蔡炳，脫穎，李宇彬，麥慶云，劉新顏，徐艷文，周燦權(quán)*

(1. 中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，廣州 510080；2. 廣東省生殖醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510080；3.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科，廣州 510080)

人卵泡壁層顆粒細(xì)胞源性非整合誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的制備

蔡炳1，2，脫穎3，李宇彬1，2，麥慶云1，2，劉新顏1，2，徐艷文1，2，周燦權(quán)1，2*

(1. 中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，廣州 510080；2. 廣東省生殖醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510080；3.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科，廣州 510080)

目的 探索將卵泡液中壁層顆粒細(xì)胞誘導(dǎo)為非整合的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPS細(xì)胞)，并檢測(cè)其顆粒細(xì)胞方向的分化能力。 方法 在取卵的操作過(guò)程中，收集廢棄的壁層顆粒細(xì)胞，在顆粒細(xì)胞培養(yǎng)至第4天時(shí)，加入iPS仙臺(tái)病毒，經(jīng)過(guò)20余天的維持，挑取iPS細(xì)胞克隆，并擴(kuò)增培養(yǎng)。對(duì)其多能基因表達(dá)情況、外源基因整合情況、自然分化能力、顆粒細(xì)胞定向分化能力進(jìn)行鑒定，并與皮膚細(xì)胞來(lái)源的iPSC系進(jìn)行平行分化能力比較。 結(jié)果 成功建立了壁層顆粒細(xì)胞來(lái)源的iPS細(xì)胞系，其通過(guò)了類(lèi)似胚胎干細(xì)胞的多能性檢測(cè)及體外三胚層的分化能力檢測(cè)，尤其在定向分化為顆粒細(xì)胞時(shí)，分化出了大量FOXL2、CYP19A1和FSHR陽(yáng)性的細(xì)胞，經(jīng)ELISA試劑盒檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)該分化細(xì)胞可以分泌AMH并且能夠?qū)⑿奂に剞D(zhuǎn)化成雌激素；且顆粒細(xì)胞源iPS系較皮膚細(xì)胞源的iPS系在顆粒細(xì)胞方向的分化效率更高。 結(jié)論 提供了一種從人顆粒細(xì)胞建立iPSC的方法，并驗(yàn)證了其顆粒細(xì)胞方向分化的優(yōu)勢(shì)。該系統(tǒng)不僅可以用于建立生殖不孕疾病的iPSC庫(kù)，還為顆粒細(xì)胞功能障礙不孕的患者提供了一種細(xì)胞治療的新思路。

非整合誘導(dǎo)多能干細(xì)胞； 壁層顆粒細(xì)胞； 分化效率

(JReprodMed2017，26(4)：313-319)

誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells，iPS細(xì)胞)技術(shù)是一種經(jīng)由過(guò)表達(dá) Oct4/Sox2/Klf4/c-Myc等重編程因子，使成體細(xì)胞發(fā)生基因重編程而獲得類(lèi)似于胚胎干細(xì)胞生物學(xué)特性的技術(shù)[1]。經(jīng)過(guò)重編程得到的iPS細(xì)胞具有和胚胎干細(xì)胞相似的形態(tài)、生長(zhǎng)特性、基因表達(dá)模式和多向分化能力。該技術(shù)避免了胚胎干細(xì)胞制備的倫理學(xué)問(wèn)題，且可以實(shí)現(xiàn)目的細(xì)胞的分化和移植，不具有免疫排斥問(wèn)題。

在iPS技術(shù)發(fā)展的領(lǐng)域繼采用Yamanaka的四基因病毒體系建立iPS細(xì)胞系之后，鑒于癌基因的介入和病毒介導(dǎo)的潛在危險(xiǎn)，人們開(kāi)始追求更為安全的制備方法，如腺病毒[2]、質(zhì)粒[3]、蛋白小分子[4-5]、人工合成的mRNA[6]等方法，上述方法可以去除外源性基因?qū)λ拗骰蚪M的影響并獲得iPS細(xì)胞系，但制備效率都很低。相較于這些非整合的制備方式，仙臺(tái)病毒法序列最終并不會(huì)殘留于基因組，安全性高，且重編程效率高，是一種非常穩(wěn)定的非整合的iPS誘導(dǎo)方法[7]。

