宋玉霞 趙濤 張瑋璨 郭清 王宏衛(wèi) 孟桐羽

·論著·

卵巢癌細(xì)胞系SKOV3培養(yǎng)上清對(duì)巨噬細(xì)胞共刺激分子的影響

宋玉霞 趙濤 張瑋璨 郭清 王宏衛(wèi) 孟桐羽

目的 研究卵巢癌細(xì)胞系SKOV3培養(yǎng)上清處理巨噬細(xì)胞后,巨噬細(xì)胞亞型的改變，以及CD80、CD86、CD40在不同巨噬細(xì)胞亞型上表達(dá)的差異。方法 Ficoll 密度梯度法分離健康成人外周血單個(gè)核細(xì)胞，GM-CSF誘導(dǎo)為巨噬細(xì)胞(M0)后，用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SKOV3細(xì)胞培養(yǎng)上清處理14 d后，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)巨噬細(xì)胞亞型的改變及不同亞型細(xì)胞CD80、CD86和CD40的表達(dá)情況。結(jié)果 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示，用SKOV3細(xì)胞培養(yǎng)上清培養(yǎng)巨噬細(xì)胞14 d后，巨噬細(xì)胞主要向CD163-M2型巨噬細(xì)胞分化[M1/M2=(12.37±1.76)%/(22.23±2.21)%]。CD163-M2型巨噬細(xì)胞CD40的表達(dá)較CD64-M1型顯著降低，2組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而CD80、CD86的表達(dá)無(wú)明顯改變，2組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論SKOV3細(xì)胞培養(yǎng)上清刺激后的巨噬細(xì)胞向不同巨噬細(xì)胞亞型分化；M2型巨噬細(xì)胞較M1型巨噬細(xì)胞共刺激分子表達(dá)下調(diào)，提示這些共刺激分子在巨噬細(xì)胞的活化及免疫應(yīng)答過(guò)程中很重要，可能與腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸有關(guān)。

卵巢癌；M2型巨噬細(xì)胞；CD80/CD86/CD40

卵巢癌是婦科腫瘤中惡性程度最高的疾病，腹膜轉(zhuǎn)移是晚期卵巢癌的特征之一。晚期卵巢癌患者腹水微環(huán)境的浸潤(rùn)細(xì)胞包括內(nèi)皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等等，其中巨噬細(xì)胞是含量最豐富的免疫細(xì)胞。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，M2型巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量和卵巢癌預(yù)后有顯著的相關(guān)性[1]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在卵巢癌晚期患者腹水中，主要是M2型巨噬細(xì)胞，而非M1型巨噬細(xì)胞。這提示M2型巨噬細(xì)胞在腫瘤的增殖及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，M1型巨噬細(xì)胞和M2型在某些細(xì)胞因子的表達(dá)上有所差異[2]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究CD68、CD80及CD40在M1型巨噬細(xì)胞和M2型巨噬細(xì)胞表達(dá)的差異，初步篩選出腫瘤細(xì)胞中的關(guān)鍵分子靶點(diǎn)，為解釋卵巢癌的腹腔播散和轉(zhuǎn)移提供新的線索，并為卵巢癌分子靶點(diǎn)的干預(yù)策略提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 1640培養(yǎng)基，卵巢癌細(xì)胞系SKOV3。

1.2 方法

1.2.1 采集健康成人外周血，F(xiàn)icoll 密度梯度法收集中間層單個(gè)核細(xì)胞(1 000 r/min，20 min，23℃)， PBS重懸后再次離心 (800 r/min，7 min，23℃)。

1.2.2 巨噬細(xì)胞培養(yǎng)：細(xì)胞以不含血清的RPMI1640重懸后種于100 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿，細(xì)胞種植密度為1.0×106/ml，培養(yǎng)箱中靜置 2 h 使細(xì)胞貼壁，用預(yù)熱的PBS潤(rùn)洗3次， 除去懸浮細(xì)胞。加入10%FBS-RPMI1640和GM-CSF，置入37℃,5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，備用。

