劉黎明 胡東輝 張建軍

(湖北中醫(yī)藥大學(xué)，湖北 武漢 430065)

抗纖軟肝膠囊對大鼠肝纖維化肝星狀細(xì)胞活化及凋亡的影響

劉黎明 胡東輝1張建軍1

(湖北中醫(yī)藥大學(xué)，湖北 武漢 430065)

目的 探討抗纖軟肝膠囊對大鼠肝纖維化肝星狀細(xì)胞(HSC)活化及凋亡的影響。方法 將32只清潔級SD大鼠采用隨機數(shù)字表法分為正常對照組和肝纖維化建模組各16只。建模組大鼠皮下注射四氯化碳(CCl4)誘導(dǎo)大鼠肝纖維化，正常對照組以同樣方法注射等量植物油，隨后將正常對照組隨機分為正常組8只，藥物組8只，建模組隨機分為模型組8只，治療組8只。藥物組、治療組均給予抗纖軟肝膠囊治療，其他組同期灌服相當(dāng)量的生理鹽水。應(yīng)用蘇木素-伊紅(HE)染色和Masson染色觀察各組肝臟病理組織學(xué)改變；檢測各組大鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、白蛋白(ALB)、透明質(zhì)酸(HA)、層黏連蛋白(LN)、Ⅳ-C型膠原(Ⅳ-C)及Ⅲ型前膠原(PC-Ⅲ)水平；RT-PCR法或流式細(xì)胞術(shù)檢測各組血清體外對HSC-T6細(xì)胞中α平滑肌動蛋白(α-SMA)和轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1 mRNA表達以及細(xì)胞凋亡水平的影響。結(jié)果 與模型組大鼠比較，治療組大鼠肝臟的肝纖維化程度減輕；治療組血清ALT、AST、HA、LN、IV-C、PC-Ⅲ水平明顯低于模型組，而ALB水平明顯高于模型組(均P<0.05)；體外實驗發(fā)現(xiàn)藥物組及治療組α-SMA和TGF-β1 mRNA的表達水平顯著低于正常組及模型組(均P<0.05)。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，藥物組及治療組HSC-T6的凋亡水平顯著高于正常組及模型組(均P<0.05)。結(jié)論 抗纖軟肝膠囊通過參與調(diào)控HSC的活化及凋亡，可發(fā)揮對肝纖維化大鼠的治療作用。

抗纖軟肝膠囊；肝纖維化；肝星狀細(xì)胞；凋亡

肝星狀細(xì)胞(HSC)是肝纖維化的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)〔1〕。在正常狀態(tài)下，HSC處于肝竇周圍間隙中，通過釋放可溶性炎性因子和產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)來促進肝細(xì)胞間的相互作用。當(dāng)肝臟受到各種刺激因素的作用發(fā)生損傷后，HSC將被激活〔2，3〕。活化的HSC分泌更多的ECM，包括α平滑肌動蛋白(α-SMA)、膠原蛋白Ⅰ和膠原蛋白Ⅲ等；此外，HSC也分泌基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)促進ECM的降解，當(dāng)合成的ECM多于其降解，平衡受到破壞將會導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生〔4～6〕。抑制HSC的活化狀態(tài)，減少ECM的沉積被認(rèn)為是有效的逆轉(zhuǎn)肝纖維化的一個方法〔7〕。中藥抗纖軟肝膠囊對肝纖維化具有較好的治療作用，但其機制仍需進一步研究。本文通過檢測反映肝纖維化程度的血清學(xué)指標(biāo)透明質(zhì)酸(HA)、層黏連蛋白(LN)、Ⅳ-C型膠原(Ⅳ-C)、Ⅲ型前膠原(PC-Ⅲ)和血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、白蛋白(ALB)的表達水平，觀察抗纖軟肝膠囊能否逆轉(zhuǎn)四氯化碳(CCl4)誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化，并探討抗纖軟肝膠囊對HSC活化與凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑及大鼠 細(xì)胞：HSC-T6為永生化的大鼠HSC，該細(xì)胞系幾乎保留活化HSC的所有功能，α-SMA表達陽性，本文以傳代12代以內(nèi)用作實驗。試劑：RPMI-1640和胎牛血清購自美國Gibco公司；CCl4購自南京博全科技有限公司；抗纖軟肝膠囊含丹參、赤芍、川穹、柴胡、冬蟲夏草、生牡蠣、鱉甲等七味中藥，由本院自制；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Promega公司；Real Time-PCR試劑(SYBR Green Master Mix)購自南京諾唯贊生物科技有限公司；AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡雙染試劑盒購自美國BD公司；大鼠血清ALT、AST和ALB等生化指標(biāo)用貝克曼庫爾特AU5800全自動生化分析儀檢測，大鼠血清HA、LN、Ⅳ-C和 PC-Ⅲ酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購自南京安培化工科技有限公司，用Biotek ELX800酶標(biāo)儀檢測。大鼠：清潔級雄性SD大鼠32只，購自南京醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心(NMXK)，體重(185±15)g。遵循南京醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究倫理委員會的倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)開展試驗。