目前已經(jīng)有不同類(lèi)型的原代細(xì)胞如皮膚細(xì)胞、上皮細(xì)胞等成功制備了iPS細(xì)胞系，對(duì)于這些不同類(lèi)型原代細(xì)胞來(lái)源的iPS細(xì)胞系分化能力的區(qū)別，目前認(rèn)為重編程后的細(xì)胞依舊攜帶了之前原代細(xì)胞的部分印記基因特點(diǎn)，即在分化時(shí)會(huì)更傾向于原代細(xì)胞類(lèi)型的方向進(jìn)行分化[8]，這也提示我們?nèi)ソ⒉煌?lèi)型原代細(xì)胞來(lái)源的iPS細(xì)胞，為未來(lái)的細(xì)胞移植治療提供更穩(wěn)定的種子細(xì)胞。

顆粒細(xì)胞在卵泡發(fā)生的過(guò)程中對(duì)卵泡的生長(zhǎng)和發(fā)育起到重要作用。它提供了卵母細(xì)胞發(fā)育必需的營(yíng)養(yǎng)成分并堆積了卵母細(xì)胞分泌的代謝產(chǎn)物，還負(fù)責(zé)了卵泡生長(zhǎng)中雌激素的合成和排卵后孕激素的分泌[9]。在輔助生殖的胚胎培養(yǎng)室中，顆粒細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)在超聲引導(dǎo)取卵手術(shù)得到的卵泡液中，但由于其并不被IVF周期所使用，故在日常操作中基本被丟棄。因此，本文擬利用人顆粒細(xì)胞結(jié)合非整合iPS的誘導(dǎo)技術(shù)，建立人卵泡壁層顆粒細(xì)胞源性非整合iPS細(xì)胞系(Granulosa cell iPSC，GC-iPSC)，并將其與皮膚成纖維細(xì)胞來(lái)源的iPS細(xì)胞(Skin fibroblast iPSC，SF-iPSC)進(jìn)行顆粒細(xì)胞方向的分化，比較其分化效率，探討該細(xì)胞系的特殊性。

材料與方法

一、材料

1.涉及的組織細(xì)胞標(biāo)本：顆粒細(xì)胞來(lái)自于本生殖中心廢棄卵泡液；非整合的仙臺(tái)病毒誘導(dǎo)的人皮膚成纖維細(xì)胞來(lái)源的SF-iPSC細(xì)胞系為本實(shí)驗(yàn)室已建立細(xì)胞系；H1胚胎干細(xì)胞來(lái)自于ATCC細(xì)胞庫(kù)(美國(guó))。

2.相關(guān)試劑：胚胎干細(xì)胞E8培養(yǎng)基(Invitrogen，美國(guó))、顆粒細(xì)胞培養(yǎng)基(Invitrogen，美國(guó))、仙臺(tái)病毒誘導(dǎo)非整合iPS細(xì)胞試劑盒(Invitrogen，美國(guó))、免疫組化染色試劑盒(Invitrogen，美國(guó))、BD胞漿蛋白流式檢測(cè)專(zhuān)用試劑盒(BD Biosciences，美國(guó))、雌激素(Cayman Chemical，美國(guó))及AMH(Beckman Coulter，美國(guó))分析試劑盒。

二、方法

1.顆粒細(xì)胞的原代制備：利用本生殖中心的撿卵操作時(shí)機(jī)械切割獲取ICSI方案女性患者的壁層顆粒細(xì)胞，細(xì)胞團(tuán)塊使用DPBS(Gibco，美國(guó))不斷清洗，使用紅細(xì)胞裂解液(BD Biosciences，美國(guó))去除紅細(xì)胞，后使用I型膠原酶處理10 min，1 500 rpm離心，種植于M199培養(yǎng)基中(含10% FBS)進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，隔2 d換液，在傳代前完成iPS誘導(dǎo)，故不進(jìn)行傳代操作。