1.2．3 用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SKOV3細(xì)胞培養(yǎng)上清處理14 d后，以免疫熒光的方式鑒定分離培養(yǎng)巨噬細(xì)胞純度。細(xì)胞刮輕刮培養(yǎng)皿收集巨噬細(xì)胞，離心收集細(xì)胞沉淀1 200 r/min， 5 min，23℃。棄上清，以CD68抗體標(biāo)記巨噬細(xì)胞，37℃，1 h。PBS洗滌3遍，標(biāo)記熒光二抗，37℃，1 h。PBS洗滌3遍，Hocest染核5 min。PBS洗滌3遍，熒光顯微鏡觀察，統(tǒng)計(jì)。

1.2.4 SKOV3細(xì)胞培養(yǎng)上清培養(yǎng)巨噬細(xì)胞：用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SKOV3細(xì)胞培養(yǎng)上清處理M0巨噬細(xì)胞14 d。

1.2.5 巨噬細(xì)胞各亞型比例的檢測(cè)：以CD64作為M1型巨噬細(xì)胞的表面標(biāo)記，以CD163作為M2型巨噬細(xì)胞的表面標(biāo)記。收集細(xì)胞，取1.0×106個(gè)細(xì)胞，標(biāo)記上述熒光抗體，流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)M1、M2所占百分。

1.2.6 巨噬細(xì)胞CD80、CD86和CD40的表達(dá)的檢測(cè)：收集SKOV3細(xì)胞培養(yǎng)上清處理14 d后的細(xì)胞，取1.0×106個(gè)細(xì)胞，標(biāo)記熒光抗體M1、M2及CD80、CD86和CD40，流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)M1、M2中CD80、CD86和CD40的表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)巨噬細(xì)胞表面標(biāo)記(CD64，CD163)表達(dá)情況SKOV3細(xì)胞培養(yǎng)上清培養(yǎng)巨噬細(xì)胞14d后，M1型巨噬細(xì)胞占(12.37±1.76)%，M2型巨噬細(xì)胞占(22.23±2.21)%，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。由此可見(jiàn)，SKOV3細(xì)胞培養(yǎng)上清培養(yǎng)巨噬細(xì)胞14d后，M0主要向M2型巨噬細(xì)胞分化。見(jiàn)圖1。

2.2 不同巨噬細(xì)胞亞型中，CD80、CD86和CD40表達(dá)的檢測(cè)SKOV3細(xì)胞培養(yǎng)上清培養(yǎng)巨噬細(xì)胞14d后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同細(xì)胞因子的表達(dá)情況，結(jié)果如下圖。CD80在CD64-M1、CD64-M2上表達(dá)所占百分比分別為：(7.50±1.10)%、(6.60±0.98)%，2組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；CD86在CD64-M1、CD64-M2上表達(dá)所占百分比分別為：(10.53±1.52)%、(10.30±1.50)%，2組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；CD40在CD64-M1、CD64-M2上表達(dá)所占百分比分別為：(10.22±1.10)%、(2.50±0.32)%，2組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2、3。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)巨噬細(xì)胞表面標(biāo)記(CD64，CD163)表達(dá)情況

圖2 不同巨噬細(xì)胞亞型中，CD80、CD86和CD40的表達(dá)的檢測(cè)

圖3 不同巨噬細(xì)胞亞型中，CD80、CD86和CD40的表達(dá)的檢測(cè)

3 討論

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)腫瘤中死亡率最高的疾病。近年來(lái)，對(duì)于惡性腫瘤的治療出現(xiàn)了一些分子靶向治療藥物，像Herceptin,Gleevec,Sorafenib等。但是卵巢癌的分子靶向治療藥物仍未獲得突破性進(jìn)展。分子靶向藥物在臨床應(yīng)用中暴露的一些問(wèn)題使得人們逐漸把目光轉(zhuǎn)移到生物免疫治療上來(lái)。腹腔巨噬細(xì)胞與卵巢癌腫瘤細(xì)胞相互作用的研究，對(duì)揭示卵巢癌惡性表型有重要意義，同時(shí)還能對(duì)卵巢癌的免疫治療提供理論基礎(chǔ)。卵巢癌與免疫微環(huán)境相互作用的研究與日俱增，為闡明卵巢癌惡性表型機(jī)制提供新的線索。

