朱邦勇 李 偉 段家俊 張 杰 韋江平 周志光 黃 耿 唐中書 陳羽建 曹 娟 甘 泉 黃寅杰

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·論著·

廣西地區(qū)梅毒螺旋體阿奇霉素耐藥基因23SrRNA流行病學(xué)研究

朱邦勇 李 偉 段家俊 張 杰 韋江平 周志光 黃 耿 唐中書 陳羽建 曹 娟 甘 泉 黃寅杰

目的： 了解廣西地區(qū)梅毒螺旋體耐阿奇霉素基因23SrRNA突變的流行狀況。方法： 采集廣西不同地區(qū)性病門診疑似早期梅毒患者300例組織液，先進行PCR檢測梅毒螺旋體DNA，陽性標本再進行巢式PCR檢測Mbo II酶切23SrRNA基因。結(jié)果： 梅毒DNA陽性215例，其中耐藥檢測有效菌株數(shù)為190株，阿奇霉素23SrRNA基因突變耐藥菌株數(shù)為173株，耐藥率91.1%(173/190)。結(jié)論：廣西地區(qū)梅毒螺旋體阿奇霉素耐藥率高。

梅毒螺旋體； 阿奇霉素； 耐藥

梅毒是由蒼白螺旋體感染引起的慢性傳染性疾病，其主要傳播途徑是通過性接觸、血液和母嬰傳播，該疾病已成為全球的公共衛(wèi)生問題。有效治療梅毒是控制其傳播的重要途徑，梅毒的一線治療藥物是青霉素，對青霉素過敏的患者，可用阿奇霉素治療梅毒，近年來隨著阿奇霉素治療梅毒耐藥病例越來越多，在使用阿奇霉素治療梅毒方面應(yīng)引起足夠的重視，本文為了解廣西地區(qū)梅毒螺旋體對阿奇霉素的耐藥中23SrRNA突變基因的情況，及時掌握本地區(qū)耐藥特點和相關(guān)因素，為今后進一步研究提供一些依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 對象 從2012年1月至2016年7月，在廣西南寧市、玉林市、柳州市和防城港市的性病門診臨床懷疑為早期梅毒患者共300例，其中男248例，女53例，年齡17～81歲，平均(37.5±15.28)歲。采集患者生殖器潰瘍、扁平濕疣、濕丘疹或黏膜斑的組織液(采集時先用無菌生理鹽水清潔皮損，再擠壓皮損表面并用鈍刀刮取組織液，避免出現(xiàn)血液)，編號并放入-40℃冰箱中冷凍后轉(zhuǎn)到廣西皮膚病防治研究所性病中心實驗室-85℃冰箱中保存待用。每個患者都需進行流行病學(xué)資料調(diào)查。

1.2 材料 PCR試劑： DNA提取試劑盒為美國Qiagen公司QIAamp?DNA mini Kit。DNA聚合酶和dDTPs為美國Promega公司GoTaq?Flexi系列產(chǎn)品。Mbo II限制性內(nèi)切酶為美國New England BioLab公司產(chǎn)品。PCR擴增引物由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成。陽性對照標本由中國疾病預(yù)防控制中心性病控制中心參比實驗室凍存的Nichols標準株，陰性對照標本為TRUST和TPPA均陰性的生殖器皰疹患者的潰瘍皮損DNA提取液。

1.3 方法 TP 23SrRNA基因擴增：采用巢式PCR方法。外側(cè)擴增23SrRNA基因約1593 bp可變區(qū)，外引物23SrRNA-F1：5’-GTACCGCAAACCGACACAG-3’和23SrRNA-R1：5’-GCGCGAACACCTCTTTTTAC-3’， 將2 μL DNA模板加入50 μL PCR反應(yīng)體系(上下游引物各0.5 μmol/L，dNTPs 0.2 μmol/L，1×Buffer，MgCl21.5 mmol/L，DNA聚合酶2 U及去離子水)。PCR反應(yīng)條件為94℃ 3 min預(yù)變性后，于95℃ 45 s，63℃ 1 min 30 s，72℃ 1 min 30 s，共40個循環(huán)，72℃延伸10 min。將反應(yīng)產(chǎn)物10 μL加入內(nèi)引物反應(yīng)體系，內(nèi)側(cè)擴增1593 bp可變區(qū)中的628 bp區(qū)域，使用內(nèi)引物23SrRNA-F2：5’-GTACCGCAAACCGACACAG-3’和23SrRNA-R2：5’-AGTCAAACCGCCCACCTAC-3’，擴增體系及條件同上。將10 μL的巢式PCR擴增產(chǎn)物和100 bp的DNA Marker注入2%瓊脂糖凝膠電泳100 V，60 min,目的片段628 bp左右。