2.仙臺(tái)病毒誘導(dǎo)的非整合人壁層顆粒細(xì)胞源iPS細(xì)胞系的建立：重編程采用CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit (Life Technologies，美國(guó))。六孔板一孔種植大約1 ×105的顆粒細(xì)胞，培養(yǎng)液為 M199(含10% FBS)；病毒感染日按照病毒說(shuō)明書(shū)計(jì)算病毒用量，加入到培養(yǎng)基中感染12 h，后換回正常培養(yǎng)液培養(yǎng)；6 d后將感染后的細(xì)胞按1.5 ×105的密度種于經(jīng)過(guò)照射的不增殖的小鼠胚胎皮膚細(xì)胞上(irMEF)，培養(yǎng)液換為胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)液[80% DMEM/F-12 (Life Technologies，美國(guó))、20% KSR(Life Technologies，美國(guó))、Glutamax (Life Technologies，美國(guó))、0.1 mM β-巰基乙醇 (Sigma，美國(guó))和1%非必需氨基酸(Life Technologies，美國(guó))]。完全重編程克隆挑至無(wú)飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系，換用E8和matirgel進(jìn)行培養(yǎng)，全程37℃、5% CO2。重編程完成后檢測(cè)細(xì)胞中仙臺(tái)病毒序列的存在情況，并對(duì)所建立的細(xì)胞系進(jìn)行iPS多能性的檢測(cè)，如Oct4、Nanog和Tra-1-60等多能性基因的表達(dá)、體內(nèi)外三胚層的分化實(shí)驗(yàn)等。

3.iPS細(xì)胞系向顆粒細(xì)胞的體外分化：iPS細(xì)胞使用機(jī)械傳代至低粘附性板，使用擬胚體(EB)培養(yǎng)液成胚體(80% DMEM/F12、20%KSR、4 ng/ml bFGF、0.1 mmol/L β-巰基乙醇和1%非必須氨基酸)培養(yǎng)2 d。隨后添加BMP4培養(yǎng)24 h，繼而添加BMP4、WNT3A、activin-A和bFGF (R&D Systems，美國(guó))維持3 d，后轉(zhuǎn)入明膠包被的孔板貼壁培養(yǎng)，培養(yǎng)基中加入BMP4、bFGF和follistatin(R&D Systems，美國(guó))再維持6 d，進(jìn)行相關(guān)鑒定。

4.熒光定量PCR(RT-PCR)：使用RNA提取試劑盒(Qiagen，美國(guó))提取相關(guān)細(xì)胞系的總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Roche，美國(guó))合成cDNA，并使用Sybr Green(Roche，美國(guó))和特定引物配置體系在7500 Fast Real-Time PCR(Applied Biosystems，美國(guó))機(jī)器上對(duì)基因表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。GAPDH作為內(nèi)參基因，使用△△CT法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

5.包膜和胞漿內(nèi)蛋白的流式細(xì)胞檢測(cè)：細(xì)胞培養(yǎng)物使用0.5%胰蛋白酶消化收集，并使用流式細(xì)胞固定液(R&D Systems，美國(guó))固定，用流式細(xì)胞穿透和10%的人和驢血清封閉(包膜組無(wú)需穿透)。使用到的一抗如下：胞漿抗體 CYP19A1(Bioss，美國(guó))、FOXL2(Bioss，美國(guó))；包膜抗體FSHR(Bioss，美國(guó))。陰性對(duì)照組使用相對(duì)應(yīng)的Isotype對(duì)照組。流式樣品在 BD Influx 細(xì)胞分析儀(BD Biosciences，美國(guó))上檢測(cè)，使用FlowJo軟件分析。

6.免疫組織化學(xué)：貼壁培養(yǎng)細(xì)胞用0.01 mol/L PBS洗2次，每次10 min；4%的多聚甲醛固定20 min，0.01 mol/L PBS洗3次，每次10 min；用0.2% Triton X100室溫穿透及1% BSA封閉 30 min，吸棄血清后，加入一抗4℃孵育過(guò)夜；胞膜分子標(biāo)記檢測(cè)組則直接使用1% BSA 封閉30 min，吸棄血清后，加入一抗4℃孵育過(guò)夜；0.01 mol/L PBS洗3次，每次10 min；二抗(Alexa Fluor 488 或 Alexa Fluor 594)室溫孵育1 h；0.01 mol/L PBS洗3次，每次10 min；1 g/ml DAPI 復(fù)染細(xì)胞核；熒光顯微鏡下觀察拍照。

選用胚胎干細(xì)胞標(biāo)志：Nanog、Oct4、SSEA4、Sox2、Tra-1-60和TRA1-81；三胚層分化標(biāo)志：Tuj1、Fibronectin、AFP；選用顆粒細(xì)胞的標(biāo)志：FOXL2、CYP19A1及FSHR。