1.2 試驗方法 (1)建立肝纖維化模型：采用隨機數(shù)字表法分為正常對照組和肝纖維化建模組各16只，建模組大鼠皮下注射1 ml/kg 50% 的CCl4植物油溶液，注射2次/w，持續(xù)8 w，制成大鼠肝纖維化模型。正常對照組以同樣方法注射等量植物油。(2)分組：正常對照組隨機分為正常組8只，藥物組8只，建模組隨機分為模型組 8只，治療組8只。藥物組采用抗纖軟肝膠囊(包括茵陳蒿20 g，丹參30 g，鱉甲10 g，三七6 g，桃仁10 g，當(dāng)歸10 g，莪術(shù)10 g，炮山甲6 g，土鱉蟲10 g，白術(shù)10 g，薏苡仁20 g，黃芪10 g)2 g/kg溶于生理鹽水中灌服正常大鼠；治療組在造模同時給予抗纖軟肝膠囊，每次劑量為2 g/kg溶于生理鹽水中灌服，灌胃2次/w，1 ml/kg，其他組同期灌服相當(dāng)量的生理鹽水溶液。(3)病理組織學(xué)檢查：實驗進行8 w末處死各組大鼠，取肝臟組織，10%甲醛固定，行蘇木素-伊紅(HE)染色，并觀察各組肝組織的病理學(xué)改變；同時進行Masson染色(麗春紅酸性品紅液、苯胺藍液、亮綠液三色染色)觀察膠原纖維增生程度。(4)血清樣本測定：同時取下腔靜脈血液，分離血清樣本。全自動生化分析儀檢測大鼠血清中ALT、AST和ALB等生化指標(biāo)，同時ELISA法測定大鼠血清中HA、LN、Ⅳ-C和 PC-Ⅲ水平。(5)藥物血清的制備：將上述分離的各組大鼠血清同組混合，于56℃熱滅活30 min，過濾除菌，加入RPMI-1640培養(yǎng)液，配制成10%的培養(yǎng)基。然后將HSC-T6以1×105密度接種于6孔板，每組3復(fù)孔，同時用無血清的RPMI-1640饑餓培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞周期同步于G0期。 24 h后用上述4種血清繼續(xù)培養(yǎng)18 h，分別收取細(xì)胞用于提取RNA和細(xì)胞凋亡檢測。(6)Real Time-PCR法：用Trizol收取上述4組不同處理的血清培養(yǎng)的HSC-T6，用氯仿抽提法得細(xì)胞RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄得cDNA，應(yīng)用羅氏熒光定量PCR Lightcycler 480采用三步法進行定量檢測實驗，反應(yīng)條件第一步預(yù)變性95℃ 5 min，第二步循環(huán)反應(yīng)(設(shè)置40個循環(huán)數(shù))95℃ 10 s，60℃ 30 s，溶解曲線95℃ 15 s，60℃ 60 s，95℃ 15 s，統(tǒng)計結(jié)果以2-ΔΔCt表示。β-actin上游引物：ACCCACACTGTGCCCATCTAT，下游引物：AGAGTACTTGCGCTCAGGAGGA；α-SMA上游引物：CCGAGATCTCACCGACTACC，下游引物：TCCAGAGCGACATAGCACAG；TGF-β1上游引物：TGGAGCAACACGTAGAACTCTACC，下游引物：ACTGCCGGACAACTCCAGTG。(7)流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡：上述4組細(xì)胞分別用Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡雙染試劑標(biāo)記后用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0軟件進行單因素方差分析、t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠肝臟病理學(xué)改變 HE染色：正常組與藥物組肝組織結(jié)構(gòu)正常；而模型組可觀察到明顯的小葉中心壞死，顯著的脂肪變性，大量的膠原纖維沉積；治療組小葉中心壞死減輕，脂肪變性與膠原沉積相對于模型組都有顯著的改善。Masson染色：正常組與藥物組膠原纖維正常分布；而模型組Masson染色顯示有過多的膠原沉積，纖維橋和假小葉形成；治療組染色結(jié)果顯示相對于模型組沉積的膠原明顯減少。見圖1。

圖1 大鼠肝臟組織的HE染色和Masson染色(×100)

2.2 各組大鼠血清肝功能指標(biāo)的變化 4組大鼠血清肝功能指標(biāo)整體分析差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=65.351，87.430，14.888，均P=0.000)。與正常組和藥物組比較，模型組和治療組ALT和AST水平均明顯升高(均P<0.05)，而與模型組比較，治療組ALT和AST水平均明顯降低，ALB顯著增加(均P<0.05)。見表1。

組別ALT(U/L)AST(U/L)ALB(g/L)正常組40.1±10.493.6±21.228.9±2.3藥物組38.8±9.498.4±17.530.7±2.9模型組257.0±67.51)2)534.1±110.11)2)24.1±1.41)2)治療組101.3±20.21)2)3)247.0±52.31)2)3)28.2±1.02)3)