巢式PCR擴增產(chǎn)物Mbo II酶切反應(yīng)：將50 μL酶切體系(PCR擴增產(chǎn)物10 μL，1×BSA， 1×Buffer，Mbo II限制性內(nèi)切酶5 U/μL去離子水)在隔熱式電熱恒溫培養(yǎng)箱中37℃,16 h。然后將5 μL的酶切產(chǎn)物和100 bp的DNA Marker注入3%的高分辨率瓊脂糖凝膠電泳100 V，75 min。酶切產(chǎn)物在凝膠成像電泳系統(tǒng)中進行測序分析。電泳條帶若出現(xiàn)628 bp左右的單一條帶則菌株無23SrRNA基因突變，若出現(xiàn)188 bp和440 bp雙條帶則菌株發(fā)生突變。

2 結(jié)果

2.1 阿奇霉素耐藥檢測結(jié)果 從收集的300例臨床標本中發(fā)現(xiàn)PCR檢測結(jié)果陽性標本215例，檢出率為71.7%。陽性標本中，出現(xiàn)25份經(jīng)Mbo II酶切后無目的條帶出現(xiàn)，另外發(fā)現(xiàn)23SrRNA基因突變的菌株達到173例，耐藥率達到91.1%，PCR擴增結(jié)果和Mbo II酶切反應(yīng)結(jié)果見圖1、2。

2.2 耐藥結(jié)果與相關(guān)流行病學(xué)因素的關(guān)系 男152例，耐藥率為90.1%(137/152)，女38例，耐藥率為94.7%(36/38)；年齡17～85歲，平均(37.2±13.96)歲；已婚人群109例,耐藥率為87.2%(95/109)，未婚人群81例，耐藥率為96.3%(78/81)；高中及以上學(xué)歷人群130例，耐藥率為91.5%(119/130)，初中及以下人群60例，耐藥率為90.0%(54/60);既往有性病史的72例，耐藥率為88.9%(64/72)，既往無性病史的118例，耐藥率為92.4%(109/118);有過阿奇霉素用藥情況的有75例，耐藥率95.9%(70/75)，無阿奇霉素用藥情況的有115例，耐藥率89.6%(103/115)；有過商業(yè)性行為的162例,耐藥率為91.4%(148/162)，無商業(yè)性行為的28例, 耐藥率為89.3%(25/28);合并感染HIV的患者6例，耐藥率為83.3%(5/6)，無并感染HIV的患者184例，耐藥率為91.3%(168/184)。以上各項指標的阿奇霉素耐藥率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。僅發(fā)現(xiàn)有過大環(huán)內(nèi)酯類藥物用藥情況的有158例，耐藥率93.7%，明顯高于無大環(huán)內(nèi)酯類藥物使用者的耐藥率78.1%，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

1：100 bp DNA標準參照物；2：Nichols標準株，628 bp+；3～4：臨床株，628 bp+；5：陰性對照

圖1 23SrRNA基因巢式PCR擴增產(chǎn)物電泳圖

1：100 bp DNA標準參照物；2：Nichols標準株，628 bp+(未突變)；3～4：臨床株，440 bp+，188 bp+(突變)；5：陰性對照

圖2 Mbo II酶切23SrRNA基因巢式PCR擴增產(chǎn)物電泳圖

3 討論

梅毒是世界范圍內(nèi)最常見的性傳播疾病之一。近年來，國內(nèi)梅毒的發(fā)病率不斷上升，甚至在部分人群(如男性同性戀者)中發(fā)生暴發(fā)現(xiàn)象。梅毒對人類的危害性和致病性一直備受關(guān)注，該疾病不僅可以明顯促進HIV的感染和傳播[1]，而且還可以引起嚴重的并發(fā)癥，以及由于感染的孕婦沒有得到及時治療而引起不良結(jié)局，主要包括自然流產(chǎn)、圍產(chǎn)期死亡、出生低體重(包括早熟)和新生兒梅毒(先天梅毒)等[2]。

