孫貽娟，曹英，張碩，伏靜，滕彬，谷瑞環(huán)，王寧怡，孫曉溪

(復(fù)旦大學(xué)婦產(chǎn)科醫(yī)院集愛遺傳與不育診療中心，上海 200011)

·專題討論·

植入前遺傳學(xué)篩查用于幾種適應(yīng)癥的效率初探

孫貽娟，曹英，張碩，伏靜，滕彬，谷瑞環(huán)，王寧怡，孫曉溪*

(復(fù)旦大學(xué)婦產(chǎn)科醫(yī)院集愛遺傳與不育診療中心，上海 200011)

目的 探討植入前遺傳學(xué)篩查(PGS)用于染色體異常、反復(fù)種植失敗和反復(fù)自然流產(chǎn)患者的效率。 方法 回顧性研究2015年1月到2016年3月在我中心行PGS治療，共328個取卵周期和隨后進(jìn)行的263個凍胚移植周期，根據(jù)其適應(yīng)癥分為男方染色體異常(A組)、女方染色體異常(B組)、反復(fù)種植失敗(C組)和反復(fù)自然流產(chǎn)(D組)，分析4組患者的體外受精-胚胎發(fā)育情況、胚胎單核苷酸多態(tài)性(SNP)檢測分析結(jié)果和臨床結(jié)局。 結(jié)果 4組患者成熟卵母細(xì)胞(MII)率、受精率、卵裂率、D3有效胚胎率均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)；獲卵數(shù)在A組(12.93±5.73)、B組(13.17±6.65)顯著高于C組(10.48±6.07)、D組(10.76±5.47)，D組可進(jìn)行PGS活檢的胚胎數(shù)與D3有效胚胎數(shù)的比率(57.2%)顯著高于A組(51.3%)、B組(48.4%)和C組(50.0%)(P均<0.05)；正常核型胚胎比率C組(71.6%)、D組(58.7%)顯著高于A組(39.0%)、B組(33.5%)，而無可移植正常核型胚胎的周期率D組(13.5%)顯著低于A組(31.3%)、B組(33.3%)、C組(29.1%)(P均<0.05)；4組患者的妊娠率和流產(chǎn)率均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。 結(jié)論 三種適應(yīng)癥的患者實(shí)施PGS均能達(dá)到滿意的臨床妊娠率；夫婦染色體異常的患者最終獲得正常核型胚胎的幾率較低，但是有效避免了高流產(chǎn)率的風(fēng)險；反復(fù)自然流產(chǎn)的患者經(jīng)PGS篩選后胚胎移植可將流產(chǎn)率控制在較低水平(3.4%)。

植入前遺傳學(xué)篩查； 反復(fù)種植失敗； 復(fù)發(fā)性流產(chǎn)； 單核苷酸多態(tài)性； 凍融胚胎移植

(JReprodMed2017，26(4)：308-312)

胚胎植入前遺傳學(xué)篩查(PGS)是指對體外受精獲得的具有遺傳風(fēng)險或染色體非整倍風(fēng)險的胚胎，在移植入子宮腔前行染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)目的檢測，分析是否有遺傳物質(zhì)的異常，從而選擇正常胚胎進(jìn)行移植。與針對攜帶已知遺傳性疾病患者的胚胎植入前遺傳學(xué)診斷(PGD)不同，PGS用于存在高度胚胎非整倍體風(fēng)險的夫婦，以提高體外受精-胚胎移植(IVF-ET)的妊娠率，降低流產(chǎn)率。目前PGS的適應(yīng)證在國內(nèi)外尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。本文通過對染色體異常、反復(fù)種植失敗和反復(fù)自然流產(chǎn)幾類患者應(yīng)用PGS助孕的臨床結(jié)果分析，探討PGS用于這幾種適應(yīng)癥的效率。

材料與方法

一、研究對象

回顧性研究2015年1月到2016年3月在復(fù)旦大學(xué)婦產(chǎn)科醫(yī)院集愛遺傳與不育診療中心行PGS治療共328個取卵周期和隨后進(jìn)行的263個凍融胚胎移植(FET)周期。

PGS指證包括：(1)男女雙方的染色體異常，有或無自然流產(chǎn)史，經(jīng)遺傳咨詢確定可行PGS；(2)反復(fù)種植失敗3次及以上，并且排除其他因素導(dǎo)致的反復(fù)種植失?。?3)反復(fù)自然流產(chǎn)2次及以上，并排除夫婦染色體異常和其他導(dǎo)致流產(chǎn)的因素，或者流產(chǎn)史中明確胚胎異常，或有不良孕產(chǎn)史者。

