/z 165.05[M-HSO3]－和m/z 121.07[M-H-SO3-CO2]－。對(duì)比哈巴苷的裂解規(guī)律，m/z 165.05[M-H-SO3]－與哈巴苷失去葡萄糖基后再脫去2分子水所形成的結(jié)構(gòu)單元m/z 165[Harpagide-H-glucosyl-2H2O]－一致。根據(jù)以上數(shù)據(jù)推測(cè)代謝產(chǎn)物HM5和HM7均為哈巴苷苷元脫去2分子水后的硫酸酯化產(chǎn)物，母核1位和6位均有羥基可發(fā)生硫酸酯化，但空間位阻1位羥基最小，其次為6位羥基，因此優(yōu)勢(shì)取代順序?yàn)?位羥基＞6位羥基。故推測(cè)峰面積較大的HM5為5，9-dehydration-7，8-dehydration-harpagenin sulfate，峰面積較小的HM7為5，9-dehydration-7，8-dehydration-harpagenin-6-sulfate。

HM6為給藥大鼠尿液和胃中檢測(cè)到的代謝產(chǎn)物，負(fù)離子一級(jí)質(zhì)譜中顯示準(zhǔn)分子離子峰[M-H]－為m/z 231.123 7，預(yù)測(cè)其分子式為C11H20O5。二級(jí)碎片離子可見(jiàn)m/z 187.101 7[M-H-CH3CHO]－和m/z 143.116 0[M-HCH3CHO-CO2]－。根據(jù)以上數(shù)據(jù)并結(jié)合文獻(xiàn)[12]，推測(cè)該代謝產(chǎn)物可能為Dihydrogen-6，8-O-dimethyl harpagenin。

HM8為給藥大鼠血液和小腸中檢測(cè)到的代謝產(chǎn)物，負(fù)離子一級(jí)質(zhì)譜中顯示準(zhǔn)分子離子峰[M-H]－為m/z 203.085 5，預(yù)測(cè)分子式為C9H16O5。在負(fù)離子模式的二級(jí)碎片離子可見(jiàn)m/z 159.110 5[M-H-CH3CHO]－。根據(jù)以上數(shù)據(jù)并結(jié)合文獻(xiàn)[12-13]推測(cè)該代謝產(chǎn)物為哈巴苷苷元的還原產(chǎn)物Dihydrogen-harpagenin。

HM9為給藥大鼠尿液中檢測(cè)到的代謝產(chǎn)物，負(fù)離子一級(jí)質(zhì)譜中顯示準(zhǔn)分子離子峰[M-H]－為m/z 183.066 3，預(yù)測(cè)其分子式為C9H12O4。其準(zhǔn)分子離子峰與哈巴苷脫去葡萄糖和水分子后形成的特征性裂解碎片m/z 183 [Harpagide-H-glucosyl-H2O]－一致，且二級(jí)質(zhì)譜圖中出現(xiàn)了哈巴苷苷元脫水后再失去-CH3CHO形成的碎片離子m/z 121.201 3。因此，推測(cè)該代謝產(chǎn)物為5，9-dehydration-harpagenin。

HM10為給藥大鼠尿液和胃中檢測(cè)到的代謝產(chǎn)物，負(fù)離子一級(jí)質(zhì)譜中顯示準(zhǔn)分子離子峰[M-H]－為m/z165.057 6，預(yù)測(cè)其分子式為C9H10O3。其準(zhǔn)分子離子峰與哈巴苷失去葡萄糖基后再脫去2分子水所形成m/z 165 [Harpagide-H-glucosyl-2H2O]－的碎片離子一致，且二級(jí)碎片離子可見(jiàn)m/z 147.058 4[M-H-H2O]－，哈巴苷苷元母核上C-5位的羥基更容易脫水形成穩(wěn)定的共軛結(jié)構(gòu)。綜合上述信息及文獻(xiàn)[11]推測(cè)該代謝產(chǎn)物為哈巴苷苷元的脫水產(chǎn)物5，9-dehydration-7，8-dehydration-harpagenin。

