李偉偉，閆婭妮，史鴻志，董麗霞，殷秀榮

(秦皇島市婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)科，秦皇島 066004)

PRM1基因C321A、G197T單核苷酸多態(tài)性對(duì)體外受精結(jié)局的影響

李偉偉，閆婭妮，史鴻志，董麗霞，殷秀榮*

(秦皇島市婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)科，秦皇島 066004)

目的 探討魚精蛋白1的C321A、G197T基因多態(tài)性與體外受精結(jié)局的關(guān)系。 方法 選取我院生殖中心進(jìn)行常規(guī)IVF的182例(182個(gè)周期)，根據(jù)受精率分為3組：A組受精率<30%，43個(gè)周期；B組受精率在30%～65%之間，24個(gè)周期；C組受精率>65%，115個(gè)周期。提取授精后剩余精子的基因組DNA，采用聚合酶鏈限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)方法檢測(cè)PRM1基因C321A和G197T 基因型頻率和分布，比較3組間基因型的分布差異及所有研究對(duì)象不同基因型間受精率的差異。 結(jié)果 3組間比較，PRM1基因C321A多態(tài)性位點(diǎn)的各基因型頻率無顯著性差異(P>0.05)，C321A多態(tài)性位點(diǎn)與IVF受精率無相關(guān)性(P>0.05)。在A組中，PRM1基因 G197T多態(tài)性位點(diǎn)GG、GT、TT基因型分布頻率分別為9.3%(4)、25.6%(11)、65.1%(28)；B組分別為8.3%(2)、25.0%(6)、66.7%(16)；C組分別為38.3%(44)、26.1%(30)、35.6%(41)。A組和B組的TT基因型頻率顯著高于C組(65.1% vs. 35.6%，66.7% vs. 35.6%)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，TT基因型增加了IVF受精失敗的風(fēng)險(xiǎn)。 結(jié)論 PRM1基因 C321A多態(tài)性與IVF受精率不相關(guān)；PRM1基因 G197T多態(tài)性改變與IVF受精率相關(guān)。

魚精蛋白1； 單核苷酸多態(tài)性； 體外受精

(JReprodMed2017，26(4)：362-365)

全世界大約15%的夫婦受到不孕不育的困擾，盡管輔助生殖技術(shù)能夠解決一部分男性患者的不育情況，但是仍有部分男性不育的問題未得到解決。近來有研究表明魚精蛋白(PRM)與男性不育顯著相關(guān)[1-2]。PRM在精子核中是主要的DNA結(jié)合蛋白，分為PRM1和PRM2，其在精子生成及受精等方面的功能越來越受到學(xué)者的重視。越來越多的學(xué)者從遺傳角度上對(duì)男性不育的原因進(jìn)行分析，主要的遺傳異常包括：染色體畸變、染色體微缺失、單基因突變和遺傳多態(tài)性等[3]。單核苷酸多態(tài)性(SNP)是目前分布最廣泛且存在數(shù)量最多的一種遺傳多態(tài)性。PRM1基因SNP的研究熱點(diǎn)主要是rs35576928、rs737008和rs2301365這3個(gè)位點(diǎn)[4]。目前國(guó)內(nèi)針對(duì)PRM1基因多態(tài)性與體外受精結(jié)局的研究尚不多，本文通過研究PRM1基因的C321A和G197T多態(tài)性與體外受精(IVF)結(jié)局的相關(guān)性，在基因多態(tài)性的水平上探討受精失敗的原因。

資料與方法

一、研究對(duì)象與分組

選取我院生殖中心2015年5月至2016年10月進(jìn)行常規(guī)IVF的182例(182個(gè)周期)，納入標(biāo)準(zhǔn)：女方單純輸卵管性不孕，年齡24～37歲，男方年齡25～40歲，雙方染色體均正常，首次IVF。納入標(biāo)準(zhǔn)：近3個(gè)月內(nèi)未使用過激素類藥物，既往無自然流產(chǎn)史，患者身體健康，無遺傳性疾病家族史，近期無泌尿生殖系統(tǒng)感染，基礎(chǔ)內(nèi)分泌水平正常。該研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象均簽署知情同意書。

