張愛玲， 孫顯月， 盧孝璋， 李加琪， 張 豪

(1 廣東第二師范學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院/廣東高校應(yīng)用生態(tài)工程技術(shù)開發(fā)中心，廣東 廣州 510303；2華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院/廣東省農(nóng)業(yè)動物基因組學(xué)與分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510642)

豬FAM213B基因mRNA和啟動子的克隆及序列分析

張愛玲1,2， 孫顯月2， 盧孝璋2， 李加琪2， 張 豪2

(1 廣東第二師范學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院/廣東高校應(yīng)用生態(tài)工程技術(shù)開發(fā)中心，廣東 廣州 510303；2華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院/廣東省農(nóng)業(yè)動物基因組學(xué)與分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510642)

【目的】獲得豬FAM213B基因完整mRNA和啟動子序列，研究豬FAM213B基因表達(dá)，為探討母豬妊娠的建立和胚胎發(fā)育調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)?！痉椒ā客ㄟ^5′RACE和3′RACE技術(shù)，獲得基因完整mRNA序列，分析不同物種該基因氨基酸序列相似性；通過PCR克隆啟動子區(qū)，并通過雙熒光素酶報(bào)告基因載體系統(tǒng)轉(zhuǎn)染豬子宮內(nèi)膜細(xì)胞，研究其轉(zhuǎn)錄活性?！窘Y(jié)果】豬FAM213B基因mRNA全長808 bp，其中5′UTR、CDS區(qū)和3′UTR長度分別為67、 609(含終止密碼子)和132 bp(不含poly A序列)，在17～106位氨基酸之間存在硫氧還蛋白折疊結(jié)構(gòu)域；與豬FAM213B基因其他2個(gè)潛在轉(zhuǎn)錄本相比，三者都包含硫氧還蛋白折疊結(jié)構(gòu)域，但蛋白三級結(jié)構(gòu)存在較大差異；豬FAM213B氨基酸序列與山羊、牛和綿羊高度相似，相似性分別為94.03%、 93.03%和91.54%。克隆獲得2 261 bp(-2 231/+30)的基因啟動子序列，將其連接至雙熒光素酶報(bào)告基因載體，轉(zhuǎn)染豬子宮內(nèi)膜細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)獲得的啟動子片段能夠啟動下游報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄，在啟動子區(qū)存在潛在的典型NFκB等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)?！窘Y(jié)論】本研究獲得豬FAM213B基因轉(zhuǎn)錄本長度為808 bp，其蛋白存在硫氧還蛋白折疊功能結(jié)構(gòu)域，其啟動子序列(-2 231/+30)在豬子宮內(nèi)膜細(xì)胞中具有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄活性。

豬;FAM213B基因;轉(zhuǎn)錄； 啟動子; 克隆； 子宮內(nèi)膜細(xì)胞； 硫氧還蛋白

FAM213B (Family with sequence similarity 213, member B)，又稱為前列腺酰胺合成酶(Prostamide F synthase，PGFS)，屬于硫氧還蛋白超家族成員，較早在小鼠和豬的大腦中發(fā)現(xiàn)，并推測在中樞神經(jīng)系統(tǒng)起著重要的作用[1]。FAM213B也是前列腺素(Prostaglandin, PG)合成過程中一種重要的催化酶。PG的生物合成是一個(gè)復(fù)雜的過程，涉及到多個(gè)酶促反應(yīng)以及中間產(chǎn)物的形成(http://www.kegg.jp/pathway/hsa00590)：首先，作為PG合成的起始物之一，花生四烯酸(Arachidonic acid，ARA)在酶催化下被轉(zhuǎn)變成前列腺素H2(Prostaglandin H2，PGH2)，PGH2作為一種不穩(wěn)定的中間產(chǎn)物，很快在FAM213B的作用下生成更為穩(wěn)定的花生四烯酸酯或者前列腺素E2α(Prostaglandin E2，PGE2)，以及向前列腺素F2α(Prostaglandin F2α，PGF2α)的轉(zhuǎn)變；FAM213B還能夠直接催化PGH2生成PGF2α[2]，因此FAM213B具有雙重催化作用。

