張紅波，莫尚鵬，陳玉紅，羅維，熊英，龔甜，徐燁

(1、宜春市疾病預(yù)防控制中心，江西宜春336000；2、江西省疾病預(yù)防控制中心，江西南昌330029；3、宜春市人民醫(yī)院，江西宜春336000)

宜春市2015年麻疹病毒野病毒感染病例的快速鑒別

張紅波1，莫尚鵬1，陳玉紅1，羅維1，熊英2，龔甜2，徐燁3

(1、宜春市疾病預(yù)防控制中心，江西宜春336000；2、江西省疾病預(yù)防控制中心，江西南昌330029；3、宜春市人民醫(yī)院，江西宜春336000)

目的引進(jìn)并運(yùn)用逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性分析方法（RT-PCR-RFLP方法）快速鑒別2015年宜春市麻疹野病毒感染病例與疫苗株病毒引起的相關(guān)麻疹病例。方法運(yùn)用realtime RT-PCR對宜春市400例疑似麻疹病例咽拭子標(biāo)本進(jìn)行麻疹病毒核酸檢測，引進(jìn)RT-PCR-RFLP方法對麻疹病毒核酸檢測陽性咽拭子標(biāo)本進(jìn)行檢測是否含有AflⅡ酶切位點(diǎn)（疫苗株病毒有，野病毒沒有）鑒別疫苗相關(guān)麻疹病例。結(jié)果麻疹病毒核酸檢測陽性標(biāo)本為9例，陽性率為2. 25%；9例麻疹病毒核酸檢測陽性標(biāo)本RT-PCR-RFLP方法檢測的結(jié)果為均未能被AflⅡ酶切開，為麻疹野病毒感染。結(jié)論成功引進(jìn)和建立宜春市麻疹野病毒感染病例與疫苗株病毒引起的相關(guān)麻疹病例的RT-PCR-RFLP快速鑒別方法，并鑒別了2015年宜春市9例麻疹病例均由麻疹病毒野病毒感染引起。

麻疹野病毒；麻疹疫苗株病毒；逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；限制性片段長度多態(tài)性分析方法

麻疹是一種傳染性很強(qiáng)的呼吸道傳染病，嚴(yán)重危害兒童健康，隨著麻疹減毒活疫苗(Measles At-tinuated Live Vaccine，MV)的廣泛使用，麻疹的發(fā)病得到了有效的控制[1，2]。在廣泛使用麻疹減毒活疫苗（Measles Attenuated Live Vaccine）后，麻疹在世界大多數(shù)地區(qū)得到了成功的控制；因此，麻疹也已被世界衛(wèi)生組織（WHO）列為繼全球消滅天花和即將消滅脊髓灰質(zhì)炎之后下一個(gè)擬被消除的傳染病。加強(qiáng)適齡兒童含麻疹成分疫苗（Measlescontaining Vaccine，MCV）高水平的接種率，是實(shí)現(xiàn)消除麻疹目標(biāo)的首要措施。接種MCV后，由于疫苗本身的特性和機(jī)體個(gè)體差異的原因，會(huì)出現(xiàn)疫苗接種后反應(yīng)，如發(fā)熱、皮疹；甚至出現(xiàn)減毒活疫苗引起的疫苗相關(guān)麻疹病例（Vaccine associated Measles Case，VAMC）這些少數(shù)個(gè)體因接種MV出現(xiàn)的麻疹樣臨床反應(yīng)，這與麻疹野病毒引起的不典型麻疹病例在臨床上難以區(qū)分。為了提高本市麻疹實(shí)驗(yàn)室診斷水平，及時(shí)對本市VAMC進(jìn)行鑒別，本實(shí)驗(yàn)室引進(jìn)本省省級麻疹實(shí)驗(yàn)室建立逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性分析方法（RT-PCR-RFLP方法）[3]對本市2015年麻疹實(shí)驗(yàn)室的監(jiān)測工作發(fā)現(xiàn)的麻疹樣病例是否由麻疹野病毒感染引起的病例或由接種疫苗引起的疫苗相關(guān)麻疹病例進(jìn)行快速鑒別，現(xiàn)將研究具體情況進(jìn)行分析報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本采集根據(jù)2013年版的《全國麻疹監(jiān)測方案》[4]要求采集麻疹暴發(fā)和（或）散發(fā)疫情麻疹疑似病例咽拭子標(biāo)本，咽拭子標(biāo)本保存在3ml麻疹病毒標(biāo)本運(yùn)輸液(含5%牛血清、終濃度2000U/ml青霉素、200μg/ml鏈霉素和25U/ml制霉菌素的細(xì)胞培養(yǎng)液)中，冷藏運(yùn)送。