所有PGS的患者都經(jīng)遺傳咨詢并給予充分知情告知。根據(jù)PGS指證將其分為男方染色體異常組(A組)、女方染色體異常組(B組)、反復(fù)種植失敗組(C組)和反復(fù)自然流產(chǎn)組(D組)。

二、方法

1.控制性超促排卵：根據(jù)患者年齡和卵巢儲備功能，采用我中心常規(guī)的GnRH-a/FSH/HMG長方案或GnRH-ant/FSH/HMG拮抗劑方案或克羅米芬/HMG微刺激方案。根據(jù)B超監(jiān)測和血清E2水平適當(dāng)調(diào)整藥物劑量，當(dāng)2個以上主導(dǎo)卵泡直徑達(dá)18 mm時給予HCG(珠海麗珠)5 000～10 000 U，34～36 h后經(jīng)陰道B超引導(dǎo)下穿刺取卵。

2.體外受精胚胎培養(yǎng)與胚胎評價：所有擬行PGS檢測的周期常規(guī)行卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)授精，授精后16～18 h觀察受精情況，選出正常受精(2PN)的合子，繼續(xù)培養(yǎng)并記錄D3胚胎發(fā)育情況，包括胚胎卵裂球數(shù)目、大小均一性和碎片程度，根據(jù)我中心常規(guī)分級方法將胚胎分為I～I(xiàn)V級[1]。胚胎數(shù)目在6細(xì)胞以上、分級在III級以上者判定為D3日可用胚胎，可用胚胎行激光透明帶打孔后繼續(xù)培養(yǎng)至D5。D5根據(jù)囊胚發(fā)育分期、內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層分級對囊胚進(jìn)行評分[2]：囊胚發(fā)育分期評分為I～V期，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)評分A～C級，滋養(yǎng)層評分A～C級。D5未發(fā)育到IV期的囊胚再繼續(xù)培養(yǎng)一天至D6再次評估，標(biāo)準(zhǔn)同D5。

3.囊胚活檢與玻璃化冷凍：選擇分期在V期以上且分級在BC、CB以上的囊胚行活檢，將活檢胚胎置于顯微操作皿中，顯微固定針固定囊胚，使孵出的細(xì)胞與囊胚“赤道面”在一個平面上，活檢針輕輕吸住孵出的滋養(yǎng)層細(xì)胞回拉，同時激光切割4～5個滋養(yǎng)層細(xì)胞，將活檢取得的細(xì)胞放入細(xì)胞裂解液待檢測。囊胚立即采用Cryotop進(jìn)行玻璃化冷凍，使用歐文公司的冷凍試劑盒(Irvine Scientific，美國)：首先將囊胚室溫下轉(zhuǎn)移至ES液中平衡7 min，然后轉(zhuǎn)移至VS液中多點(diǎn)沖洗平衡，迅速將囊胚放到Cryotop前端浸入液氮，囊胚從進(jìn)入VS液至進(jìn)入液氮的時間控制在45～60 s。

4.單核苷酸多態(tài)性(SNP)檢測：獲取的胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞應(yīng)用QIAGEN REPLI-g Single Cell Kit試劑盒(Qiagen，德國)，按照試劑盒標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行全基因組擴(kuò)增(whole-genome amplification，WGA)，簡述如下：4 μl樣品，3 μl buffer D2混勻后，65℃孵育10 min后，加入3 μl終止液；隨后每個反應(yīng)加入40 μl Master mix，使總反應(yīng)體系達(dá)到50 μl，30℃孵育8 h，65℃ 3 min后4℃保存。隨后按照Illumina Cyto-12芯片(Illumina，美國)實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行第二輪擴(kuò)增、DNA片段化、沉淀、重懸、芯片雜交、洗滌、SNP單堿基延伸、著色等，應(yīng)用Illumina iScan進(jìn)行芯片掃描，應(yīng)用Karyotype和Bluefuse Multi軟件對芯片掃描數(shù)據(jù)進(jìn)行胚胎染色體的拷貝數(shù)變異分析。通過LogR比率分析判斷胚胎染色體的拷貝數(shù)變異：當(dāng)LogR為0時，說明檢測位點(diǎn)為正?？截悢?shù)2；若升高，則說明拷貝數(shù)大于2；反之則小于2[3]。