7.相關(guān)激素測(cè)定：芳香化酶活性檢測(cè)是通過(guò)在培養(yǎng)基中加入睪酮，然后檢測(cè)其中雌激素的水平。種植4×105的未分化的iPS細(xì)胞及分化后的顆粒細(xì)胞樣細(xì)胞分別于六孔板不同孔內(nèi)。在24 h內(nèi)，這些細(xì)胞均進(jìn)行50 ng/ml睪酮(Sigma-Aldrich，美國(guó)) 的處理。收集各孔的培養(yǎng)液，使用雌激素分析試劑盒(Cayman Chemical，美國(guó))進(jìn)行檢測(cè)。該試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線的跨度為6.6～4 000 pg/ml，雌激素檢測(cè)吸光度為405 nm。

AMH的檢測(cè)為上述密度細(xì)胞收集其更換培養(yǎng)基后48 h的培養(yǎng)液，使用AMH-EIA (Beckman Coulter，美國(guó))按照說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行檢測(cè)。標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍為1 pM～150 pM，吸光度為450 nm。

所有實(shí)驗(yàn)平行重復(fù)三次。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用方差分析檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、人卵泡壁層顆粒細(xì)胞源性非整合iPS細(xì)胞(GC-iPSC)的制備

使用仙臺(tái)病毒法過(guò)表達(dá)顆粒細(xì)胞OCT3/4、SOX2、KLF4和c-MYC的轉(zhuǎn)錄水平建立非整合的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞系，在轉(zhuǎn)染后20 d挑取胚胎干細(xì)胞樣克隆，使用無(wú)飼養(yǎng)層培養(yǎng)(圖1)。并通過(guò)免疫組化、體內(nèi)外分化等手段，證明其表達(dá)多能性標(biāo)志(圖2)，且具有體內(nèi)外三胚層多向分化的能力(圖3)。

二、GC-iPSC向顆粒細(xì)胞的體外定向分化

經(jīng)過(guò)成擬胚體懸浮培養(yǎng)轉(zhuǎn)貼壁培養(yǎng)，并在相關(guān)誘導(dǎo)因子的處理下，誘導(dǎo)12 d的細(xì)胞出現(xiàn)顆粒細(xì)胞樣的外觀，通過(guò)流式檢測(cè)和免疫組化發(fā)現(xiàn)分化后的細(xì)胞大量表達(dá)顆粒細(xì)胞特異標(biāo)志CYP19A1、FOXL2和FSHR(圖4)。

三、不同原代細(xì)胞來(lái)源iPS細(xì)胞系向顆粒細(xì)胞體外分化效率的比較

顆粒細(xì)胞源性iPS和皮膚成纖維細(xì)胞源性iPS平行進(jìn)行顆粒細(xì)胞方向的定向分化，檢測(cè)定向分化12 d時(shí)的細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)顆粒細(xì)胞源性組具有更高水平的相關(guān)顆粒細(xì)胞標(biāo)志基因(FSHR、FOXL2、CYP19A1)的轉(zhuǎn)錄水平(P<0.01)，且具有更強(qiáng)的芳香化酶的活性，即將睪酮轉(zhuǎn)化為雌激素的能力(P<0.05)，具有更強(qiáng)的分泌AMH的能力(P<0.05)(圖5)。

A：撿卵操作中收集的顆粒細(xì)胞(培養(yǎng)前)；A1：顆粒細(xì)胞培養(yǎng)4 d后；B：轉(zhuǎn)染仙臺(tái)病毒4 d后；B1：B高倍像，誘導(dǎo)后細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，增殖變快；C：誘導(dǎo)20 d出現(xiàn)胚胎干細(xì)胞樣克?。籆1：C高倍像；Bar=100 μm圖1 顆粒細(xì)胞原代培養(yǎng)及iPS誘導(dǎo)過(guò)程

A：克隆白光、堿性磷酸酶染色及多能基因SSEA4/OCT4/NANOG/SOX2/TRA-1-60/TRA-1-81的免疫熒光染色；Bar=200μm； B：RT-PCR檢測(cè)顆粒細(xì)胞源iPS(GC-iPSC)多能基因的表達(dá)情況 圖2 顆粒細(xì)胞源iPS的多能性鑒定

A～C：擬胚體的懸浮及貼壁白光；D～F：免疫組化鑒定三胚層分化標(biāo)志,Tuj1(外胚層,D)、FN(中胚層,E)、 AFP(內(nèi)胚層,F)；G～I(xiàn)：畸胎瘤的內(nèi)部形成內(nèi)(G)、中(H)、外(I)胚層組織形態(tài)；Bar=100 μmF：RT-PCR檢測(cè)顆粒細(xì)胞源iPS擬胚體(GC-iPS EB)分化基因的表達(dá)情況圖3 顆粒細(xì)胞源iPS分化能力的鑒定