1.2 麻疹病毒核酸檢測

1.2.1 病毒RNA提取取病毒培養(yǎng)物200μl，采用Qiagen公司的Reansy Mini kit（Cat No：74106）提取病毒RNA，具體操作步驟參照試劑盒說明書。

1.2.2 realtime RT-PCR檢測采用ABI公司生產(chǎn)的AgPath-ID(TM)One-step RT-PCR Kit（Cat No：1005）進(jìn)行反應(yīng)體系配制，總體積為25μl，相關(guān)操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。反應(yīng)條件：46℃10min，95℃預(yù)變性10min，95℃變性15s，60℃延伸45s，（收集熒光信號），共45個(gè)循環(huán)。反應(yīng)在美國ABI熒光PCR儀7300進(jìn)行。麻疹病毒引物和探針參照文獻(xiàn)[5]，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，具體序列如表1。

表1 麻疹病毒Realtime RT-PCR引物和探針堿基序列

1.3 RT-PCR-RFLP方法鑒別VAMC

1.3.1 RT-PCR反應(yīng)體系和步驟引物為包含AflⅡ酶切位點(diǎn)（CTTAAG)的麻疹病毒H基因部分片段，上游引物：5'CTCAATCGAGCATCAGGTCA3'，下游引物：5'TACATTCCCTGGGACGTCAT3'。由上海生工合成，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為438bp。

采用QIAGEN One Step RT-PCR Kit試劑盒（Cat No：210212），進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增，反應(yīng)體系50μl，其中5×Buffer 10μl、10mmol/L dNTP 2μl、Enzyme Mix 2μl、RNA酶抑制劑（40U/μl)0.25μl、上下游引物（50μmol/L)各0.5μl、無RNA酶水29.75μl、RNA模板5μl。反應(yīng)條件：60℃1min，42℃10min，50℃30mim，95℃15min，PCR循環(huán)如下：94℃30s，50℃30s，72℃1mins，30次循環(huán)，72℃10min。

1.3.2 限制性片段長度多態(tài)性分析方法[3]取Realtime RT-PCR檢測麻疹病毒核酸陽性標(biāo)本RTPCR產(chǎn)物10μl、1μl AflⅡ酶（Takara公司Cat No：1236A）和2μl Buffer于EP管中，并設(shè)對照管：10μl PCR產(chǎn)物；陽性對照為麻疹風(fēng)疹聯(lián)合減毒活疫苗（北京天壇生物生物制品股份有限公司，Lot No：201501007）置于37℃水浴1h。將經(jīng)37℃水浴1h后的對照管和酶切管中的PCR產(chǎn)物在含溴化乙錠的1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析。

2 結(jié)果

2.1 麻疹病毒核酸檢測結(jié)果和病例特征分析

2.1.1 麻疹病毒核酸檢測結(jié)果2015年共檢測麻疹疑似病例咽拭子標(biāo)本400例，其中麻疹病毒核酸陽性標(biāo)本9例，陽性率為2.25%。

2.1.2 病例特征分析時(shí)間分布主要集中在5月、6月份、8月份和11月份。人群分布：男性6例、女性3例；年齡主要分布在小年齡組8月齡～2歲齡組（7例），最小發(fā)病年齡為8月齡，最大為23歲。麻疹疫苗免疫史：無含麻疹成分疫苗（MCV）免疫史5例，免疫史不詳1例，免疫史不詳?shù)谋壤c年齡沒有明顯相關(guān)性。

2.2 RFLP方法鑒別麻疹病毒疫苗株與野毒株結(jié)果9例麻疹病毒核酸陽性標(biāo)本PCR產(chǎn)物和對照管均為被AflⅡ酶切開，呈單一條帶，分子量438bp（見圖1、圖2），提示此9例毒株均為麻疹病毒野毒株。疫苗代表株（Shanghai-191株）被AflⅡ酶切開為2個(gè)片段（分別為287bp、151bp）。