在FAM213B催化PG合成過程中，PGE2、PGH2與PGF2α是重要的中間產(chǎn)物。PG是哺乳動物重要的生殖激素，參與母豬發(fā)情周期、妊娠識別和建立等生理活動。不同來源、不同類型的PG具有不同的生物學(xué)作用，在動物繁殖過程中具有調(diào)節(jié)作用的主要是PGE2和PGF2α[3]。PGE2和PGF2α之所以受到關(guān)注是因?yàn)閮烧呔哂邢喾吹纳砉δ埽琍GF2α是一種溶解黃體因子[4]，而PGE2則能夠抑制黃體溶解[5-6],因此PGE2/PGF2α須受到嚴(yán)格控制，恰當(dāng)?shù)谋壤S持著母豬的發(fā)情周期和妊娠[3, 7]。較高比例的PGE2/PGF2α對于母豬妊娠的建立和維持具有重要作用，比如中國高繁殖力母豬梅山豬[8]和二花臉豬[9]，相比外種豬，均表現(xiàn)較高的PGE2/PGF2α比例。由于PGF2α具有溶解黃體作用，因此在懷孕母豬體內(nèi)，PGF2α的表達(dá)量受到嚴(yán)格控制。從上述PGF2α的生成過程來看，F(xiàn)AM213B可能間接影響PGE2/PGF2α比例。

目前，F(xiàn)AM213B作為催化PGH2直接生成PGF2α的酶相關(guān)研究較少。顯然，PGH2直接生成PGF2α，比PGH2生成PGE2再生成PGF2α過程更為簡單，對于PGF2α的高效快速生成具有重要意義。鑒于PGF2α的溶解黃體作用，可以推測FAM213B可能在母豬的發(fā)情周期中起著重要的催化作用，或者FAM213B含量在母豬懷孕階段可能受到嚴(yán)格的調(diào)控。但是，F(xiàn)AM213B也能夠催化PGH2向PGE2的轉(zhuǎn)化，而PGE2與PGF2α對黃體具有相反的生理功能，因此FAM213B的表達(dá)可能會受到更嚴(yán)格的調(diào)控。為了深入研究FAM213B在母豬PG合成中的作用，本研究對母豬FAM213B基因進(jìn)行了全長mRNA的克隆，并在此基礎(chǔ)上對啟動子進(jìn)行了克隆和轉(zhuǎn)錄活性的初步分析，期望為進(jìn)一步研究豬FAM213B基因的表達(dá)調(diào)控和功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

動物組織與細(xì)胞：用于提取DNA和RNA的耳組織以及豬子宮內(nèi)膜組織，均來源于妊娠12 d(GD12)的第3胎長大雜交母豬(LL)，樣品采自陽江市某豬場；豬子宮內(nèi)膜細(xì)胞的采集來源于廣州市某屠宰場長大淘汰母豬。

菌株、質(zhì)粒和限制性內(nèi)切酶及其他：大腸埃希菌菌株DH5α和pMD20T載體購自TaKaRa公司，pGL3-Basic載體、pRL-TK載體、限制性內(nèi)切酶購自Promega公司。TaqDNA聚合酶、dNTPs、DL2000分子量標(biāo)準(zhǔn)、DNA凝膠回收試劑盒等購自廣東東盛生物技術(shù)公司；T4 DNA連接酶、RNA提取試劑Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、RACE kit試劑盒購自TaKaRa公司。無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提試劑盒購自O(shè)MEGA公司。

1.2 豬FAM213B基因完整mRNA序列的克隆

根據(jù)GenBank上公布的豬FAM213B基因(XM_005664949.2)CDS區(qū)的序列，設(shè)計(jì)引物，用于完整mRNA序列的克隆。使用5′-Full RACE kit獲得基因的 5′UTR序列，主要步驟包括：使用煙草酸焦磷酸酶(Tobacco acid pyrophosphatase，TAP)去掉mRNA的5′帽子結(jié)構(gòu)，使用T4 RNA Ligase將5′RACE Adaptor連接到mRNA的5′端后，使用5′RACE Adaptor上的引物(p-5′Outer、p-5′Inner)與已知序列部分的引物(5′GSP1、5′GSP2)進(jìn)行巢式PCR反應(yīng)，特異性地?cái)U(kuò)增cDNA 5′末端的全長序列，最后進(jìn)行測序。3′UTR的獲得過程包括：由ReverseTranscriptaseM-MLV(RNaseH-)將poly(A)+RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后再使用TaKaRaLATaq，以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，利用試劑盒自帶引物(p-3′Outer、p-3′Inner)和已知序列部分引物(3′GSP1、3′GSP2)進(jìn)行巢式PCR反應(yīng)，上述過程均按照使用說明書進(jìn)行，獲得完整3′UTR序列。將獲得序列進(jìn)行拼接，獲得完整mRNA序列，提交GenBank，獲得基因登錄號。根據(jù)獲得序列設(shè)計(jì)引物：p-mRNA-F和p-mRNA-R，以豬子宮內(nèi)膜總RNA為模板，PCR反應(yīng)后，進(jìn)行T-A克隆后測序，以此驗(yàn)證所拼接序列的正確性。具體的引物序列見表1。