根據(jù)受精率將182個(gè)IVF周期分3組，A組43周期，受精率<30%；B組24周期，30%≤受精率≤65%；C組115 周期，受精率>65%。

二、研究方法

1.精子制備和DNA提取：取卵日，采用密度梯度結(jié)合上游法處理精液，將授精剩余的精子進(jìn)行DNA的提取。采用常規(guī)苯酚-氯仿法進(jìn)行基因組DNA 提取，并對(duì)DNA含量進(jìn)行分析、測(cè)定，-80 ℃保存，備用。

2.引物設(shè)計(jì)與合成：登陸Gen Bank 查詢PRM1基因全序列M60331，引物設(shè)計(jì)采用primer 5.0軟件完成，根據(jù)PRM1基因序列，C321A上游引物5’-cccctggcatctataacaggccgc-3，下游引物5’-tcaagaacaaggagagaagagtgg-3’，擴(kuò)增片段為557 bp。G197T上游引物：5’-ttctcacagcccacagagtt-3’，下游引物：5’-ggcaacatttattgacaggcgg-3’，擴(kuò)增片段為398 bp，引物合成由大連寶生物公司完成。

3.PCR產(chǎn)物擴(kuò)增：應(yīng)用 DNA作為模板，建立25 μl聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)體系，模板DNA 1 μl，d NTPs 1 μl，10× PCR Buffer 2.5 μl，PRM1基因5’引物0.5 μl，PRM1基因3’引物 0.5 μl，Taq酶0.5 μl，加去離子水至終體積25 μl。PCR反應(yīng)條件，94℃預(yù)變性2 min，94℃變性50 s，60℃退火50 s，72℃延伸50 s，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min，降至4℃保溫。PCR產(chǎn)物均用1%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。

4.聚合酶鏈限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)分析及電泳檢測(cè)：BstuI和BseR I分別酶切557 bp和398 bp PCR產(chǎn)物，BstuI酶切反應(yīng)體系為15 μl，其中擴(kuò)增產(chǎn)物為10 μl，限制性內(nèi)切酶為5 U，37℃恒溫過夜；Bse R I酶切體系為12 μl，其中擴(kuò)增產(chǎn)物為6 μl，限制性內(nèi)切酶1 μl，37℃恒溫過夜。酶切產(chǎn)物分別用1.5%和2%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用 SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，χ2檢驗(yàn)用來檢測(cè) SNP 位點(diǎn)在檢測(cè)人群中的分布是否符合哈迪-溫伯格定律并檢測(cè)基因型在各組中的分布頻率，單因素方差分析用于比較不同基因型對(duì)受精率的影響，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、PCR-RLPF檢測(cè)結(jié)果

PRM1基因C321A多態(tài)性PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為557 bp，經(jīng)BstuI酶切后，1.5%瓊脂糖凝膠電泳，基因型結(jié)果顯示見圖1。PRM1基因G197T多態(tài)性PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為398 bp，2%瓊脂糖凝膠電泳，基因型結(jié)果顯示見圖2。

1：1 000 bp marker；2：PRM1 DNA；3：CC基因型；4：CA基因型；5：AA 基因型圖1 BstuI酶切557 bp PCR產(chǎn)物結(jié)果1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果

1：2 000 bp marker；2：GG基因型；3：GT基因型；4：TT 基因型；5：PRM1 DNA圖2 BseRI酶切 398 bp PCR產(chǎn)物結(jié)果2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果

二、PRM1基因C321A多態(tài)性位點(diǎn)的基因型分析

所有研究對(duì)象均符合哈迪-溫伯格平衡定律。A組中CC、CA、AA基因型樣本例數(shù)分別為13、11、19例，B組中CC、CA、AA基因型樣本例數(shù)分別為7、6、11例；C組中CC、CA、AA基因型樣本例數(shù)分別為31、33、51例；3組間比較，基因型CA、AA及CA+AA分布無顯著性差異(P>0.05)(表1)。

