張展，徐娜，李愛萍，劉慧，王媛媛

(鄭州大學第三附屬醫(yī)院,鄭州 450052)

MiR-34a對JAR細胞自噬影響的機制

張展，徐娜，李愛萍，劉慧，王媛媛

(鄭州大學第三附屬醫(yī)院,鄭州 450052)

目的 探討miR-34a對人胎盤絨毛癌細胞JAR細胞自噬影響的機制。方法 選取JAR細胞，隨機分為miR-34a 模擬物組(轉染miR-34a 模擬物)、NC組(轉染模擬物陰性對照)、miR-34a抑制物組(轉染miR-34a抑制物)、INC組(轉染抑制物陰性對照)、空白對照組(只加Lipofectamine 2000)、缺氧組(300 μmol/L氯化鈷處理)和正常組(未經(jīng)氯化鈷處理)。采用Real time PCR法檢測各組miR-34a及HMGB1 mRNA表達，Western blotting法檢測各組HMGB1和LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達,透射電鏡檢測各組細胞中自噬小體形成情況。結果 miR-34a模擬物組中HMGB1 mRNA和蛋白表達水平較NC組降低(P<0.05)，miR-34a抑制物組中HMGB1 mRNA和蛋白表達較INC組高(P<0.05)。缺氧組中HMGB1和LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達較正常組升高。缺氧處理后miR-34a模擬物組中 HMGB1和LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白的相對表達量較INC組降低(P<0.05)，miR-34a抑制物組中HMGB1和LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白的相對表達量較INC組升高(P<0.05)。透射電鏡結果顯示，缺氧組自噬小體的數(shù)量較正常組明顯增加(P<0.05)，缺氧處理后miR-34a模擬物組細胞中自噬小泡數(shù)量較NC組減少(P<0.05)，miR-34a抑制物組細胞中自噬小泡數(shù)量較INC組增加(P<0.05)。結論 miR-34a可能通過抑制HMGB1表達影響滋養(yǎng)細胞的自噬。

子癇前期；JAR細胞；自噬；微小RNA-34a

子癇前期(PE)是常見的妊娠期并發(fā)癥之一，嚴重危害母親和胎兒健康[1]。目前，關于PE的病因及發(fā)病機制尚不完全清楚。研究指出，絨毛膜外滋養(yǎng)細胞(EVTs)侵襲障礙導致PE的病理生理學改變[2]，而EVTs的侵襲能力又受到細胞自噬的影響。自噬是細胞回收胞質成分的一種降解系統(tǒng)[3]，是維持細胞穩(wěn)態(tài)的一種機制，在營養(yǎng)缺乏、缺氧、應激等條件下，通過胞質內成分的再利用給細胞補充營養(yǎng)，并選擇性地降解受損的細胞器。目前人類胎盤疾病中自噬的研究不多。Soo-Young等[4]研究發(fā)現(xiàn)，PE患者的胎盤組織中，自噬相關蛋白LC3Ⅱ的表達水平升高，滋養(yǎng)細胞的過度自噬導致細胞功能受損致自噬性細胞死亡，影響滋養(yǎng)細胞的侵襲能力[5]。microRNA(miRNAs)是一類長度約22個核苷酸大小的內源性非編碼小RNA，不完全互補地結合到靶mRNA的3'端非編碼區(qū)，通過抑制翻譯或裂解靶mRNA從而調節(jié)轉錄后的基因表達。miRNAs的異常表達與人類多種疾病相關，如癌癥、炎癥和心血管疾病[6]。研究發(fā)現(xiàn)，諸多miRNAs在胎盤發(fā)育中發(fā)揮重要作用，其中包括miR-34a。miR-34a屬于miRNA-34,位于染色體1p36。研究發(fā)現(xiàn)，miR-34a在胎盤組織中表達下調，可抑制高遷移率族蛋白(HMGB1)mRNA表達及滋養(yǎng)細胞侵襲[7]。然而，miR-34a不僅與細胞的侵襲轉移有關，還可調節(jié)細胞的自噬，但在PE中miR-34a與滋養(yǎng)細胞自噬的關系尚不清楚。HMGB1是一種非組蛋白染色體結合蛋白，具有致炎和核內轉錄功能，亦是誘導和調節(jié)細胞自噬的重要因子[8]。HMGB1在PE中表達升高，但與miR-34a和滋養(yǎng)細胞自噬的關系目前尚不清楚。2016年3月，我們觀察了miR-34a對HMGB1表達的影響及在滋養(yǎng)細胞自噬中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 選取鄭州大學第三附屬醫(yī)院的人絨毛膜癌細胞系JAR細胞作為研究對象，其生物學行為與滋養(yǎng)細胞相似。主要試劑：RPMI1640 培養(yǎng)基購自Hyclone公司，胎牛血清為杭州四季青公司產(chǎn)品，miR-34a 模擬物、miR-34a 抑制物及他們的陰性對照購自上海吉瑪公司，Opti-MEM購自GIBCO公司，Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司，TRolzon購自北京康為生物科技有限公司，RIPA細胞裂解液購自北京索萊寶科技有限公司，qPCR逆轉錄試劑盒和實時熒光定量PCR Master Mix購自日本東洋紡公司，PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。HMGB1兔抗人一抗購自Abcam公司，微管相關蛋白1輕鏈3(LC3)兔抗人一抗購自CST公司，內參β-actin 鼠抗人一抗購自Abcam公司。