5.囊胚復(fù)蘇與胚胎移植：PGS檢測結(jié)果正常的胚胎擇期進(jìn)行囊胚復(fù)蘇與胚胎移植。囊胚于移植當(dāng)天上午復(fù)蘇：使用歐文公司的解凍試劑盒(Irvine Scientific，美國)，將載有胚胎的Cryotop從液氮中取出，迅速將前端浸入預(yù)熱好的37℃ TS液中，胚胎自載體上自動脫落，平衡1 min后，依次移入常溫下的DS、WS1、WS2各3 min，最后放入囊胚培養(yǎng)液中，培養(yǎng)2 h后移植。

內(nèi)膜準(zhǔn)備：患者自然周期排卵后或人工周期血

清E2達(dá)到734 pmol/L、內(nèi)膜達(dá)7 mm后開始注射黃體酮，注射黃體酮第6天行凍胚復(fù)蘇移植。

6.妊娠結(jié)局確定：移植后14 d測血β-HCG，陽性者2周后B超檢查探及宮內(nèi)孕囊及胎心搏動為臨床妊娠。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料用(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)(±s)表示，組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)、方差分析，率之間比較采用χ2檢驗(yàn)；P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、患者一般情況

由于4組患者PGS指證不同，C組和D組的年齡顯著大于A、B組，C組移植失敗次數(shù)顯著高于其他3組，D組流產(chǎn)次數(shù)顯著高于其他3組(P均<0.05)(表1)。

表1 四組患者一般情況(x-±s)

注：與A、B組比較，*P<0.05；與其他3組比較，#P<0.05

二、體外受精-胚胎發(fā)育相關(guān)數(shù)據(jù)

4組患者成熟卵母細(xì)胞(MII)率、正常受精率、卵裂率、D3有效胚胎率均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)；A、B組獲卵數(shù)顯著高于其他兩組(P<0.05)，D組可進(jìn)行PGS活檢的胚胎數(shù)與D3有效胚胎的比率顯著高于其他3組(P<0.05)(表2)。

表2 四組患者體外受精胚胎發(fā)育情況[(x-±s)，%]

注：與C、D組比較，*P<0.05；與其他3組比較，#P<0.05

三、SNP檢測結(jié)果與FET結(jié)局

C、D組正常胚胎比率顯著高于其他兩組(P<0.05)；D組無正常胚胎移植的周期率顯著低于其他3組(P<0.05)；四組的妊娠率均在50%以上，流產(chǎn)率均在10%以下，組間無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)(表3)。

表3 四組患者SNP檢測結(jié)果與FET結(jié)局(n，%)

注：與A、B組對比，*P<0.05；與其他組對比，#P<0.05

討 論

近十余年，PGS在歐美發(fā)達(dá)國家的輔助生育領(lǐng)域中已大量應(yīng)用，被用于高齡女性、反復(fù)種植失敗、反復(fù)流產(chǎn)患者和嚴(yán)重男性因素的不育患者，其中高齡占總PGS數(shù)的50%左右[4]，應(yīng)用PGS選擇染色體數(shù)目正常的胚胎移植可以提高種植率和妊娠率，降低流產(chǎn)率，提高活產(chǎn)率[5]，高齡女性卵母細(xì)胞非整倍體率增加，曾被認(rèn)為是PGS的最大受益者。另外對于預(yù)后良好的女性，有研究者認(rèn)為通過PGS選擇優(yōu)質(zhì)胚胎進(jìn)行單胚胎移植可以降低醫(yī)源性多胎妊娠帶來的風(fēng)險[6]。由此PGS曾一度得到越來越廣泛的應(yīng)用，根據(jù)歐洲人類生殖與胚胎協(xié)會(ESHRE)收集的多中心數(shù)據(jù)，2006年全球57個生殖中心共進(jìn)行了3 900個PGS周期[7]。