A：擬胚體的形成及貼壁12 d后白光；B：免疫組化鑒定定向分化細(xì)胞顆粒細(xì)胞標(biāo)志FSHR、FOXL2、CYP19A1；Bar=100μm； C：流式細(xì)胞儀鑒定定向分化細(xì)胞顆粒細(xì)胞標(biāo)志FSHR、FOXL2、CYP19A1圖4 顆粒細(xì)胞源iPS向顆粒細(xì)胞定向分化的鑒定

A：Real-time PCR比較顆粒細(xì)胞源性iPS(GC-iPSC)和皮膚成纖維細(xì)胞源性iPS(SF-iPSC)在顆粒細(xì)胞(GC)標(biāo)志基因FSHR、FOXL2、CYP19A1的表達(dá)差異；B：GC-iPSC和SF-iPSC將睪酮(50 ng/ml)轉(zhuǎn)化為雌激素的能力比較；C：GC-iPSC和SF-iPSC分泌AMH的能力比較。*P<0.05,**P<0.01圖5 顆粒細(xì)胞源性iPS和皮膚成纖維細(xì)胞源性iPS體外顆粒細(xì)胞定向分化能力比較

討 論

iPS細(xì)胞可以作為疾病的細(xì)胞模型，在體外模擬疾病的發(fā)病過(guò)程，從而能夠深入研究相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制；另一方面，誘導(dǎo)分化的有缺陷的靶細(xì)胞可以為基因修復(fù)治療、藥物篩選、毒理評(píng)價(jià)提供細(xì)胞工具。目前已有很多人類(lèi)遺傳病被報(bào)道建立了疾病iPS細(xì)胞系，并成功完成了體外的疾病模擬。Lee等[10]首次建立了家族性自主神經(jīng)功能異常(FD)患者體細(xì)胞來(lái)源的iPS細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)在FD iPS往神經(jīng)方向分化時(shí)具有大量異常蛋白，并具有神經(jīng)元分化能力缺陷，而當(dāng)細(xì)胞加以激動(dòng)素處理后該缺陷得以修復(fù)，該實(shí)驗(yàn)為使用激動(dòng)素進(jìn)行長(zhǎng)期治療可能有益于FD患者的觀點(diǎn)提供了最好的證據(jù)。本生殖中心在植入前遺傳診斷(PGD)方面一直處于全國(guó)前列，集合了大量遺傳病標(biāo)本資源，通過(guò)取遺傳病患者的顆粒細(xì)胞，可以因此而建立大量遺傳疾病的iPS 庫(kù)，并開(kāi)展疾病的體外模擬，研究發(fā)病機(jī)制。

同時(shí)經(jīng)大量研究發(fā)現(xiàn)顆粒細(xì)胞亞群中存在干性的細(xì)胞類(lèi)型[11]。這個(gè)現(xiàn)象首次由 Kossowska-Tomaszczuk等[12]發(fā)現(xiàn)，該研究組證實(shí)了IVF實(shí)驗(yàn)室獲取的顆粒細(xì)胞能夠分化成其他組織類(lèi)型的細(xì)胞，如神經(jīng)元、軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞。Mao等[13]發(fā)現(xiàn)小鼠顆粒細(xì)胞不表達(dá)分化細(xì)胞標(biāo)志Lamin A，內(nèi)源性表達(dá)Sox2和c-Myc轉(zhuǎn)錄因子，并使用2因子法(O/S)建立了小鼠顆粒細(xì)胞來(lái)源的iPS細(xì)胞系，因此人顆粒細(xì)胞來(lái)源的iPS細(xì)胞應(yīng)該有更高的誘導(dǎo)效率。但本文并沒(méi)有在誘導(dǎo)效率這一點(diǎn)進(jìn)行深入探討。

