劉益山 許凌成都市成華區(qū)疾病預(yù)防控制中心 （四川 成都610051）

液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定蔬菜中2種極性農(nóng)藥殘留量

劉益山 許凌＊成都市成華區(qū)疾病預(yù)防控制中心 （四川 成都610051）

建立同時(shí)測(cè)量百草枯、單甲脒2種極性農(nóng)藥的液相色譜—串聯(lián)質(zhì)普測(cè)定方法，采用SCX和C18（質(zhì)量比為1:20）復(fù)合材料的Shiseido CAPCELL PAK CR色譜柱分離，最后采用高壓液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè)。對(duì)質(zhì)譜條件及色譜條件進(jìn)行優(yōu)化處理，蔬菜樣品采用甲酸—乙腈溶液均質(zhì)進(jìn)行提取，三氯甲烷去除色素，并在定量限1、20、10倍濃度水平處理，其中百草枯回收率在61.8%～97.0%，單甲脒62.2%～100.0%，且測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤5.61%。該方法簡(jiǎn)單快速，可用于蔬菜極性農(nóng)藥中百草枯、單甲脒等殘留量的測(cè)定。

百草枯 單甲脒 蔬菜 液相色譜—串聯(lián)質(zhì)普法 極性農(nóng)藥殘留

農(nóng)藥殘留是在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中一部分農(nóng)藥在使用過(guò)程中直接或間接殘存于農(nóng)作物以及土壤或水體中[1]。蔬菜中較為常見(jiàn)的6種極性農(nóng)藥依次分為兩大類，一類是常見(jiàn)的季銨鹽類農(nóng)藥，代表極性農(nóng)藥為百草枯、敵草快、矮壯素、縮節(jié)胺，此類農(nóng)藥易溶于水，在堿性條件下化學(xué)性質(zhì)極不穩(wěn)定[2～3]；另一類代表農(nóng)藥為單甲脒、滅蠅胺[4]，兩者屬于強(qiáng)堿極性陽(yáng)離子有機(jī)化合物，屬易溶于水等極性溶液，極性農(nóng)藥熱穩(wěn)定好，不易揮發(fā)[5～6]。

百草枯化學(xué)名1-1，二甲基-4-4-聯(lián)吡啶陽(yáng)離子鹽，因具有一定的內(nèi)吸作用及觸殺作用，可迅速被植物綠色部位快速吸收并枯萎，是用量?jī)H次于草甘膦的全球第二大除草劑，但該農(nóng)藥對(duì)非綠色組織沒(méi)有作用，經(jīng)噴灑后雖能迅速與土壤結(jié)合鈍化，但對(duì)植物根部、宿根等無(wú)效。大鼠等動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示具有極高致死率，成人預(yù)計(jì)致使量為40mg/kg，因百草枯可通過(guò)皮膚、呼吸道、消化道等進(jìn)入機(jī)體產(chǎn)生危害；單甲脒化學(xué)名N-（2,4-二甲基苯）-N’甲基甲脒鹽酸鹽，具有相當(dāng)強(qiáng)的殺蚜活性，在柑橘、蘋(píng)果、棉花等作物有效預(yù)防棉蚜，故需進(jìn)行緊密檢測(cè)，保證質(zhì)量安全。目前蔬菜百草枯殘留量檢測(cè)法是紫外線分光光度法，但該方法不具有專屬性，且操作較為復(fù)雜，受基質(zhì)干擾多，而蔬菜中殘留農(nóng)藥并非百草枯一種，故大多數(shù)研究者傾向于液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)測(cè)定食品中農(nóng)藥殘留量，對(duì)極性殘留農(nóng)藥采取離子對(duì)試劑或親水色譜柱進(jìn)行色譜分離，在復(fù)雜機(jī)制樣品農(nóng)藥殘留分析中具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。本研究采用SCX和C18復(fù)合位固定相的反相色譜柱分離后再進(jìn)行色譜分離，可避免親水色譜柱高濃度緩沖鹽影響質(zhì)譜靈敏度，以此建立蔬菜中極性農(nóng)藥殘留量的快速測(cè)定法，具體實(shí)驗(yàn)步驟如下。