與正常組比較:1)P<0.05；與藥物組比較:2)P<0.05；與模型組比較:3)P<0.05;下表同

2.3 各組大鼠血清肝纖維化4項指標(biāo)的變化 4組血清肝纖維化4項指標(biāo)的整體分析差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=85.425，15.395，53.289，93.341，均P=0.000)。與正常組和藥物組比較，模型組和治療組血清HA、LN、Ⅳ-C和 PC-Ⅲ水平顯著增加(均P<0.05)；而與模型組比較，治療組上述指標(biāo)均顯著減少(均P<0.05)。見表2。

組別HA(ng/ml)LN(ng/ml)IV-C(μg/L)PC-III(μg/L)正常組98.9±17.197.9±13.438.1±8.790.5±18.9藥物組100.3±16.8100.2±15.040.3±6.792.7±17.3模型組278.7±40.11)2)139.8±14.01)2)98.3±16.01)2)247.7±35.11)2)治療組200.0±25.31)2)3)112.8±13.01)2)3)65.9±9.91)2)3)170.4±23.61)2)3)

2.4 抗纖軟肝膠囊對HSC-T6活化的影響 藥物組(0.71±0.11，0.56±0.12)與正常組(0.92±0.13,1.56±0.34)相比，α-SMA和TGF-β1 mRNA的表達水平明顯降低(P<0.05)，治療組(1.36±0.41,1.87±0.61)與模型組(3.25±0.87,4.22±1.15)相比表達水平也降低(P<0.05)。

2.5 抗纖軟肝膠囊對HSC-T6凋亡的影響 藥物組HSC-T6細(xì)胞早期凋亡〔(19.23±2.67)%〕和總凋亡水平〔(23.69±3.03)%〕明顯高于正常組〔(7.90±2.16)，(8.63±1.12)%〕(P<0.05)，治療組〔(12.35±1.69)%,(17.39±2.54)%〕也顯著高于模型組〔(3.44±0.56)%,(5.53±1.05)%〕(P<0.05)。

3 討 論

肝纖維化是機體對各種致病因素引起的慢性肝損傷產(chǎn)生的一種損傷修復(fù)反應(yīng)，盡管早期的肝纖維化臨床癥狀不明顯，但當(dāng)肝臟受到持續(xù)的損傷時，肝纖維化可發(fā)展成肝硬化直至原發(fā)性肝癌，可出現(xiàn)門靜脈高壓、腹水、肝性腦病和代謝功能障礙等。然而，關(guān)于肝纖維化目前卻沒有有效標(biāo)準(zhǔn)治療方案，對其治療主要從減少肝損傷方面采取干預(yù)措施，但是并不能徹底治愈肝纖維化，因此有效的抗肝纖維化藥物十分必要〔8〕。其中HSC的激活是肝纖維化過程中一個關(guān)鍵的環(huán)節(jié)，在正常肝臟中，HSC主要的功能是存儲維生素A；然而，當(dāng)肝臟受到損傷，HSC活化，從而產(chǎn)生過多的膠原沉積，最終導(dǎo)致肝纖維化。所以，誘導(dǎo)HSC凋亡可能有助于纖維化的終止〔9，10〕。因此，抑制HSC的活化過程、促進HSC的凋亡是防治肝纖維化的關(guān)鍵。

本研究結(jié)果提示抗纖軟肝膠囊可以明顯減輕甚至逆轉(zhuǎn)肝纖維化，而且抑制HSC的激活過程可能是抗纖軟肝膠囊減輕肝纖維化的一個機制。另外，由于HSC在肝纖維化過程中發(fā)揮重要的作用，因此，誘導(dǎo)活化的HSC凋亡被認(rèn)為是減輕或者降低肝纖維化的方法〔11，12〕。本文發(fā)現(xiàn)，抗纖軟肝膠囊可以促進HSC-T6的凋亡過程。因此，抗纖軟肝膠囊另一方面是通過促進HSC凋亡實現(xiàn)減輕肝纖維化的目的。肝纖維化的治療一般是作用于肝纖維化的不同過程，尤其是其中激活HSC的環(huán)節(jié)，而抗纖軟肝膠囊明顯抑制活化的HSC表達α-SMA和TGF-β1，同時促進活化的HSC凋亡，從根本上減少ECM的沉積，逆轉(zhuǎn)肝纖維化過程?？估w軟肝膠囊中的成分如丹參、冬蟲夏草、鱉甲等能促進ECM中膠原的降解，而丹參、柴胡和赤草還能起到保護肝細(xì)胞的功能、促進肝細(xì)胞的再生，從而間接阻止肝纖維化進展的作用。另外，中藥的藥材取自天然，減少了化學(xué)合成藥物的毒副作用，且中藥的治療強調(diào)“君臣佐使”，各成分之間相互制約又相互補充，協(xié)調(diào)作用，形成一股強大的藥力，臨床療效十分顯著。

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〔2016-11-07修回〕

(編輯 滕欣航)

湖北省自然科學(xué)基金(No.2016CFB638)；湖北省衛(wèi)生廳科研基金項目(No.JX5B39)

1 湖北省中山醫(yī)院肝病科

張建軍(1964-)，男，博士，主任醫(yī)師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合肝病方面的研究。

劉黎明(1981-)，男，在讀博士，主治醫(yī)師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合肝病方面的研究。

R57

A

1005-9202(2017)07-1602-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.07.015