HM11為給藥大鼠尿液中檢測(cè)到的代謝產(chǎn)物，負(fù)離子一級(jí)質(zhì)譜中顯示準(zhǔn)分子離子峰[M-H]－為m/z 349.113 7，預(yù)測(cè)其分子式為C18H22O7。二級(jí)碎片離子可見(jiàn)m/z 193.036 2[Glucuronicacid-H]－、m/z 175.027 4[Glucuronic acid-H-H2O]－、m/z 173.082 2[M-H-glucuronyl]－和m/z 129.094 7[M-H-glucuronyl-CO2]－，其中m/z 173.082 2與哈巴苷苷元的碎片m/z 173[Harpagenin-H-CO]－一致，因此推測(cè)該代謝產(chǎn)物為哈巴苷苷元脫羰基后形成的1，2，4-三羥基-4-甲基-1-乙醛-環(huán)戊烷與葡萄糖醛酸生成的苷。苷元1、2、4位均有羥基可發(fā)生葡萄糖醛酸化，2位羥基空間位阻最小，因此羥基取代可能發(fā)生在2位上。根據(jù)以上數(shù)據(jù)信息推測(cè)HM11為1，2，4-trihydroxyl-4-methyl-1-acetaldehyde-cyclopentane-2-O-glucuronide。

HM12為給藥大鼠尿液、小腸和胃中檢測(cè)到的代謝產(chǎn)物，負(fù)離子一級(jí)質(zhì)譜中顯示準(zhǔn)分子離子峰[M-H]－為m/z 217.108 9，預(yù)測(cè)其分子式為C10H18O5。二級(jí)質(zhì)譜信息中可見(jiàn)m/z 199.100 0[M-H-H2O]－、m/z 186.529 7[M-HCH3O]－和m/z 157.092 3[Harpagide-H-glucose-2H2O]－。根據(jù)質(zhì)譜信息及文獻(xiàn)[12]推測(cè)該代謝產(chǎn)物可能為Dihydrogen-methyl-harpagide母離子中性丟失葡萄糖基（162 Da）形成；根據(jù)甲基取代基的空間位阻大小，甲基化最有可能發(fā)生在6位羥基。因此，推測(cè)該代謝產(chǎn)物為Dihydrogen-6-O-methylharpagenin。

2.7 哈巴苷在大鼠體內(nèi)的代謝類(lèi)型

本研究結(jié)果顯示，哈巴苷采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，從大鼠含藥尿液、血漿和糞便中共鑒定出12種哈巴苷代謝產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)哈巴苷在大鼠體內(nèi)的代謝類(lèi)型主要包括水解、脫水、還原、甲基化、硫酸酯化、葡萄糖醛酸結(jié)合、一級(jí)香豆酸結(jié)合等。根據(jù)代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及代謝反應(yīng)類(lèi)型，推測(cè)哈巴苷在大鼠體內(nèi)的代謝類(lèi)型見(jiàn)圖3。

圖3 哈巴苷在大鼠體內(nèi)可能的代謝類(lèi)型Fig 3 The possible metabolic type of harpagide in rats in vivo

2.8 哈巴苷原型及其代謝產(chǎn)物在大鼠體內(nèi)的分布

哈巴苷原型及其代謝產(chǎn)物體內(nèi)分布研究發(fā)現(xiàn)，哈巴苷原型在心、肝、脾、肺、腎、胃和小腸中均有分布；在小腸中檢測(cè)到HM1、HM5、HM7、HM8和HM12共5種代謝產(chǎn)物；在胃中檢測(cè)到HM5、HM6、HM7、HM10和HM12共5種代謝產(chǎn)物；在肝臟中檢測(cè)到HM1。推測(cè)哈巴苷主要分布于胃、小腸和肝。

2.9 哈巴苷在大鼠體內(nèi)代謝產(chǎn)物的活性預(yù)測(cè)