圖1 RFLP方法鑒別麻疹病毒疫苗株與野毒株結(jié)果

3 討論

麻疹是兒童最常見的急性呼吸道傳染病之一，其傳染性很強(qiáng)，在人口密集而未普種疫苗的地區(qū)易發(fā)生流行，2～3年一次大流行。麻疹病毒通過呼吸道分泌物飛沫傳播。臨床上以發(fā)熱、上呼吸道炎癥、眼結(jié)膜炎及皮膚出現(xiàn)紅色斑丘疹和頰黏膜上有麻疹黏膜斑，疹退后遺留色素沉著伴糠麩樣脫屑為特征。常并發(fā)呼吸道疾病如中耳炎、喉-氣管炎、肺炎等，麻疹腦炎、亞急性硬化性全腦炎等嚴(yán)重并發(fā)癥。目前尚無特效藥物治療。

圖2 RFLP方法鑒別麻疹病毒疫苗株與野毒株結(jié)果

我國自1965年，開始普種麻疹減毒活疫苗后發(fā)病顯著下降。目前宜春市兒童免疫首劑接種使用麻疹風(fēng)疹聯(lián)合減毒活疫苗(Measles and rubella combinedattenuated live vaccine，MR)，復(fù)種使用麻疹流行性腮腺炎風(fēng)疹聯(lián)合減毒活疫苗。麻疹減毒活疫苗雖已證明是高免疫性、安全有效的疫苗，由于疫苗本身的特性和機(jī)體個(gè)體差異的原因，大約2%的受種者可出現(xiàn)暫時(shí)性皮疹[6]，部分會(huì)發(fā)生減毒活疫苗引起的疫苗相關(guān)麻疹病例（Vaccine associated Measles Case，VAMC）。麻疹減毒活疫苗的廣泛使用后，麻疹野病毒引起的病例會(huì)越來越少，2015年宜春市麻疹病毒核酸檢測陽性率僅為2.25%，陽性率較低，可能是因?yàn)樵谝呙鐣r(shí)代的麻疹野病毒感染臨床表現(xiàn)缺少典型性，根據(jù)《全國麻疹監(jiān)測方案》[4]采集的疑似麻疹病例可能有部分是由其它病原引起的發(fā)熱出疹性疾病，在臨床癥狀上不易鑒別。隨著麻疹減毒活疫苗使用與麻疹消除工作的進(jìn)程，疫苗株引起的麻疹樣病例也會(huì)逐漸增多。2013年，國務(wù)院《衛(wèi)生事業(yè)發(fā)展“十二五”規(guī)劃》提出了要努力實(shí)現(xiàn)消除麻疹的目標(biāo)[7]，科學(xué)、正確、及時(shí)地鑒別麻疹疫苗株病毒，對努力實(shí)現(xiàn)消除麻疹目標(biāo)是非常重要的。

本研究成功引進(jìn)江西省省級麻疹實(shí)驗(yàn)室建立的疫苗相關(guān)麻疹病例RT-PCR-RFLP快速鑒別方法，并且對2015年江西省宜春市9例疑似麻疹病例咽拭子標(biāo)本進(jìn)行鑒定，鑒定的結(jié)果為麻疹野毒株引起的麻疹病例。

通過引進(jìn)疫苗相關(guān)麻疹病例RT-PCR-RFLP快速鑒別技術(shù)，提高了本市麻疹實(shí)驗(yàn)室診斷鑒定水平，并加強(qiáng)了我市麻疹樣病例實(shí)驗(yàn)室的監(jiān)測工作的能力。運(yùn)用疫苗相關(guān)麻疹病例RT-PCRRFLP快速鑒別技術(shù)可以更加及時(shí)地指導(dǎo)我市麻疹防控工作，及時(shí)區(qū)分麻疹野病毒感染病例和麻疹疫苗株病毒引起的相關(guān)病例，為我市麻疹預(yù)防與控制工作提供科學(xué)依據(jù)。

【致謝】感謝江西省疾病預(yù)防控制中心疾病控制檢驗(yàn)所對本研究的大力支持。

[1]WHO.WHO-UNICEF joint statement on strategies to ruduce measles mortality worldwide[J].Weekly Epidemiological Record，2002(27)：224-228．

[2]彭文偉．傳染病學(xué)[M]．第6版．北京：人民衛(wèi)生出版社，2004：85-88．

[3]龔甜，熊英，周順德，等.江西省2011年麻疹病毒野毒株與疫苗株的快速鑒別[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2013，40(16)：3110-3112.