三、PRM1基因G197T多態(tài)性位點(diǎn)的基因型分析

在A組中GG、GT和TT基因型樣本例數(shù)分別為4、11、28例；在B組中GG、GT和TT基因型樣本例數(shù)分別為2、6、16例；在C組中GG、GT和TT基因型樣本例數(shù)分別為 44、30、41；A組和B組TT基因型及GT+TT基因型分布頻率顯著高于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。GT基因型在3組間的分布無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表2)。

表1 PRM1基因C321A位點(diǎn)的基因型在3組間的分布頻率

表2 PRM1基因G197T位點(diǎn)的基因型在3組間的分布頻率

注：與C組比較，▲P<0.05

四、PRM1基因C321A、G197T多態(tài)性位點(diǎn)對(duì)受精率的影響

C321A多態(tài)性位點(diǎn)不同基因型間受精率無顯著性差異(P>0.05)；G197T多態(tài)性位點(diǎn)不同基因型間受精率有顯著性差異(P<0.05)，TT基因型受精率低于GT和GG基因型，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表3)。

表3 PRM1基因 C321A、G197T多態(tài)性位點(diǎn)不同基因型對(duì)IVF受精率的影響(x-±s)

注：與GT和GG基因型比較，★P<0.05

討 論

目前，人們對(duì)SNPs的研究越來越廣泛，涉及到各種多基因疾病和一些復(fù)雜性疾病。近年來，更多學(xué)者專注于男性不育與相關(guān)基因SNPs關(guān)聯(lián)性的研究[5-6]，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)一些基因的SNP與男性不育存在一定的相關(guān)性，它們可能參與細(xì)胞增殖和抗氧化過程，與精子發(fā)生過程相關(guān)。但這些研究主要見于國(guó)外，國(guó)內(nèi)相關(guān)報(bào)道尚少。IVF-ET是治療不孕的最有效方法，即使ICSI技術(shù)日趨成熟，仍有部分精液分析正常的男性無法在IVF中使卵母細(xì)胞受精，甚至ICSI也可能出現(xiàn)卵母細(xì)胞不受精的現(xiàn)象，所以研究精卵受精失敗具有重要意義。

PRM是人精子細(xì)胞核中含量最豐富的核蛋白，在精子發(fā)生和DNA凝聚過程中，睪丸生精細(xì)胞內(nèi)核蛋白組型由組蛋白轉(zhuǎn)化為PRM。PRM根據(jù)其氨基酸的組成和序列分為兩類，PRM1和 PRM2。PRM促使精子中的核基質(zhì)與核蛋白之間的結(jié)合更緊密，從而使核內(nèi)染色質(zhì)高度富集濃縮，防止精子基因組因內(nèi)部或外部因素而誘發(fā)突變[7-8]。國(guó)外學(xué)者Iguchi等[9]發(fā)現(xiàn)并報(bào)道PRM1上第一個(gè)SNP位點(diǎn)是c.197G>T。該位點(diǎn)破壞PRM1與DNA結(jié)合所必須的高度保守的富含精氨酸區(qū)域，從而影響精子的發(fā)生障礙，進(jìn)一步影響受精。關(guān)于PRM基因多態(tài)性與受精率和胚胎發(fā)育的研究國(guó)內(nèi)報(bào)道較少，魚精蛋白影響受精率和胚胎發(fā)育的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。本文針對(duì)PRM1基因C321A和G197T多態(tài)性位點(diǎn)與IVF受精結(jié)局之間的相關(guān)性展開研究，從基因多態(tài)性的水平上研究PRM1基因多態(tài)性與受精率的相關(guān)性。結(jié)果表明PRM1基因C321A多態(tài)性位點(diǎn)與IVF受精率之間不相關(guān)；PRM1基因G197T多態(tài)性位點(diǎn)TT基因型顯著增加了受精失敗的風(fēng)險(xiǎn)，與IVF的受精率相關(guān)。