表1 豬FAM213B基因mRNA全序列和啟動子克隆所用引物信息

1)黑框內(nèi)為保護(hù)堿基，下劃線為酶切位點(diǎn)；上游為MluI酶切位點(diǎn)，下游為XhoI酶切位點(diǎn)。

1.3 豬FAM213B基因啟動子克隆

參照本實(shí)驗(yàn)室獲得的豬FAM213B基因mRNA序列(KX444503)以及5′調(diào)控區(qū)序列(GenBank登錄號：100134955)，設(shè)計(jì)引物(表1引物：p-promoter-F和p-promoter-R)，擴(kuò)增獲得豬FAM213B基因啟動子區(qū)2 261 bp，將此構(gòu)建至T載體，測序后，命名為T-FAM213B-P。以此載體為模板，以帶有酶切位點(diǎn)的引物(p0-promoter-F和p0-promoter-R)擴(kuò)增啟動子區(qū)，PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?8 ℃預(yù)變性1 min；98 ℃變性10 s，67 ℃退火10 s，72 ℃延伸2.5 min，33個(gè)循環(huán)；72 ℃后延伸10 min。

將上述PCR擴(kuò)增獲得DNA片段用DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收純化后，用MluI和XhoI進(jìn)行雙酶切，同時(shí)對pGL-Basic載體進(jìn)行酶切，酶切體系為：10×Buffer 10 μL，PCR產(chǎn)物或者載體50 μL，MluI和XhoI各5 μL， ddH2O 30 μL，37 ℃反應(yīng)3 h。將雙酶切后的DNA片段和pGL-Basic載體分別用DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收純化，2個(gè)DNA片段進(jìn)行連接，10 μL連接反應(yīng)體系中，依次加入1 μL Ligation Buffer，2 μL pGL3- basic 載體雙酶切產(chǎn)物，6.8 μL啟動子片段，0.2 μL T4 DNA 連接酶，22 ℃連接4 h。轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α，涂布氨芐青霉素瓊脂平板，37 ℃過夜培養(yǎng)，然后挑取單克隆進(jìn)行測序，陽性質(zhì)粒命名為P0。

1.4 豬子宮內(nèi)膜細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

屠宰場采集卵泡期子宮，所采樣品于切口處結(jié)扎后，放入冰盒，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室。縱向剪開子宮角，置于無菌培養(yǎng)皿中，用含有雙抗的PBS中清洗數(shù)次，直至液體清亮。剪取子宮內(nèi)膜上皮組織于含有雙抗的PBS中，漂洗數(shù)次。

用眼科剪將子宮內(nèi)膜上皮組織剪成1 mm3大小。將剪碎的組織塊轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中。加入2倍體積的1 g·L-1膠原酶I，37 ℃水浴搖床消化，每隔0.5 h混搖1次。2.5 h后加入等體積含100 g·L-1FBS的DMEM/F12的終止液進(jìn)行終止消化。把消化液和終止液的混合液用150 μm(100目)細(xì)胞篩過濾，吸取濾液至離心管中，500 r·min-1離心5 min(沉淀主要為上皮細(xì)胞，上清主要為基質(zhì)細(xì)胞)。

上皮細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞通過1 000 r·min-1離心5 min和PBS重懸后，將沉淀細(xì)胞計(jì)數(shù)，然后以2×105個(gè)細(xì)胞·mL-1接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，于37 ℃，CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)(含體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2和95%的空氣)。原代細(xì)胞在接種后24 h左右貼壁，約3～5 d達(dá)到90 %融合。此時(shí)，吸出培養(yǎng)液，用PBS漂洗2次后，加入2.5 g·L-1胰蛋白酶消化3～5 min。在顯微鏡下觀察，待大部分細(xì)胞變圓時(shí)，立即加入等體積的終止液終止消化，輕輕吹打數(shù)次。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1 000 r·min-1離心5 min后棄上清，再加入5 mL PBS重懸細(xì)胞，1 000 r·min-1離心5 min后棄上清，接種于新的培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)，備用。

將上述構(gòu)建好的載體用OMEGA無內(nèi)毒素試劑盒提取后，與pRL-TK質(zhì)粒用陽離子脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染細(xì)胞，48 h后，用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)進(jìn)行Luciferase活性檢測，收集數(shù)據(jù)分析啟動子片段轉(zhuǎn)錄活性。