[4]中國疾病預(yù)防控制中心.全國麻疹監(jiān)測方案[S].2014.

[5]龔甜，熊英，張艷妮，等.2013年江西省麻疹/風(fēng)疹實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)絡(luò)運(yùn)轉(zhuǎn)分析[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2015，42(5)：841-843.

[6]王真行，徐冰．WHO關(guān)于麻疹疫苗的意見書[J].國外醫(yī)學(xué)：預(yù)防診斷．治療用生物制品分冊，2005，28（1）：8-12．

[7]國務(wù)院．衛(wèi)生事業(yè)發(fā)展“十二五”規(guī)劃[EB/OL]．2012-10-08．

[8]許文波．麻疹病毒的分子流行病學(xué)[J]．中國計(jì)劃免疫，2001，7(1)：54-59．

[9]周劍惠，王爽，陳超，等．中國麻疹病毒疫苗株與野毒株鑒別方法的建立[J].中國疫苗和免疫，2009，15（4）：310-315．

[10]馮燕，嚴(yán)菊英，盧亦愚，等．浙江省2005年麻疹病毒流行株基因特性分析[J]．中華流行病學(xué)雜志，2006，27（5）：406-408．

[11]馬超，蘇琪茹，郝利新，等．中國2012～2013年麻疹流行病學(xué)特征與消除麻疹進(jìn)展[J].中國疫苗和免疫，2014，20(3)：193－199．

[12]徐菲，程慧健，熊英，等．2013年江西省部分地區(qū)0～4歲兒童麻疹、風(fēng)疹、乙腦、乙肝、脊灰抗體水平調(diào)查[J].實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2016，34（5）：673-675.

[13]朱豐秀，吳中發(fā)，劉素華.贛州市738例麻疹血清抗體(IgM)檢測結(jié)果分析[J].實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2010，28(1)：91－92.

[14]龔甜，熊英，張艷妮，等.江西省2013年疑似麻疹病例病原學(xué)實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測結(jié)果分析[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2015(10)：1615-1617.

[15]周樂，黃瑤，李樂，等.2008年江蘇省揚(yáng)州市麻疹實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測結(jié)果分析[J].疾病控制，2009，24(9)：664－666.

Rapid identification of nine wild measles virus strains in 2015，Yichun City

ZHANG Hongbo，MO Shangpen，CHEN Yuhong，et al.Center for Disease Control and Prevention，Yichun Jiangxi，336000，China.

Objective To establish and apply reverse transcription polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism analysis(RT-PCR-RFLP method)for rapidly identifying wild measles virus strains and vaccine strains in Yichun City in 2015.Methods The RT-PCR assay was used to detect cases of suspected measles cases throat swab specimens for the virus nucleic acid detection.RT-PCR-RFLP was adopted to identify wild strains and vaccine strains by determining the existence of enzyme-containing AflⅡrestriction site(vaccine strains，not wild strain).Results Nine cases of positive measles virus specimens were detected，accouting for 2.25%.RT-PCR-RFLP identification result was as follows：The strain showed a single band，which means it can not be digested by AflⅡ.Conclusion A method for rapid identification of Yichun City of wild measles virus strains and vaccine strains was introduced，and identified nine cases of Yichun City in 2015 suspected measles cases caused by wild measles virus infection.

Measles wild virus；Measles vaccine strain virus；Reverse transcription-polymerase chain reaction；Restriction fragment length polymorphism

R511.1，R446.62

A

1674-1129(2017)02-0199-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.02.019

2016-07-22；

2017-03-10)

張紅波，男，1984年生，學(xué)士學(xué)位，主管技師，主要從事微生物及病毒的實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測工作

莫尚鵬，男，1977年生，學(xué)士學(xué)位，主管技師，主要從事微生物及病毒的實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測工作。E-mail：233270758@qq.com