吳克良

(山東大學(xué)附屬生殖醫(yī)院，濟(jì)南 250001)

新的囊胚活檢方法
——囊胚活檢不再糾結(jié)和繁瑣

吳克良

(山東大學(xué)附屬生殖醫(yī)院，濟(jì)南 250001)

囊胚活檢目前是進(jìn)行胚胎植入前遺傳學(xué)診斷/篩查(PGD/PGS)以及單基因疾病診斷的前提。目前常規(guī)使用的提前打孔的囊胚活檢方法，會(huì)出現(xiàn)囊胚孵出時(shí)間不確定、內(nèi)細(xì)胞團(tuán)處于孵出部位以及囊胚過(guò)早孵出等異?，F(xiàn)象，給囊胚活檢帶來(lái)了一定的困難，并部分地影響到囊胚最終移植的臨床結(jié)局。新的非提前打孔囊胚活檢法，利用透明帶本身的束縛作用減少激光的創(chuàng)面，可以最大程度地減少活檢時(shí)異常情況的出現(xiàn)，使得活檢更加簡(jiǎn)單并且可控，可以在一定程度上改善移植胚胎的臨床結(jié)局。

囊胚活檢； 透明帶打孔； 囊胚孵出； 內(nèi)細(xì)胞團(tuán)

(JReprodMed2017，26(4)：324-327)

胚胎植入前遺傳學(xué)診斷(PGD)以及胚胎植入前篩查(PGS)是指在體外受精過(guò)程中，對(duì)具有遺傳風(fēng)險(xiǎn)或胚胎異常風(fēng)險(xiǎn)患者的胚胎進(jìn)行種植前活檢和遺傳學(xué)分析，以選擇無(wú)遺傳學(xué)疾病的胚胎植入宮腔，從而獲得正常胎兒的診斷方法，可有效地防止有遺傳疾病患兒的出生。PGD、PGS技術(shù)一方面可以有效地替代傳統(tǒng)的產(chǎn)前診斷技術(shù)，對(duì)異常胚胎進(jìn)行治療性流產(chǎn)，避免中期妊娠遺傳診斷及終止妊娠所致的危險(xiǎn)及痛苦；另外一方面，PGD、PGS技術(shù)的產(chǎn)生與完善可以排除遺傳病攜帶者胚胎，阻斷致病基因的縱向傳遞，從而降低人類遺傳負(fù)荷[1-2]。而且隨著二胎政策的實(shí)施，目前輔助生殖技術(shù)高齡需求者的比例較之前有明顯提高，而高齡患者的再生育也伴隨著新生兒出生缺陷的風(fēng)險(xiǎn)增加。對(duì)高齡孕婦和高危婦女進(jìn)行PGS可以有效地避免遺傳病患兒的出生[3-4]。

胚胎活檢以獲得少量的胚胎細(xì)胞進(jìn)行遺傳學(xué)分析是進(jìn)行PGD、PGS以及單基因疾病診斷的前提。根據(jù)實(shí)施活檢的時(shí)期可分為卵裂期活檢和囊胚活檢。卵裂期胚胎活檢大部分情況下活檢1～2個(gè)卵裂球，對(duì)胚胎的發(fā)育潛能損傷比較大[5]，而且卵裂期胚胎存在嵌合體的比例相對(duì)較高，故其產(chǎn)生假陽(yáng)性或假陰性的比例較高，這在一定程度上給最終的診斷帶來(lái)較大的風(fēng)險(xiǎn)。因此，卵裂期活檢除了少部分采用FISH技術(shù)診斷的病例以外，應(yīng)用越來(lái)越少。囊胚活檢通常會(huì)活檢3～6個(gè)滋養(yǎng)層細(xì)胞，由于囊胚本身的特點(diǎn)以及在一定程度上降低了嵌合體概率[6-7]，因此，囊胚活檢獲得了越來(lái)越多的應(yīng)用。

相關(guān)報(bào)道證明，通過(guò)胚胎培養(yǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的游離DNA可以比較準(zhǔn)確地對(duì)胚胎進(jìn)行遺傳學(xué)診斷，并且有成功的案例報(bào)導(dǎo)[8]。但是該技術(shù)目前仍然存在一定的應(yīng)用缺陷，比如準(zhǔn)確率還遠(yuǎn)遠(yuǎn)沒(méi)有達(dá)到大量推廣的要求、嵌合體問(wèn)題無(wú)法有效解決、無(wú)法有效診斷單基因病等。因此，至少在目前的技術(shù)條件下，囊胚活檢仍然是一項(xiàng)必不可少的實(shí)驗(yàn)室常規(guī)技術(shù)。