研究發(fā)現(xiàn)：腹腔微環(huán)境對(duì)卵巢的進(jìn)展與播散用重要作用，晚期卵巢癌患者多有惡性腹水形成，腹水中富含腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAM)，TAM對(duì)卵巢癌耐藥與播散有重要意義[1]。在晚期惡性腹水中分離出的腫瘤TAM高表達(dá)CD163，這種CD163的高表達(dá)與卵巢癌的早期復(fù)發(fā)和腹水IL-6、IL-10的表達(dá)水平相關(guān)。朱亞飛等[2]研究發(fā)現(xiàn)：卵巢癌組織中存在M0向M2型的分化，且M2細(xì)胞比例是卵巢癌預(yù)后不良的預(yù)測(cè)因素。M2細(xì)胞百分比是卵巢癌預(yù)后的負(fù)相關(guān)因素,M1、M2密度與卵巢癌預(yù)后無(wú)關(guān)。而卵巢癌組患者生存率曲線顯示,M2密度及M2細(xì)胞百分比與患者生存時(shí)間有關(guān)。可見(jiàn)M2細(xì)胞比例是影響卵巢癌預(yù)后的因素。

張婷等[3]研究發(fā)現(xiàn)：EOC腹膜內(nèi)激活的因子與浸潤(rùn)TAM相互作用關(guān)系,提示EOC微環(huán)境內(nèi) 激活的因子可能是誘導(dǎo)外周血單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞(MO/MA)分化和極化為M2型細(xì)胞的一個(gè)新的分子,表明EOC微環(huán)境中凝血系統(tǒng)的因子除直接作用腫瘤細(xì)胞外,還通過(guò)作用于基質(zhì)內(nèi)巨噬細(xì)胞促進(jìn)腫瘤的侵襲、浸潤(rùn)及血管生成。很有可能凝血因子與在EOC種植灶附近MO/MA相互作用產(chǎn)生的趨化因子、細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)為腫瘤細(xì)胞沿腹膜表面種植鋪平了道路。另研究發(fā)現(xiàn)：卵巢癌惡性進(jìn)展與卵巢癌微環(huán)境密切相關(guān)，通過(guò)構(gòu)建腹腔炎性環(huán)境老鼠模型，人卵巢癌腹腔注射，觀察腹腔炎性環(huán)境對(duì)卵巢癌進(jìn)展的影響，發(fā)現(xiàn)腹腔炎性環(huán)境能夠促進(jìn)卵巢的腹腔播散和腹水形成[4]。并且這種現(xiàn)象和腹腔巨噬細(xì)胞，間皮細(xì)胞分泌的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)密切相關(guān)。

值得注意的是Tanaka等[5]在對(duì)89例卵巢癌患者的回顧性研究中發(fā)現(xiàn):TAMs分泌的Bikunin是一種Kunitz-type蛋白酶抑制劑,通過(guò)下調(diào)uPA的表達(dá),為無(wú)瘤生存率(P=0.040)和總生存期(P=0.042)提高的一項(xiàng)獨(dú)立的預(yù)后因素。這個(gè)結(jié)果與上述其他研究對(duì)TAMs在腫瘤預(yù)后上的結(jié)論不一。

宿主抗腫瘤免疫反應(yīng)可明顯改善卵巢癌患者的預(yù)后及生存率，通過(guò)加強(qiáng)卵巢癌患者的宿主抗腫瘤免疫反應(yīng)，可顯著影響卵巢癌患者的預(yù)后[6]。已有研究表明，M2型巨噬細(xì)胞可以減弱急性期炎癥反應(yīng)，抑制免疫應(yīng)答，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖及遷移能力，并能夠誘導(dǎo)局部免疫耐受狀態(tài)[7]。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)可以發(fā)現(xiàn)，用SKOV3培養(yǎng)上清處理后的巨噬細(xì)胞，除了亞型轉(zhuǎn)變之外，還有共刺激分子(CD86、CD80、CD40)的改變，這些共刺激分子在巨噬細(xì)胞的活化及免疫應(yīng)答過(guò)程中很重要，共刺激分子表達(dá)降低會(huì)導(dǎo)致巨噬細(xì)胞不能產(chǎn)生殺傷腫瘤細(xì)胞，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸。其中表達(dá)降低的主要是CD40。CD40可以促進(jìn)凋亡和Fas基因的表達(dá)，并且可以加強(qiáng)抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用。