1.2 miR-34a干預后JAR細胞HMGB1 mRNA及蛋白表達檢測 將細胞分為5組：miR-34a模擬物組(轉染miR-34a模擬物)、NC組(轉染模擬物陰性對照)、miR-34a抑制物組(轉染miR-34a抑制物)、INC組(轉染抑制物陰性對照)和空白對照組(只加Lipofectamine 2000)。轉染24 h后按照TRIzol的說明書提取各組總RNA，提取過程在冰上操作以防RNA降解。按逆轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄并按照實時熒光定量PCR說明書進行擴增，Real time PCR所用引物：miR-34a 上游引物：5′-ATTGCGGTGGCAGTGTCTTAGCT-3′，下游引物：5′-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3′，HMGB1上游引物5′-GAACATCCTGGCCTGTCCAT-3′，下游引物：5′-GCAAACCCACACTTCTTACCT-3′，miRNA和mRNA的內參分別采用U6和β-actin,miRNA和mRNA表達量的改變倍數(shù)采用2-ΔΔCt計算。轉染48 h后使用索萊寶的RIPA細胞裂解液提取各組細胞總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度。采用5%的濃縮膠和15%的分離膠進行電泳。蛋白上樣量為每孔20 μg。采用濕轉法將膠上的蛋白轉至硝酸纖維素膜上，HMGB1及β-actin轉膜1 h,5%脫脂奶粉室溫搖床封閉1 h,封閉結束后將膜置于雜交袋內，分別與各自的一抗，4 ℃孵育過夜。洗膜后，用熒光標記的二抗，雜交袋內室溫孵育2 h,洗膜，用ODYSSEY Clx檢測與成像系統(tǒng)進行分析。計算目的條帶與內參條帶的灰度值之比，即為目的蛋白的相對表達量。

1.3 缺氧干預后細胞中HMGB1、LC3蛋白表達及自噬小體數(shù)量檢測 將細胞分為兩組：缺氧組(300 μmol/L氯化鈷處理)和正常組(未經(jīng)氯化鈷處理)。采用Western blotting方法檢測各組細胞中HMGB1和LC3Ⅱ/Ⅰ的相對表達量；轉染后各組的細胞，去除培養(yǎng)基，PBS沖洗2～3次，刮下細胞，置于預冷的5%戊二醛固定液中4 ℃固定過夜。后經(jīng)1%鋨酸固定2 h、丙酮梯度脫水、環(huán)氧樹脂812浸透包埋，并制成70 nm超薄切片，經(jīng)枸櫞酸鉛和乙酸鈾電子染色，透射電鏡觀察并計數(shù)細胞自噬小體數(shù)量。

1.4 miR-34a干預JAR細胞后自噬小體數(shù)量檢測 將細胞分為miR-34a模擬物組、NC組、miR-34a抑制物組、INC組，轉染48 h后300 μmol/L氯化鈷處理2 h,誘導細胞產(chǎn)生自噬。提取各組細胞總蛋白，采用Western blotting方法檢測各組細胞中HMGB1和LC3Ⅱ/Ⅰ的相對表達量，按照1.3中的透射電鏡方法檢測各自細胞中自噬小體的數(shù)量。

2 結果

2.1 miR-34a對JAR細胞HMGB1 mRNA及蛋白表達的影響 Real time PCR結果顯示，miR-34a模擬物組HMGB1的mRNA水平明顯下降，miR-34a抑制物組中HMGB1的mRNA水平顯著升高，與空白對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)；Western blotting結果表明，miR-34a模擬物組，HMGB1蛋白表達明顯低于空白對照組(P<0.05)；miR-34a抑制物組中HMGB1蛋白水平明顯高于空白對照組(P均<0.05)。見表1。

表1 各組細胞中miR-34a和HMGB1 mRNA表達比較(±s)

注：與NC組和空白對照組相比，*P<0.05；與INC組和空白對照組相比，△P<0.05。

2.2 缺氧對JAR細胞中HMGB1和LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達及細胞自噬的影響 與正常組相比，缺氧組中HMGB1和LC3Ⅱ/Ⅰ的相對表達量明顯升高，分別為1.20±0.10和1.06±0.08，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；缺氧組能觀察到明顯自噬小體，而正常組很難觀察到。