目前國(guó)際上通用的囊胚活檢方法是在胚胎發(fā)育至D3時(shí)在胚胎透明帶上用激光或機(jī)械法打一個(gè)穿透的小孔，以便胚胎發(fā)育成囊胚的時(shí)候部分滋養(yǎng)層細(xì)胞能夠從穿透的小孔中滲透出來(lái)，便于滋養(yǎng)層細(xì)胞的獲取。該方法是目前使用最多的方法，可以比較容易地獲得滋養(yǎng)層細(xì)胞，并且胚胎發(fā)育至相對(duì)早期囊胚階段的時(shí)候便有滋養(yǎng)層細(xì)胞滲透出透明帶。但同時(shí)也具有潛在不足。首先，由于透明帶打孔時(shí)機(jī)選擇在D3卵裂期，其位置是隨機(jī)的，當(dāng)胚胎發(fā)育至囊胚期時(shí)開孔位置靠近滋養(yǎng)層端還是內(nèi)細(xì)胞團(tuán)端很難保證，有約1/4的概率是正處或靠近內(nèi)細(xì)胞端(圖1)，這給滋養(yǎng)層獲取帶來(lái)較大困難并且很難避免激光的熱效應(yīng)對(duì)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的影響；其次，由于提前給透明帶打孔，囊胚發(fā)育過(guò)程中就不會(huì)出現(xiàn)囊胚腔完全擴(kuò)張并使透明帶變薄的現(xiàn)象，并且會(huì)出現(xiàn)滋養(yǎng)層細(xì)胞數(shù)目較少、細(xì)胞大、提前孵出的情況等等。這些非正常狀態(tài)下的囊胚發(fā)育進(jìn)程對(duì)胚胎植入前后的影響是目前還沒(méi)有明確的結(jié)論，對(duì)該類胚胎來(lái)源的后代影響目前也缺少系統(tǒng)的追蹤；再次，由于缺少透明帶壓力本身的約束，滋養(yǎng)層細(xì)胞數(shù)目少、細(xì)胞體積大本身也使得在活檢過(guò)程中激光切割的創(chuàng)面變大，受影響細(xì)胞的比例增加，這勢(shì)必會(huì)影響整個(gè)囊胚的最終發(fā)育潛能[9]；最后，透明帶打孔后使得胚胎出現(xiàn)部分孵出的現(xiàn)象增加，這樣給使得該囊胚在冷凍過(guò)程中容易產(chǎn)生胚胎丟失，而且胚胎融解后很難進(jìn)行再次輔助孵化，可能使得內(nèi)細(xì)胞團(tuán)部分將來(lái)很難孵出導(dǎo)致胚胎著床失敗。

另外一種使用相對(duì)較少的囊胚活檢方法是于囊胚階段對(duì)囊胚進(jìn)行皺縮并選擇合適位置進(jìn)行打孔，待滋養(yǎng)層部分孵出以后吸取孵出的滋養(yǎng)層細(xì)胞部分進(jìn)行活檢。該方法雖然可以避免內(nèi)細(xì)胞團(tuán)部分的非預(yù)期孵出，但是需要等到囊胚再次復(fù)張并孵出才能活檢，部分情況下當(dāng)天是無(wú)法完成活檢的。因此這種活檢方法的使用受到極大的限制。

針對(duì)目前活檢技術(shù)所存在的各種缺陷以及不方便，我們中心結(jié)合前期大量的實(shí)踐，探索開發(fā)了一種新的非提前打孔式的囊胚活檢方法(圖2)，主要操作流程包括以下幾個(gè)部分：(1)胚胎自然發(fā)育到4期囊胚階段；(2)用適當(dāng)?shù)哪芰繉?duì)囊胚進(jìn)行簡(jiǎn)單皺縮；(3)用較小的激光能量對(duì)活檢位置的透明帶進(jìn)行開縫；(4)隔著透明帶上所開的縫隙，利用負(fù)壓將所要活檢的滋養(yǎng)層細(xì)胞吸入活檢針中；(5)用激光沿著透明帶與活檢針的交接處切割滋養(yǎng)層細(xì)胞；(6)完全分離所需要的滋養(yǎng)層細(xì)胞。