但是關(guān)于PGS應(yīng)用指征的爭論從未停止。荷蘭學(xué)者M(jìn)astenbroek等[8]通過一個大樣本、多中心、隨機(jī) 雙盲研究，發(fā)現(xiàn)408名年齡35～41歲的IVF婦女中，取單卵裂球活檢進(jìn)行PGS反而明顯降低了活產(chǎn)率而流產(chǎn)率相似，說明PGS對于高齡婦女只是干擾了胚胎的自然選擇，對妊娠結(jié)局并無益處。另外一項(xiàng)對PGS研究的Meta分析也表明行PGS會顯著降低高齡婦女的活產(chǎn)率[9]。ESHRE的PGD組織對2010年P(guān)GS的統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，參與調(diào)查的全球62個生殖中心進(jìn)行了2 979個PGS周期，PGS的常規(guī)應(yīng)用呈下降趨勢[10]。目前認(rèn)為PGS的應(yīng)用仍然應(yīng)以治療為目的，需要篩選指證。

本中心的PGS指證包括本研究中的男女雙方染色體異常、反復(fù)種植失敗與反復(fù)自然流產(chǎn)。父母染色體異常是導(dǎo)致自發(fā)性流產(chǎn)的原因之一，其中任何一方的染色體平衡易位是最重要的原因，曾經(jīng)有過異常胚胎核型的夫婦再次妊娠發(fā)生胚胎異常的概率比前次妊娠胚胎核型正常的夫婦高[11]。本研究中將男、女染色體異?；颊叻譃閮山M分別統(tǒng)計，結(jié)果顯示兩組患者一般情況、體外受精-胚胎發(fā)育相關(guān)數(shù)據(jù)、PGS檢測結(jié)果和FET臨床結(jié)局等數(shù)據(jù)均無統(tǒng)計學(xué)差異，這部分患者是流產(chǎn)后常規(guī)檢查發(fā)現(xiàn)一方染色體異常或是由于不孕來就診篩查時發(fā)現(xiàn)染色體異常而轉(zhuǎn)入PGS周期，所以年齡低于反復(fù)種植失敗組和反復(fù)自然流產(chǎn)組的患者，而其移植失敗次數(shù)與流產(chǎn)次數(shù)并無顯著增高，體外受精-胚胎發(fā)育數(shù)據(jù)與反復(fù)種植失敗組和反復(fù)自然流產(chǎn)組及本中心非PGS周期的平均數(shù)據(jù)均無顯著差異，而正常胚胎比率顯著低于其他兩組，也說明胚胎質(zhì)量和其攜帶染色體正常與否沒有明顯關(guān)系，兩組患者都獲得50%以上的臨床妊娠率，流產(chǎn)率低于10%。

ESHRE PGD組織將反復(fù)種植失敗定義為：3次移植高質(zhì)量胚胎或者多次移植胚胎總和≥10枚，在移植5周以后B超下未探及胎囊[12]。胚胎染色體異常被認(rèn)為是IVF反復(fù)種植失敗的原因之一，而胚胎染色體異常在多大程度上影響植入前胚胎的形態(tài)目前仍然未知[13]。配子減數(shù)分裂過程中和卵母細(xì)胞受精后均可產(chǎn)生非整倍體，胚胎分裂時期產(chǎn)生的染色體異常絕大多數(shù)發(fā)生在前3次有絲分裂，產(chǎn)生嵌合體[14]。這是通過PGS選擇正常胚胎移植來改善這部分患者妊娠結(jié)局的主要理論依據(jù)[4]。Greco等[15]的研究結(jié)果表明：反復(fù)種植失敗的患者在進(jìn)行PGS篩選胚胎后獲得與非反復(fù)種植失敗的PGS周期患者相同的臨床妊娠率和著床率，而未行PGS的反復(fù)種植失敗患者的臨床妊娠率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于行PGS后的反復(fù)種植失敗患者。本研究中反復(fù)種植失敗患者體外受精-胚胎發(fā)育數(shù)據(jù)均與本中心非PGS周期的平均數(shù)據(jù)一致，正常胚胎比率顯著高于染色體異常的患者，但是無正常胚胎可移植的周期比率與染色體異?；颊呤窍嗨频模f明這部分患者中有部分反復(fù)種植失敗與胚胎異常有關(guān)。本組FET的結(jié)局也是令人滿意的，說明PGS技術(shù)對于反復(fù)種植失敗的患者是有效的。