在單核巨噬細(xì)胞中，CD40與CD40的受體CD40L結(jié)合后可上調(diào)其表面的CD54、CD80、CD86及MHCII的表達(dá)，增強(qiáng)抗原遞呈的作用[8],這也可能是該實(shí)驗(yàn)中CD86在M2型巨噬細(xì)胞的表達(dá)與M1型巨噬細(xì)胞無(wú)明顯差異的原因；CD40-CD40L還可以促進(jìn)IL-6、IL-8、IL-12和MMPs的分泌[9]?；罨腡h2細(xì)胞高表達(dá)CD40L,可與B細(xì)胞表面的CD40結(jié)合,產(chǎn)生B細(xì)胞活化的第二信號(hào),協(xié)同刺激B細(xì)胞活化、增殖和分化成漿細(xì)胞并產(chǎn)生抗體，如果CD40-CD40L的相互反應(yīng)中斷可誘導(dǎo)B細(xì)胞的免疫耐受[10]。CD40 與腫瘤血管形成有關(guān),可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[11]。然而,CD40-CD40L結(jié)合反應(yīng)可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,促進(jìn)抗原提呈細(xì)胞的活化,產(chǎn)生抗腫瘤的免疫反應(yīng)。CD40L可抑制IL-10和TGF-β的產(chǎn)生,誘導(dǎo)腫瘤部位的Th1反應(yīng),進(jìn)而抑制腫瘤的發(fā)生[12]。激活的T細(xì)胞通過(guò)CD40-CD40L反應(yīng)調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞上MMPs表達(dá)，內(nèi)皮細(xì)胞上CD40的表達(dá)又可誘導(dǎo)上皮細(xì)胞MMP-9表達(dá)，提高M(jìn)MP-1和MMP-3的水平，激活MMP-2。內(nèi)皮細(xì)胞上CD40的表達(dá)可引起血管重建，從而為腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移提供物質(zhì)基礎(chǔ)[13]。原發(fā)性和復(fù)發(fā)性卵巢癌組織以及卵巢癌腹水中均可檢測(cè)到CD40，腹水中CD40含量明顯高于實(shí)體腫瘤組織中CD40的表達(dá)，在原發(fā)性卵巢癌中的表達(dá)又明顯高于復(fù)發(fā)卵巢癌組織[14]。因此，CD40表達(dá)水平的檢測(cè)可作為復(fù)發(fā)卵巢癌檢測(cè)的指標(biāo)之一。CD40在腫瘤的基因治療中已得到越來(lái)越多的應(yīng)用。CD40、CD40L以及CD40/CD40L的結(jié)合反應(yīng)與癌細(xì)胞間作用的分子機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜，需要進(jìn)一步研究來(lái)闡明它們之間的關(guān)系。

目前，不同學(xué)者對(duì)TAM與卵巢癌的相互作用提出各自看法，基本集中在腫瘤組織、腹膜、腸系膜中TAM的密度、比率或者分泌的細(xì)胞因子與卵巢癌預(yù)后的關(guān)系等方面。不同研究對(duì)TAM與卵巢癌預(yù)后關(guān)系也說(shuō)法不一。對(duì)其研究多停留在與預(yù)后關(guān)系的報(bào)道，但相互作用的具體機(jī)制、特異的分子靶點(diǎn)報(bào)道較少，而這正是指導(dǎo)免疫靶向治療的關(guān)鍵，是有待我們進(jìn)一步闡明的問(wèn)題。

1ReinartzS,SchumannT,FinkernagelF,etal.Mixed-polarizationphenotypeofascites-associatedmacrophagesinhumanovariancarcinoma:correlationofcd163expression,cytokinelevelsandearlyrelapse.IntJCancer,2014,134:32-42.

2 朱亞飛,胡愛(ài)民,張振東,等.卵巢癌組織中m2型巨噬細(xì)胞密度變化及其與卵巢癌預(yù)后的關(guān)系.山東醫(yī)藥,2011,51:7-9.

3 張婷,馬政文,王穎,等.凝血因子Ⅱ可誘導(dǎo)單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分化為卵巢癌腹膜內(nèi)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞.中國(guó)實(shí)用婦科與產(chǎn)科雜志,2009,4:29-32.

4Robinson-SmithTM,IsaacsohnI,MercerCA,etal.macrophagesmediateinflammation-enhancedmetastasisofovariantumorsinmice.CancerRes,2007,67:5708-5716.

5TanakaY,KobayashiH,SuzukiM,etal.Upregulationofbikuninintumor-infiltratingmacrophagesasafactoroffavorableprognosisinovariancancer.GynecolOncol,2004,94:725-734.