圖1 內(nèi)細(xì)胞正處于活檢位置或孵出位置

圖2 非提前打孔活檢的主要步驟

該方法的實(shí)施使得我們?cè)诨顧z之前不需要對(duì)囊胚做任何操作，每天只要觀察一次就能確定囊胚是否需要活檢，大大降低了我們對(duì)囊胚發(fā)育的干預(yù)頻率，而且可以更好地確?；顧z后囊胚后期的冷凍和復(fù)蘇效果。通過(guò)簡(jiǎn)單的隨機(jī)對(duì)照研究發(fā)現(xiàn)，采用非提前打孔的方法進(jìn)行囊胚活檢，可以有效避免活檢時(shí)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)處于活檢的位置(0% vs. 16.53%，P=0.0000)，顯著降低每患者的平均活檢次數(shù)(1.74 vs. 2.43，P=0.0276)，顯著降低活檢時(shí)囊胚處于完全孵出狀態(tài)的比例(6.11% vs. 20.45%，P=0.0000)，活檢后胚胎處于透明帶內(nèi)部的比例顯著高于常規(guī)活檢組(89.50% vs. 47.11%，P=0.0000)(表1)。通過(guò)移植周期的臨床結(jié)局簡(jiǎn)單對(duì)比顯示，非提前打孔組所獲得的臨床妊娠率和著床率均顯著高于常規(guī)活檢組(均為79.59% vs. 59.61%，P=0.0296)(表2)。

表1 操作效果在常規(guī)活檢組與非提前打孔組的比較[n(%)]

注：與常規(guī)活檢組比較，*P<0.05

常規(guī)活檢方法在活檢過(guò)程中存在比較多的不確定環(huán)節(jié)，比如內(nèi)細(xì)胞團(tuán)處于活檢位置、囊胚過(guò)早孵出、孵出不充分等等，這些因素也是導(dǎo)致常規(guī)活檢費(fèi)時(shí)費(fèi)力的主要原因。而采用新的非提前打孔囊胚活檢時(shí)，基本不會(huì)遇到比較特殊的情況，只需要確定活檢時(shí)囊胚處于4期階段即可，大大減少了實(shí)驗(yàn)室的操作時(shí)間和不確定因素。另外，提前打孔對(duì)胚胎的發(fā)育本身可能也是一種干擾。在自然狀態(tài)下，囊胚需要達(dá)到足夠的細(xì)胞數(shù)量和足夠小的細(xì)胞體積才能夠完全擴(kuò)張并孵出。在提前打孔的囊胚活檢技術(shù)實(shí)施過(guò)程中，破損的透明帶失去了對(duì)囊胚的整體束縛作用，使得囊胚在較早階段時(shí)便開始孵出，這也是常規(guī)囊胚活檢時(shí)細(xì)胞體積較大、細(xì)胞數(shù)量整體較少的主要原因，在一定程度上增加了囊胚活檢對(duì)胚胎的損傷效應(yīng)[8]。改進(jìn)的非提前打孔活檢法可以使得囊胚在活檢之前充分發(fā)育，在囊胚擴(kuò)張與透明帶束縛力的反復(fù)競(jìng)爭(zhēng)中，囊胚的數(shù)量增加并且體積減小，這也完全符合胚胎的自然發(fā)育規(guī)律。正是由于提前打孔會(huì)導(dǎo)致囊胚的提前孵出，故冷凍時(shí)大部分的囊胚可能處于3期階段，這給臨床準(zhǔn)備內(nèi)膜條件帶來(lái)一定的不確定性，而且細(xì)胞體積較大以及部分孵出狀態(tài)會(huì)在一定程度上影響最終的冷凍效果，這可能是臨床結(jié)局相對(duì)較低的主要原因。

表2 臨床結(jié)局在常規(guī)活檢組與非提前打孔組的比較[n(%)]

注：與常規(guī)活檢組比較，*P<0.05

總之，使用新的囊胚活檢方法可以使得囊胚活檢變得更加簡(jiǎn)單，使活檢操作人員對(duì)活檢時(shí)機(jī)把握得更加明確，并且在一定程度上改善了移植胚胎的臨床結(jié)局。

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[編輯：羅宏志]

A novel method making blastocyst biopsy simple and controllable

WUKe-liang

ReproductiveHospitalAffiliatedtoShandongUniversity，Jinan250001

Blastocyst biopsy is a prerequisite for PGD & PGS and single gene disorder diagnosis. At present，zona pellucida opening and partially trophectoderm (TE) cell hatching are needed before blastocyst biopsy. It causes that blastocyst hatching time is uncertain，and the inner cell mass is in abnormal position，or blastocyst is hatched prematurely. All these bring the difficulties to blastocyst biopsy，and may also affect the final clinical outcome of biopsied blastocyst transplantation. The new blastocyst biopsy method does not need zona pellucida opening before biopsy，only utilizes the zona pellucida binding force itself to reduce the laser wound，which makes biopsy more simple and controllable，and also improves the clinical outcomes of biopsied blastocyst transfer to some extent.

Blastocyst biopsy； Zona pellucida opening； Blastocyst hatching； Inner cell mass

10.3969/j.issn.1004-3845.2017.04.006

2017-01-18；

2017-02-19

默克雪蘭諾中國(guó)生殖醫(yī)學(xué)研究基金(2015)

吳克良，男，江蘇鹽城人，博士，副研究員，發(fā)育生物學(xué)專業(yè).