反復(fù)自然流產(chǎn)原因復(fù)雜，在排除了子宮異常、夫婦染色體異常和免疫性因素外，仍然有大約一半的患者被定義為不明原因反復(fù)自然流產(chǎn)，而胚胎染色體的異常經(jīng)常是其原因，PGS是降低這部分患者流產(chǎn)率的有效辦法[16-17]。而Murugappan等[18]對PGS的成本-獲益分析表明：PGS與期待療法相比并不是經(jīng)濟(jì)有效的方式，IVF/PGS的活產(chǎn)率需達(dá)到91%才可與期待療法相當(dāng)。但是對于反復(fù)自然流產(chǎn)或者有過不良生育史的女性來說，再次流產(chǎn)對身心都是巨大的傷害，PGS仍然是個好的選擇。本研究中這一組患者的PGS胚胎數(shù)/D3有效胚胎數(shù)的比率顯著高于其他指證的患者，而正常胚胎比率顯著高于染色體異常組，無正常胚胎周期率顯著低于其他3組患者，說明反復(fù)流產(chǎn)患者無論從胚胎質(zhì)量還是胚胎染色體都優(yōu)于其他兩類患者，妊娠率也為最高(但由于例數(shù)較少，未見統(tǒng)計學(xué)差異)，而流產(chǎn)率也同樣控制在比較低的水平(3.4%)。

本研究結(jié)果證明，染色體異常、反復(fù)種植失敗和反復(fù)自然流產(chǎn)患者實(shí)施PGS均能達(dá)到滿意的治療效果，減少流產(chǎn)概率，減少無效移植次數(shù)，更快地成功妊娠。我們?nèi)匀恍枰M(jìn)一步明確哪些患者可以從PGS技術(shù)最大獲益，實(shí)施PGS的效率如何仍然需要更多更大樣本的研究。

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[編輯：羅宏志]

Efficiency of preimplantation genetic screening in applying to different indications

SUNYi-juan，CAOYing，ZHANGShuo，F(xiàn)UJing，TENGBin，GURui-huan，WANGNing-yi，SUNXiao-xi*

JiAiGenetics&IVFInstitute，Obstetrics&GynecologyHospital，F(xiàn)udanUniversity，Shanghai200011

Objective：To explore the efficiency of preimplantation genetic screening (PGS)in applying to the patients with chromosome abnormality，recurrent implantation failure (RIF)，and recurrent spontaneous abortion (RSA).Methods：A total of 328 PGS treatment cycles and 263 subsequent frozen embryo transfer (FET) cycles in our reproductive center from Jan. 2015 to Mar. 2016 were included in this study. The patients were divided into four groups according to different indications：group A with patients of husband’s chromosome abnormality，group B with patients of wife’s chromosome abnormality，group C with patients of RIF，and group D with patients of RSA. The basic information，the clinical outcomes including in vitro fertilization and embryo development，single nucleotide polymorphism (SNP) results and clinical outcome of FET cycles were analyzed among the four groups.Results：There were no differences in oocyte MII rate，fertilization rate，cleavage rate，usable embryo rate on Day 3 among the four groups (P>0.05). The number of oocytes retrieved in group A (12.93±5.73) or in group B (13.17±6.65) were significantly higher than that in group C (10.48±6.07) or group D (10.76±5.47). The ratio of the number of blastocysts available for PGS and the number of usable embryos on Day 3 in group D (57.2%) was significantly higher than that in group A (51.3%)，group B (48.4%) or group C (50.0%) (allP<0.05). The rates of normal karyotype embryo in group C (71.6%) and group D (58.7%) were significantly higher than that of group A (39.0%) and group B (33.5%). The rate of cycles with no normal karyotype embryos for transplantation in group D (13.5%) was significantly lower than that in group A (31.3%)，group B (33.3%) or group C (29.1%) (allP<0.05). The clinical outcomes including clinical pregnancy rate and abortion rate were not significantly different among the four groups (P>0.05).Conclusions：The patients with the three different indications can get satisfactory clinical outcomes by PGS. The couples with chromosome abnormality have lower probability to obtain normal karyotype embryos，but are effective in avoiding the risk of high abortion rate. The abortion rate of patients with RSA can be controlled at a low level (3.4%) by means of PGS technique.

Preimplantation genetic screening； Recurrent implantation failure； Recurrent spontaneous abortion； Single nucleotide polymorphism； Frozen embryo transfer

10.3969/j.issn.1004-3845.2017.04.003

2017-02-09；

2017-02-27

孫貽娟，女，山東萊蕪人，博士，副主任醫(yī)師，生殖醫(yī)學(xué)專業(yè).(*

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