1.實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

液質(zhì)聯(lián)用儀：TSQ—Quantiva型，配有ESI離子源，由美國(guó)Waters科技有限公司生產(chǎn)；

高速組織勻漿機(jī)：IKA—T25型，由德國(guó)IKA公司生產(chǎn)；

超純水機(jī)：Milli—Q型，由美國(guó)Millipore公司生產(chǎn)；

渦旋混勻器：Vortex—Genie 2型，美國(guó)Scientific Industries公司生產(chǎn)；

常速離心機(jī)：TDL—5—A型，上海安亭公司生產(chǎn)；

高速離心機(jī)：5430R型，德國(guó)Eppendorf公司生產(chǎn)；

百草枯、單甲脒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：由德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司生產(chǎn)；

乙腈、甲醇：色譜純，純度≥99.9%，由德國(guó)Merck公司生產(chǎn)；

三氯甲烷、乙酸烷：色譜純，上海安普公司生產(chǎn)；實(shí)驗(yàn)用水由Milli—Q超純水機(jī)獲得。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別稱取百草枯、單甲脒標(biāo)準(zhǔn)樣品各10mg于10ml容量瓶中并溶解，制得1.0mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置于-18?C冷藏、標(biāo)準(zhǔn)中間液用水稀釋儲(chǔ)存?zhèn)溆靡褐吝m當(dāng)濃度備用。

甲酸—乙腈提取液：分別量取50mL甲酸，加入250ml乙腈，并用清水溶解至1000 mL，注意要現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件：色譜柱：Shiseido CAPCELL PAK CR柱（150 mm×2.1 mm，3.5 μm）；柱溫：30?C；流動(dòng)相A是99%乙腈，B為乙酸銨（含0.1%甲酸），梯度洗脫程度見(jiàn)表1。

1.2.2 質(zhì)譜條件

正模式掃描：選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)（SRM）；毛細(xì)管電壓：3500V；霧化氣壓力：276 KPa（20 psi）；離子傳輸管溫度：350?C；霧化氣溫度：400?C。百草枯：母離子171.0，子離子與母離子構(gòu)成定量離子對(duì)為77.1/155.125，碰撞能量38、32eV，透鏡電壓71V；單甲脒：母離子163.05，子離子與母離子構(gòu)成定量離子對(duì)為107.15/122.175，碰撞能量27、18eV，透鏡電壓49V。

1.3 試驗(yàn)方法

稱取試樣10.0g于50mL離心管中，并加入10mL甲酸—乙腈提取液。高速勻漿1min，隨后加入10mL三氯甲烷，以4500 r/min離心5min，將上層清液全數(shù)移至25mL比色管中，殘?jiān)屑尤?0mL甲酸—已經(jīng)提取液，渦旋提取30s后，以1500r/min離心5min，合并上層清液至25mL比色管，用甲酸—乙腈提取液定容至標(biāo)線，混合均勻，取1mL甲酸—乙腈提取液于1.5mL離線管中，以15000r/min離心5min，上層清液過(guò)0.22 μm濾膜，采用液相色譜—串聯(lián)質(zhì)普測(cè)定。

表1.梯度洗脫程序

表2.兩種農(nóng)藥在蔬菜樣品中的線性方程及相關(guān)檢出限

表3.回收率及精密實(shí)驗(yàn)

2.結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

百草枯屬?gòu)?qiáng)極性化合物，單甲脒結(jié)構(gòu)中含有氨基結(jié)構(gòu)，兩者在質(zhì)譜離子化時(shí)可形成正離子，故進(jìn)行質(zhì)譜優(yōu)化時(shí)可使用針泵入1.0μ/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，設(shè)定為0.3mL/min的流量，等比例注入流動(dòng)相A和流動(dòng)相B，調(diào)節(jié)質(zhì)譜源參數(shù)，在以及母離子掃描方式下使用化合物的母離子響應(yīng)值可達(dá)最高，在子離子掃描方式下，可通過(guò)調(diào)節(jié)不同的碰撞能量獲得較為理想的碎片離子信息，再利用儀器自動(dòng)優(yōu)化功能，優(yōu)化最佳碰撞能量和透鏡電壓。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