顆粒細(xì)胞在卵泡發(fā)生的過(guò)程中對(duì)卵泡的生長(zhǎng)和發(fā)育起到重要作用。目前認(rèn)為女性生殖細(xì)胞的丟失和卵巢顆粒細(xì)胞的衰減是早衰的根本原因。已發(fā)現(xiàn)卵巢早衰患者的顆粒細(xì)胞的凋亡率較正常人要高，因此補(bǔ)充顆粒細(xì)胞是一種預(yù)期可以改善卵巢功能的方法。且目前已經(jīng)有從大鼠、小鼠和人iPSC向卵巢顆粒細(xì)胞分化的較成熟方案[14-15]，且發(fā)現(xiàn)該類(lèi)細(xì)胞當(dāng)移植入小鼠體內(nèi)會(huì)出現(xiàn)歸巢效應(yīng)，將會(huì)圍繞在卵母細(xì)胞的周?chē)鶾16]。目前臨床主要以雌/孕激素替代療法來(lái)治療卵巢早衰，但目前這些治療方法尚不能從根本上修復(fù)受損的卵巢功能，且長(zhǎng)期應(yīng)用激素還可能會(huì)引起一些副作用，甚至可能還存在增加乳腺癌等惡性腫瘤、心臟病和中風(fēng)的風(fēng)險(xiǎn)[17]。所以，怎樣提前預(yù)防和恢復(fù)衰退的卵巢功能，尋求新的治療方法，從而恢復(fù)患者的生育功能是生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域面臨的一個(gè)挑戰(zhàn)。結(jié)合iPS印記基因的效應(yīng)，顆粒細(xì)胞來(lái)源的iPS細(xì)胞系可能是最理想的一種種子細(xì)胞，可以高效地分化為更接近于本體的顆粒細(xì)胞，可能會(huì)對(duì)卵巢環(huán)境的修復(fù)產(chǎn)生正面影響。

綜上所述，建立人卵泡壁層顆粒細(xì)胞源性非整合iPS的技術(shù)將會(huì)推進(jìn)生殖中心利用本中心的遺傳疾病顆粒細(xì)胞這個(gè)標(biāo)本資源建立一系列的具有生殖細(xì)胞印記的iPS細(xì)胞，該類(lèi)細(xì)胞可以高效分化為顆粒細(xì)胞樣細(xì)胞，可能對(duì)卵巢損傷后微環(huán)境的改善具有一定作用，而使用仙臺(tái)病毒非整合基因組的誘導(dǎo)特點(diǎn)也將為未來(lái)的細(xì)胞移植治療的安全性提供一定的保障。

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[編輯：羅宏志]

Derivation of integration-free iPSCs from human mural granulosa cells

CAIBing1，2，TUOYing3，LIYu-bin1，2，MAIQin-yun1，2，LIUXin-yan1，2，XUYan-wen1，2，ZHOUCan-quan1，2*

1.ReproductiveMedicineCenter，theFirstAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity，Guangzhou510080 2.GuangdongKeyLaboratoryofReproductiveMedicine，Guangzhou510080 3.DepartmentofHistopathology，theFirstAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity，Guangzhou510080

Objective：To induce human mural granulose cells to integration-free induced pluripotent stem cells(iPSC)，and test the differentiation potential of granulosa cell-like (GC-like) cells.Methods：Human mural granulosa cells were collected during oocyte retrieval process from women undergoing infertility treatment. iPS Sendai virus was added to the 4thday of granulosa cell cultured. After 20 days of maintenance，iPS cell clones were picked and cultured. The ability of pluripotent gene expression，the integration of foreign genes，and the ability of differentiation of GC-like cells were identified and compared with the iPSC derived from skin cells.Results：mGC-iPSCs were successfully generated，and passed the tests of similar pluripotency of embryonic stem cells and differentiation ability of three germ layers in vitro. The differentiated GC-like cells expressed the granulosa cell specific marker FOXL2，CYP19A1 and FSHR. These GC-like cells were also capable of producing AMH and aromatizing testosterone to estradiol，which suggested that they were biologically functional. mGC-iPSCs have higher differentiation` efficiency thanbroblast-iPSCs.Conclusions：The study provides a safety method for generating human iPSCs from human mural granulosa cells，and finds that mGC-derived iPSCs reveal higher differentiation efficiency thanbroblast-derived iPSCs. The system can not only be used to establish the iPSC library for reproductive infertility，but also to provide a new idea for cell therapy for the infertile patients with granule cell dysfunction.

Integration-free iPSCs； Mural granulosa cells； Differentiation efficiency

10.3969/j.issn.1004-3845.2017.04.004

2017-02-05；

2017-02-28

國(guó)家自然青年基金(31401269)；廣東省公益研究基金(2014A020211012)；廣州市生殖醫(yī)學(xué)轉(zhuǎn)化中心項(xiàng)目(201508020006)

蔡炳，男，浙江寧波人，博士，干細(xì)胞與組織工程專(zhuān)業(yè).(*

，Email：zhoucanquan@hotmail.com)