青霉素被公認為治療梅毒最有效的藥物。然而，在梅毒的控制中青霉素治療存在一定的挑戰(zhàn)，主要包括青霉素過敏的患者無法使用青霉素治療，干預(yù)場所的就地治療和性伴治療的可行性差，以及由于需要注射而存在醫(yī)源性感染的可能。近年來，阿奇霉素在梅毒治療中的應(yīng)用愈來愈受到廣泛的重視，主要是因為：阿奇霉素口服治療(特別是單劑量治療)比較方便，可行性高和依從性好[3]；阿奇霉素治療梅毒具有與青霉素相當(dāng)?shù)寞熜4]；同時可以控制其他性傳播疾病，如衣原體感染和淋病等[5]；以及阿奇霉素治療的成本效益較高[6]。但是在英美等發(fā)達國家已經(jīng)發(fā)現(xiàn)阿奇霉素治療失敗的病例，并且發(fā)現(xiàn)對阿奇霉素耐藥的梅毒螺旋體的比例相對高，超過60%以上[7,8]， 我們從廣西部分地區(qū)收集的190例陽性標本中，研究發(fā)現(xiàn)23SrRNA基因突變的菌株比例很高，耐藥率達到91.1%。與國內(nèi)其他耐藥監(jiān)測結(jié)果基本相近，如南京耐藥率達到93.8%、上海和山東的耐藥率高達100%[9-11]。從流行病學(xué)調(diào)查了解到性別、年齡、婚姻狀況、學(xué)歷、既往性病史、行為學(xué)方面等因素對早期梅毒患者的阿奇霉素耐藥率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義；僅發(fā)現(xiàn)大環(huán)內(nèi)酯類藥物用藥情況的耐藥率93.7%，明顯高于無大環(huán)內(nèi)酯類藥物使用者的耐藥率78.1%。這可能平時常規(guī)感染性疾病使用大環(huán)內(nèi)酯類藥物比較廣泛有很大的關(guān)系，以及梅毒螺旋體在大環(huán)內(nèi)酯類藥物的選擇壓力下發(fā)生耐藥性突變[12]。因此在廣西針對梅毒患者，應(yīng)避免使用阿奇梅毒進行臨床治療和易感人群高危暴露后的預(yù)防性治療，以減少治療及預(yù)防失敗的可能。

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(收稿：2016-09-23 修回：2016-10-21)

Epidemiology of azithromycin resistant gene 23SrRNA of treponema pallidum in Guangxi

ZHUBangyong,LIWei,DUANJiajun,ZHANGJie,WEIJiangping,ZHOUZhiguang,HUANGGeng,TANGZhongshu,CHENYujian,CAOJuan,GANQuan,HUANGYinjie.

InstituteofDermatology,GuangxiAutonomousRegion,Nanning530003,ChinaCorrespondingauthor:LIWei,E-mail:lw17611981@163.com

Objective: To understand the epidemic status of azithromycin resistant gene 23SrRNA of treponema pallidum in Guangxi. Methods: The treponema pallidum DNA in interstitial fluids from 300 patients with early syphilis in different regions of Guangxi STD clinic were detected by PCR firstly, and then, the Mbo II enzyme 23SrRNA gene in positive samples were detected by nested PCR. Results: The treponema pallidum DNA in 215 patients were detected. Of these 190 strains were effective strains in resistance tests. Out of 190 strains, 173 strains were positive in Mbo II enzyme 23SrRNA gene mutation and the resistance rate of azithromycin was 91.1%. Conclusion: The resistance rate of azithromycin is high in Guangxi.

treponema pallidum; azithromycin; drug resistance

廣西醫(yī)療衛(wèi)生適宜技術(shù)研究與開發(fā)項目(編號：S201539)

廣西壯族自治區(qū)皮膚病防治研究所,南寧,530003

李偉，E-mail: lw17611981@163.com