百枯草分子極性較強(qiáng)，在反相色譜柱中難以保存，一般加入七氟丁酸、庚烷磺酸鈉等離子對(duì)試劑，雖可改善其在反相色譜柱中的色譜行為，同時(shí)可造成質(zhì)譜靈敏度下降，本研究選擇CAPCELLPAK CR色譜柱，由SCX和反相C18填料組成固定相；未避免百草枯死吸附現(xiàn)象出現(xiàn)，選擇SCX和C18填料為1:20的CR柱，采用含有5 mmol/L的乙酸銨溶液流動(dòng)相，并優(yōu)化梯度洗脫程序，顯示2種農(nóng)藥分離較為理想，色譜峰型尖銳，未出現(xiàn)干擾峰。

2.3 質(zhì)普條件的選擇

百草枯、單甲脒呈堿性，易溶于水，可采用酸性提取液提取，而蔬菜含色素較多，故采用甲酸溶液均質(zhì)提取，加入乙腈沉淀纖維，用三氯甲烷除去色素。因兩種農(nóng)藥的堿性和極性有一定差異，甲酸溶液的濃度及乙腈的加入量均可影響目標(biāo)物的提取效率。本次研究通過(guò)對(duì)兩種化合物的回收率為響應(yīng)值，對(duì)甲酸溶液的濃度和乙腈—水比例進(jìn)行2因素5水平響應(yīng)面中心組合試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)甲酸溶液的濃度及乙腈用量對(duì)提取效率均有影響，百草枯回收率較低，乙腈用量和甲酸溶液濃度對(duì)其回收率影響不明顯，單甲脒隨著乙腈用量增加其回收率明顯下降，最終確定采用含5%甲酸—乙腈水溶液（體積比25:75）作為本研究的提取液。2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和檢出限

以上述優(yōu)化方案對(duì)蔬菜試驗(yàn)樣品進(jìn)行加標(biāo)試驗(yàn)，以待測(cè)物信噪比（S/N）為10確定研究方法的定量限。質(zhì)譜法測(cè)定時(shí)會(huì)有基質(zhì)效應(yīng)，百草枯的絕對(duì)回收率較低，故本研究采用基質(zhì)添加匹配標(biāo)準(zhǔn)工作曲線進(jìn)行定量，兩種極性農(nóng)藥的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限等參數(shù)見(jiàn)表2。2.5回收率及精密實(shí)驗(yàn)

向陰性蔬菜樣品中加入1、2、10倍定量限水平進(jìn)行回收試驗(yàn)，每個(gè)水平可多次重復(fù)，取平均值，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3。

3.結(jié)語(yǔ)

目前針對(duì)該類藥物的農(nóng)藥檢測(cè)法包括氣相色譜-電子補(bǔ)獲檢測(cè)器（GC-ECD）檢測(cè)法、液相色譜法、液相色譜法-串聯(lián)質(zhì)普法（LC-MS/MS）等方法，因氣相色譜-電子補(bǔ)獲檢測(cè)法檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，且檢測(cè)過(guò)程中易受到雜質(zhì)干擾，而建立液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測(cè)新鮮蔬菜的殘留農(nóng)藥，使用陽(yáng)離子交換和反相填料的色譜柱進(jìn)行分離，對(duì)季銨鹽類極性農(nóng)藥百草枯保留效果較高，且采用甲酸—乙腈水溶液提取，三氯甲烷取出色素，優(yōu)化研究步驟，提高靈敏度，操作步驟簡(jiǎn)單。本研究結(jié)果顯示百草枯在蔬菜樣品中絕對(duì)回收率低于單甲脒，分析原因可能是百草枯在土壤中容易被鈍化，容易受到樣品中金屬離子影響導(dǎo)致絕對(duì)回收率下降?？傮w來(lái)說(shuō)，該方法具有樣品處理簡(jiǎn)單快速、靈敏度高、測(cè)定周期短等優(yōu)點(diǎn)，可作為食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)的檢測(cè)手段。

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1006-6586(2017)04-0018-02

S481.8

A

許凌。