1.5 生物信息學(xué)分析

蛋白基本理化性質(zhì)預(yù)測：http://www.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl，ExPASy的ProtScal程序；蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測：http://swissmodel.expasy.org/；蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域和基序預(yù)測：http://smart.embl-heidelberg.de的UniProt程序；序列比對工具：Kalign和Clustal Omega。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬FAM213B基因完整mRNA序列的克隆

將提取的豬子宮內(nèi)膜組織總RNA經(jīng)過去磷酸化處理和去帽反應(yīng)，連接5′RACE adaptor后反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以該cDNA為模板，進(jìn)行引物p-5′Outer和5′GSP1的PCR擴(kuò)增，此時(shí)產(chǎn)物條帶彌散不清，如圖1A。再以此PCR產(chǎn)物為模板，以引物p-5′Inner和5′GSP2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，此時(shí)得到單一的目的條帶209 bp，如圖1B。將目的條帶連接載體后測序，將所得序列與已知序列比對，拼接后得到了67 bp的5′UTR，即轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)位于ATG前的67 bp處。同樣，以總RNA為模板，用ployT引物將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，接著用p-3′Outer和3′GSP1引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，此時(shí)產(chǎn)物條帶彌散不清，如圖1C。再以此為模板，以p-3′Inner和3′GSP2引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，此時(shí)得到單一目的條帶600 bp，如圖1D。將目的條帶連接載體后測序，所得序列與已知序列比對，拼接后得到了132 bp的3′UTR，以及10 bp的ployA序列。

經(jīng)過測序后，以5′UTR和3′UTR序列設(shè)計(jì)引物p-mRNA-F和p-mRNA-R，以長大雜母豬子宮內(nèi)膜組織cDNA為模板，通過PCR擴(kuò)增獲得完整的mRNA序列，并經(jīng)過測序確定與RACE技術(shù)獲得的mRNA序列完全一致，為808 bp，polyA長度為10 bp(見圖1E)。將該序列提交GenBank，獲得登錄號為：KX444503。

M為DL2000 Marker，從上到下為：2 000、1 000、750、500、250和100 bp；1: 5′RACE Outer引物擴(kuò)增彌散帶；2: 5′RACE Inner引物擴(kuò)增特異性條帶；3:3′RACE Outer引物擴(kuò)增彌散帶；4:3′RACE Outer引物擴(kuò)增特異性條帶；5:FAM213B基因mRNA驗(yàn)證擴(kuò)增結(jié)果。

圖1 豬FAM213B基因完整mRNA序列的RACE結(jié)果

Fig.1 The RACE results of porcineFAM213BmRNA sequence

2.2 豬FAM213B性質(zhì)以及不同轉(zhuǎn)錄本和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)比較

用ExPASy的ProtScal程序分析獲得豬FAM213B基因mRNA CDS編碼蛋白的理化性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)該蛋白的分子量為21 546.8，等電點(diǎn)為8.87，半衰期為30 h，不穩(wěn)定系數(shù)為61.27(大于40為不穩(wěn)定)，為一不穩(wěn)定性蛋白。用UniProt程序分析該蛋白的結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)在17～106位氨基酸之間存在硫氧還蛋白折疊結(jié)構(gòu)域。GO分析表明，該蛋白作為細(xì)胞質(zhì)成分，參與了氧化還原反應(yīng)過程(GO:0055114)，具有催化活性。

豬FAM213B基因定位于6號染色體，基因全長3 138bp(GenBank登錄號：NC_010448.3), NCBI數(shù)據(jù)庫公布的豬FAM213B基因的mRNA序列有3個(gè)，其中1個(gè)序列為609 bp(NM_001113441.1)，是一個(gè)完整的閱讀框，不含非翻譯區(qū)，將其序列與本研究獲得的mRNA的CDS區(qū)進(jìn)行比對，兩者序列一致。另外2個(gè)序列是根據(jù)生物信息學(xué)計(jì)算得出的轉(zhuǎn)錄本，分別為940 bp(XM_013998922.1)和824 bp(XM_005664949.2)。鑒于人FAM213B基因存在多個(gè)轉(zhuǎn)錄本，進(jìn)而將本研究獲得豬FAM213B基因mRNA序列與940和824 bp 轉(zhuǎn)錄本序列進(jìn)行比較(在線軟件：Kalign)，結(jié)果表明所獲得的FAM213B基因mRNA與另外2個(gè)轉(zhuǎn)錄本的非翻譯區(qū)、CDS區(qū)長度存在差異，結(jié)果如圖2所示。808、824、940 bp的轉(zhuǎn)錄本CDS區(qū)分別長：609、555和711 bp，編碼氨基酸數(shù)目為：203、185和237。進(jìn)一步與基因組序列進(jìn)行比對分析,發(fā)現(xiàn)豬FAM213B基因由7個(gè)外顯子組成，本研究所獲得的mRNA序列與其他2個(gè)較長的mRNA序列相比，發(fā)現(xiàn)在2、3和4外顯子不存在差異，而在第1、5、6和7外顯子存在差異，1和7外顯子的差異在于UTR長度不同；此外，本研究獲得序列第5、6外顯子分別為69、132 bp，而940 bp序列第5外顯子159 bp，而 824 bp序列第5、6外顯子分別為72和94 bp。