采用藥物活性預(yù)測(cè)軟件“Pharm Mapper”，對(duì)12種代謝產(chǎn)物進(jìn)行活性預(yù)測(cè)分析。結(jié)果，多種代謝產(chǎn)物顯示多種不同的潛在活性，且不同代謝產(chǎn)物可能具有相同的潛在靶點(diǎn)和潛在活性。HM1、HM3、HM9可能具有治療癲癇的相關(guān)活性；HM1、HM6、HM9、HM12可能具有治療肌萎縮側(cè)索硬化（ALS）的相關(guān)活性；HM2、HM3、HM10可能具有治療糖尿病的相關(guān)活性；HM5和HM8可能具有治療腦中風(fēng)的相關(guān)活性等。這些代謝產(chǎn)物活性與哈巴苷的免疫調(diào)節(jié)作用和神經(jīng)保護(hù)作用[6，8]，以及玄參的免疫調(diào)節(jié)、神經(jīng)保護(hù)和調(diào)節(jié)血糖作用[3，14-15]有一定的相關(guān)性。哈巴苷代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)多相似，結(jié)構(gòu)相似的代謝產(chǎn)物也預(yù)測(cè)出其具有相同的作用靶點(diǎn)，如HM1和HM9，HM6和HM12，這與徐風(fēng)等[16]提出的多成分單靶點(diǎn)的中藥顯效形式新理論一致。哈巴苷代謝產(chǎn)物的主要活性預(yù)測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 哈巴苷在大鼠體內(nèi)代謝產(chǎn)物的生物活性預(yù)測(cè)結(jié)果Tab 2 Prediction results of biological activity of harpagide metabolites in rats in vivo

3 討論

環(huán)烯醚萜類(lèi)成分的苷元結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定，因此哈巴苷在進(jìn)入體內(nèi)后通過(guò)各種代謝途徑，產(chǎn)生了結(jié)構(gòu)相似的代謝產(chǎn)物。經(jīng)過(guò)活性預(yù)測(cè)，哈巴苷的多種代謝產(chǎn)物具有治療癲癇、ALS、糖尿病和腦中風(fēng)等疾病的潛在活性。這些代謝產(chǎn)物的潛在活性與哈巴苷的免疫調(diào)節(jié)作用和神經(jīng)保護(hù)作用[6，8]以及玄參的免疫調(diào)節(jié)、神經(jīng)保護(hù)和血糖調(diào)節(jié)作用有一定的相關(guān)性[3-4，15]。這說(shuō)明采用PharmMapper軟件預(yù)測(cè)代謝產(chǎn)物的生物活性具有一定參考價(jià)值。文獻(xiàn)報(bào)道傳統(tǒng)的產(chǎn)地加工炮制方法可使玄參中哈巴苷含量升高[9-10]。王靜哲等[10]也發(fā)現(xiàn)，炮制玄參中哈巴苷含量為烘干玄參的124%。哈巴苷體內(nèi)代謝研究有助于揭示玄參炮制機(jī)制，哈巴苷與其代謝產(chǎn)物可能為玄參發(fā)揮藥效的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。通過(guò)本研究發(fā)現(xiàn)的12種哈巴苷代謝產(chǎn)物及其可能代謝途徑，為玄參“歸胃經(jīng)”、歸屬玄參在大鼠體內(nèi)代謝產(chǎn)物的原型成分來(lái)源提供了重要依據(jù)，有助于揭示哈巴苷的體內(nèi)顯效形式及其作用機(jī)制。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部[S].2015年版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：117.

[2] Qian J，Hunkler D，Safayhi H，et al.New iridoid-related constituents and the anti-inflammatory activity of Scrophularia ningpoensis[J].Planta Med，1991，57（S2）：56.

[3] Benito P，Lanza A，Sen A，et al.Effects of some iridoids from plant origin on arachidonic acid metabolism in cellular systems[J].Planta Med，2000，66（4）：324-328.

[4] Sohn S，Ko E，Jeon S，et al.The genome-wide expression profile of Scrophularia ningpoensis-treated thapsigarginstimulated U-87MG cells[J].Neuro Toxicology，2009，30（3）：368-376.

[5] Huang Q，Gong Q，Yao M，et al.Protective effect of Scrophularia ningpoensis extracts on cerebral ischemia injury in rats[J].Chin J New Drugs Clin Ren，2004，23（6）：323-327.

[6] 王建華，謝麗華，錢(qián)瑞琴，等.玄參中哈巴苷和哈巴俄苷滋陰作用的藥理研究[EB/OL].（2001-07-01）[2016-03-21].http：//kns.cnki.net/KCMS/detail/detail.

[7] 應(yīng)夏麗，鐘曉明，徐慕蝶，等.哈巴苷對(duì)急性腦缺血小鼠神經(jīng)保護(hù)作用及線(xiàn)粒體保護(hù)機(jī)制的研究[J].中國(guó)藥學(xué)雜志，2015，50（20）：1026-1031.