2.3 miR-34a對JAR細胞自噬的影響 miR-34a模擬物組中HMGB1蛋白表達水平為0.56±0.13，低于NC組的1.04±0.43(P<0.05)；自噬相關蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ為0.48±0.02，明顯低于NC組的1.01±0.03(P<0.05)；miR-34a抑制物組中HMGB1蛋白表達水平明顯高于INC組(1.70±0.24 vs 0.82±0.17),LC3Ⅱ/LC3Ⅰ高于INC組(1.48±0.09 vs 0.99±0.06,P<0.05)。與NC組相比，miR-34a模擬物組中自噬小體數(shù)量明顯減少，與INC組相比，miR-34a抑制物組中自噬小體數(shù)量增多。

3 討論

miR-34a作為腫瘤抑制基因，在多種腫瘤發(fā)生發(fā)展中起作用，如子宮內膜癌、前列腺癌、神經(jīng)母細胞瘤和胎盤相關疾病等[9,10]。有報道顯示miR-34a在PE胎盤組織中表達降低[7]。miR-34a不僅與細胞侵襲和凋亡關系密切，亦與細胞自噬相關。自噬是細胞通過溶酶體途徑降解細胞內成分的一種代謝過程，是細胞對氧化應激及其他環(huán)境刺激的適應，有利于細胞生存[11]。在急性腎損傷、心血管疾病及前列腺癌中均發(fā)現(xiàn)miR-34a可抑制細胞自噬。本實驗結果顯示，缺氧處理后，細胞中自噬相關蛋白LC3表達水平升高，自噬小泡數(shù)量增加，說明缺氧確實可誘導JAR細胞產(chǎn)生自噬，而轉染miR-34a模擬物并缺氧處理后，LC3表達水平降低，自噬小泡數(shù)量明顯減少，缺氧誘導的自噬受到抑制，而轉染miR-34a抑制物并缺氧處理后，LC3表達水平升高，自噬小泡數(shù)量增加，缺氧誘導的自噬進一步增加，由此推測miR-34a可調節(jié)滋養(yǎng)細胞的自噬。但miR-34a通過何種分子機制調節(jié)滋養(yǎng)細胞自噬仍需進一步探究。Liu等[12]曾報道，miR-34a通過下調HMGB1抑制視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞的自噬，增強了化療誘導的視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞的凋亡，因此推測，miR-34a可能通過調節(jié)滋養(yǎng)細胞中HMGB1表達從而影響滋養(yǎng)細胞的自噬。本實驗結果顯示，轉染miR-34a模擬物后，HMGB1 mRNA水平和蛋白明顯降低，轉染miR-34a抑制物后則出現(xiàn)相反結果，推測HMGB1可能是miR-34a的靶基因。

HMGB1是一種非組蛋白的染色質結合蛋白，表達于多種類型細胞，并參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展。目前HMGB1在PE的研究中多與炎癥反應有關[9]，但最近研究表明，HMGB1在調節(jié)細胞自噬中有重要作用，HMGB1通過與自噬蛋白Beclin1結合，使Beclin1-Bcl2分離，繼而誘導自噬的發(fā)生[13]。在本實驗中，JAR細胞轉染miR-34a模擬物后，HMGB1蛋白表達表達降低同時，細胞自噬相關蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ表達亦明顯降低，細胞中自噬小泡數(shù)量明顯減少，即細胞自噬水平降低，而轉染miR-34a抑制物后，HMGB1蛋白表達升高，LC3Ⅱ/Ⅰ表達升高，自噬小泡數(shù)量增加，細胞自噬水平亦升高。表明HMGB1表達與細胞自噬相關蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ表達一致，即HMGB1蛋白的升高或降低與滋養(yǎng)細胞自噬水平一致，推測HMGB1與JAR細胞自噬相關，結合前文HMGB1可能是miR-34a的靶基因，推測miR-34a可能通過調節(jié)HMGB1表達而影響滋養(yǎng)細胞的自噬。

研究[4]表明，自噬相關蛋白LC3在PE胎盤組織中表達升高，而Beclin1降低。Saito等[14]發(fā)現(xiàn)，缺氧誘導了滋養(yǎng)細胞自噬的活化，PE的氧化應激增加使EVTs過度自噬，導致滋養(yǎng)細胞侵襲失敗、胎盤血管重建障礙。本研究結果顯示，缺氧可誘導滋養(yǎng)細胞自噬，轉染miR-34a模擬物后缺氧誘導的JAR細胞自噬受抑，而轉染miR-34a抑制物后自噬水平升高。低表達的miR-34a可能通過上調HMGB1表達致滋養(yǎng)細胞自噬增加，而滋養(yǎng)細胞自噬過度激活致滋養(yǎng)細胞發(fā)生自噬性死亡，從而使其侵襲能力降低和胎盤血管形成障礙，進而影響胎盤形成，參與PE的發(fā)生發(fā)展?？梢?，自噬不足和過度自噬均將影響滋養(yǎng)細胞功能，從而參與PE的病理生理發(fā)展。

總之，本實驗首次探究了miR-34a可能通過調節(jié)HMGB1表達影響滋養(yǎng)細胞自噬，參與PE的發(fā)病，但滋養(yǎng)細胞自噬在PE發(fā)病機制中的具體作用仍需進一步研究。

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2016-12-30)