6Mantia-SmaldoneGM,ChuCS.immunotherapyinovariancancer.HumVaccineImmunother,2012,8:1179-1191.

7AlbertoMantovani,PaolaAllavena,AntonioSica,etal.Cancer-relatedinflammation.Nature,2008,454:436-444.

8Feder-MengusC,Schultz-ThaterE,OertliD,etal.NonreplicatingrecombinantvacciniavirusexpressingCd40ligandenhancesapccapacitytostimulatespecificCd4+andCd8+Tcellresponses.HumGeneTher,2005,16:348-360.

9ScottK,ManuntaM,GermainC,etal.Qualitativelydistinctpatternsofcytokinesarereleasedbyhumandendriticcellsinresponsetodifferentpathogens.Immunology,2005,116:245-254.

10LoskogA,DzojicH,VikmanS,etal.AdenovirusCd40ligandgenetherapycounteractsimmuneescapemechanismsinthetumorenvironment.JImmunol,2004,172:7200-7205.

11ThorstenV,KatherineC,WoodR,etal.DifferentialexpressionandregulationofmurineCd40inregionalvascularbeds.AmericanJournalofPhysiology.HeartandCirculatoryPhysiology,2006,290:631-639.

12AndradeRM,WessendarpEA.Tnfreceptor-associatedfactor6-dependentCd40signalingprimesmacrophagestoacquireantimicrobialactivityinresponsetotnf-alpha.TheJournalofImmunology,2005,175:6014-6021.

13Smola-HessS,SchnitzlerR,HadaschikD,etal.Cd401inducesmatrix-metalloproteinase-9butnottissueinhibitorofmetalloproteinases-1incervicalcarcinomacells:imbalancebetweennf-kappabandstat3activation.Experimentalcellresearch,2001,267:205-215.

14CiaravinoG,BhatM,ManbeianCA,etal.Differentialexpressionofcd40andCd95inovariancarcinoma.Europeanjournalofgynaecologicaloncology,2004,25:27-32.

Effects of culture supernatant of ovarian cancer cell line-SKOV3 on costimulatory molecules of macrophages

SONGYuxia*,ZHAOTao*,ZHANGWeican,etal.

*DepartmentofObstetricsandGynecology,TheFirstHospitalofShijiazhuang,Shijiazhuang050011,China

Objective To investigate the changes of subtypes of macrophage treated by culture supernatant of ovarian cancer cell line-SKOV3 in vitro,and to explore the differences of expressions of CD80,CD86,CD40 in different subtypes of macrophage.Methods The peripheral blood mononuclear cells were separated from healthy adults by Ficoll density gradient method,which were induced into macrophages by GM-CSF.Then the macrophages were cultured in supernatant of SKOV3 ovarian cancer cells at exponential growth phase for 14 days. The changes of subtypes of macrophage and the expression levels of CD80,CD86,CD40 in different subtypes of macrophages were detected by flow cytometry.Results The examination results by flow cytometry showed that after the macrophages were treated in supernatant of SKOV3 ovarian cancer cells for 14 days, the macrophages were mainly differentiated into CD163-M2 subtype macrophages [M1/M2=(12.37±1.76)%/(22.23±2.21)%]. The expression levels of CD40 in CD163-M2 subtype macrophages were significantly decreased,as compared with those in CD64-M1 subtype macrophage (P<0.05).HowevertherewerenosignificantdifferencesintheexpressionlevelsofCD80andCD86betweentwogroups(P>0.05).Conclusion After the macrophages are treated in culture supernatant of SKOV3 ovarian cancer cells,which are differentiated into different subtypes.Moreover the expression levels of costimulatory molecules are down-regulated in M2 subtype macrophages,as compared with those in M1 subtype macrophages ,which suggests that these costimulatory molecules play an important role in activation of macrophages and immune response,which may be correlated to immune escape of tumor cells.

ovarian carcinoma;M2 subtype macrophages; CD80/CD86/CD40

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.08.006

050011 河北省石家莊市第一醫(yī)院婦產(chǎn)科(宋玉霞、趙濤、郭清、王宏衛(wèi)、孟桐羽)；河北醫(yī)科大學(xué)(張瑋璨)

郭清，050011 河北省石家莊市第一醫(yī)院婦產(chǎn)科；

E-mail:syx810511@126.com

R

A

1002-7386(2017)08-1144-04

2016-12-13)