[8] 李醫(yī)明，曾華武.玄參中環(huán)烯醚萜苷和苯丙素苷對(duì)LTB4產(chǎn)生及血小板聚集的影響[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，20（5）：301-303.

[9] 白云娥，袁鵬飛，王慶輝，等.HPLC-UV波長(zhǎng)轉(zhuǎn)換法測(cè)定玄參藥材及飲片中哈巴苷與哈巴俄苷的含量[J].中國(guó)中藥雜志，2011，36（19）：2697-2702.

[10]王靜哲，劉震，馬立滿(mǎn)，等.基于UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)分析加工炮制對(duì)玄參化學(xué)成分的影響[J].質(zhì)譜學(xué)報(bào)，2016，37（1）：1-9.

[11] Wu Q，Yuan Q，Liu E，et al.Fragmentation study of iridoid glycosides and phenylpropanoid glycosides in Radix Scrophulariae by rapid resolution liquid chromatography with diode-array detection and electrospray ionization time-of-flight mass spectrometry[J].Bio Chrom，2010，24（8）：808-819.

[12] 王靜哲.炮制對(duì)玄參化學(xué)成分的影響及其體內(nèi)代謝研究[D].北京：北京大學(xué)，2015.

[13] Yosioka I，Sugawara T，Yoshikawa K，et al.Soil bacterial hydrolysis leading to genuine aglycone.Ⅶ.Monoterpenoid glucosides of Scrophularia buergeriana MIQ.and Paeonia albiflora[J].Chemical&Pharmaceutical Bulletin，1972，111（20）：2450-2453.

[14] 杜曉煌，方勇飛，李莉，等.玄參主要成分生物活性研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥房，2015，26（15）：2158-2160.

[15] 王浴生.中藥藥理與應(yīng)用[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1983：370.

[16] 徐風(fēng)，楊東輝，尚明英，等.中藥藥效物質(zhì)的“顯效形式”、“疊加作用”和“毒性分散效應(yīng)”：由中藥體內(nèi)代謝研究引發(fā)的思考[J].世界科學(xué)技術(shù)：中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2014，16（4）：688-703.

Identification and Analysis of Harpagide Metabolites in Rats in vivo

LIU Zhen，XU Feng，WANG Jingzhe，LIU Guangxue，SHANG Mingying，CAI Shaoqing（School of Pharmaceutical Sciences，Peking University，Beijing 100191，China）

OBJECTIVE：To study the metabolites，distribution，metabolic type and the possible activity of harpagide which is the active component from Scrophularia ningpoensis in rats in vivo.METHODS：4 SD rats were divided into blank group（ultrapure water）and administration group（harpagide reference solution），2 in each group，ig，160 mg/kg，twice a day，for 3 d.Urine and feces were collected every 12 h before administration and the first administration；sample blood 8 mL was taken after 0.5，1 hof last administration；heart，liver，spleen，lung，kidney，stomach and small intestine were taken.The blood，urine，feces and other tissue solutions were prepared，HPLC-MS was conducted to detect and identify the harpagide metabolites in rats in vivo and presume metabolic pathways，and PharmMapper software was used to predict metabolites activity.RESULTS：12 harpagide metabolites were identified in rats in vivo，the form of prototypes and metabolites were distributed in heart，liver，spleen，lung，kidney，stomach and small intestine.The metabolic type mainly included hydrolysis，dehydration，reduction，methylation，sulfation，glucuronic acid binding，grade A coumaric acid binding，etc.The 12 compounds may have activities in the treatment of epilepsy，amyotrophic lateral sclerosis，diabetes，stroke，etc.CONCLUSIONS：Harpagide may be effective in the form of prototypes and metabolites.The study has provided basis for attributing the origins of metabolite，studying the effective form of S.ningpoensis clarifying its pharmacological mechanism and processing mechanism.

Scrophularia ningpoensis；Harpagide；LC-MS；Metabolite；Metabolic pathway；Activity

R931.6

A

1001-0408（2017）10-1310-06

2016-05-28

2017-01-09）

（編輯：劉明偉）

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.81274074）

＊碩士研究生。研究方向：中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)。電話(huà)：010-82802535。E-mail：386436070@qq.com

#通信作者：副教授，博士。研究方向：中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)。電話(huà)：010-82802535。E-mail：myshang@bjmu.edu.cn

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.10.04