余慶峰等[10]報(bào)道PRM1基因SNP位點(diǎn)-190C->A多態(tài)性可能與中國(guó)漢族畸形精子癥男性不育存在相關(guān)，該位點(diǎn)可能導(dǎo)致精子形態(tài)異常。近期，一項(xiàng)小樣本GWAS(genome-wide analysis study)研究[11]報(bào)道了PRM1基因和PRM2基因3個(gè)標(biāo)簽SNPs(rs2301365、rs35576928和rs3177008)與非梗阻性無精子癥和嚴(yán)重少弱精子癥有關(guān)。李俊等[12]研究結(jié)果表明，PRM1基因SNP位點(diǎn)C321A與男性不育具有相關(guān)性，而Tanaka等[13]和Siasi等[11]均報(bào)道PRM1基因C321位點(diǎn)多態(tài)性與男性不育不存在相關(guān)性，國(guó)內(nèi)外報(bào)道存在爭(zhēng)議。本研究選取C321 snp位點(diǎn)進(jìn)行研究，探討此位點(diǎn)多態(tài)性與IVF受精率的相關(guān)性，結(jié)果表明C321多態(tài)性位點(diǎn)與IVF受精結(jié)局之間不存在相關(guān)性，與Tanaka和Siasi的研究相一致。lguchi 等[9]曾首次提出PRM1基因G197T多態(tài)性位點(diǎn)與男性不育可能相關(guān)，本研究結(jié)果表明G197T位點(diǎn)多態(tài)性是受精失敗的風(fēng)險(xiǎn)，更進(jìn)一步證實(shí)其與男性不育的相關(guān)性。

本研究選取首次IVF的182個(gè)周期的患者作為研究對(duì)象，結(jié)果表明PRM1基因G197T snp位點(diǎn) TT基因型是IVF受精失敗的風(fēng)險(xiǎn)因素，但是由于研究病例有限，仍需要擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證。盡管目前已知此位點(diǎn)是風(fēng)險(xiǎn)因素，但是其具體機(jī)制尚不清楚，進(jìn)一步研究其導(dǎo)致受精失敗的機(jī)制變得十分重要，為臨床提供更多的治療方案，改善或者避免受精失敗的發(fā)生。

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[編輯：侯麗]

Association between C321A & G197T polymorphism of PRM1 gene and IVF fertilization rate

LIWei-wei，YANYa-ni，SHIHong-zhi，DONGLi-xia，YINXiu-rong*

Departmentofreproductivemedicine，MaternityandchildcarecenterofQinhuangdao，Qinhuangdao066004

Objective：To explore the association between single nucleotide polymorphism (SNP) loci C321A & G197T in protamine 1 (PRM1) gene and IVF fertilization rate.Methods：A total of 182 IVF-ET cycles in our reproductive center were collected. The cycles were divided into three groups by the fertilization rate：the cycles with fertilization rate<30% in group A (n=43)，30% to 65% in group B (n=24) cycles，and>65% in group C (n=115). The genomic DNA of residual sperm after insemination was extracted，and the frequency of C321A and G197T in PRM1 was detected by PCR-RFLP analysis. The differences in genotype and IVF fertilization rate were compared among the three groups.Results：There was no any significant difference in the genotype frequency of C321 polymorphism in PRM1 gene among the three groups(P>0.05). C321A polymorphism in PRM1 gene was not associated with IVF fertilization rate(P>0.05). The frequency of genotype GG，GT and TT of G197T in PRM1 gene was 9.3%(4)，25.6%(11)，and 65.1%(28)in group A；the frequency of genotype GG，GT and TT was 8.3%(2)，25.0%(6)，and 66.7%(16)in group B；and the frequency of genotype GG，GT and TT was 38.3%(44)，26.1%(30)，and 35.6%(41)in group C respectively. The frequency of genotype TT of G197T in group A and group B was significantly higher than that of group C(65.1% vs. 35.6%，66.7% vs. 35.6%)(P<0.05). Genotype TT of PRM1 G197T increased the risk of fertilization failure.Conclusions：The SNP of C321A in PRM1 is not associated with IVF fertilization rate. The SNP of G197T in PRM1 is associated with IVF fertilization rate.

Protamine 1； Single nucleotide polymorphism； IVF

10.3969/j.issn.1004-3845.2017.04.014

2016-11-06；

2016-12-03

李偉偉，女，河北秦皇島人，碩士研究生，主管檢驗(yàn)師，生殖醫(yī)學(xué)專業(yè).(*

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