通過在線工具預(yù)測3個(gè)轉(zhuǎn)錄本蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)(http://swissmodel.expasy.org/)，結(jié)果如圖3所示。3個(gè)蛋白均有α螺旋、β折疊、轉(zhuǎn)角等結(jié)構(gòu)組成，由于3個(gè)轉(zhuǎn)錄本編碼區(qū)前108個(gè)氨基酸序列一致，因此三級結(jié)構(gòu)存在類似空間構(gòu)象，主要由α螺旋組成；而三者的氨基酸序列、數(shù)目不一致，因此蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)差異較大。在這些氨基酸44位處為半胱氨酸(Cys44)，這是該蛋白的活性位點(diǎn)；同時(shí)，三者都存在硫氧還蛋白折疊結(jié)構(gòu)域。

實(shí)橫線：UTR；方框：編碼區(qū)；虛線：該處不存在堿基；上方數(shù)字表示堿基數(shù)目，下方紅色數(shù)字1～7表示外顯子序號； 808、824和940 bp分別表示3個(gè)轉(zhuǎn)錄本堿基數(shù)目。

圖2 豬FAM213B基因mRNA 不同轉(zhuǎn)錄本序列與結(jié)構(gòu)分析

Fig.2 The genetic structures of three transcripts of porcineFAM213Bgene

A、B、C分別對應(yīng)于圖2中3個(gè)轉(zhuǎn)錄本的蛋白結(jié)構(gòu)，括號內(nèi)數(shù)字表示3個(gè)轉(zhuǎn)錄本編碼氨基酸數(shù)目。

2.3 豬FAM213B蛋白質(zhì)同源進(jìn)化分析

通過Clustal Omega軟件，將人(NP_689584.2)、豬(KX444503)、牛(NP_001035688.1)、山羊(XP_005690822.2)、綿羊(XP_014954752)、小鼠(NP_079858.2)、大鼠( NP_001102167.1)、斑馬魚(NP_998478.1)、爪蟾(NP_001087128.1)9個(gè)物種FAM213B基因開放閱讀框轉(zhuǎn)錄所得氨基酸序列進(jìn)行蛋白質(zhì)同源性分析，豬與山羊、牛和綿羊有更高的相似性，相似性分別為94.03%、 93.03%和91.54%；與人、小鼠和大鼠相似性為88.38%、86.57%和85.57%；與爪蟾、斑馬魚相似性分別為61.19%和59.70%。根據(jù)氨基酸相似性分析結(jié)果，用鄰接法構(gòu)建FAM213B蛋白質(zhì)同源進(jìn)化分支圖(圖4)。

圖4 基于FAM213B蛋白質(zhì)序列的聚類分析

Fig.4 Cluster analysis based on FAM213B protein sequences

2.4 豬FAM213B基因啟動子克隆與雙熒光素酶重組載體的構(gòu)建

將5′RACE試驗(yàn)獲得的mRNA序列的第1個(gè)堿基確定為+1，通過PCR擴(kuò)增獲得2 261 bp(-2 231/+30)的豬FAM213B基因5′啟動子序列(圖5A)。將豬FAM213B基因啟動子區(qū)序列通過在線生物學(xué)軟件進(jìn)行分析，預(yù)測啟動子區(qū)潛在的順式作用元件和結(jié)合反式作用因子，發(fā)現(xiàn)FAM213B基因啟動子區(qū)存在潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)(圖5B)，如典型的TATA box、CAAT box等順式作用元件；存在與下列轉(zhuǎn)錄因子如cAMP應(yīng)答元件結(jié)合蛋白(cAMP-response element binding protein，CREB)、CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白(CCAAT/enhancer binding protein, C/EBP)、E-box 結(jié)合因子(E-box binding factors)、核因子κB(Nuclear factor κB, NFκB)、八聚體轉(zhuǎn)錄因子(Octamer transcription factor-1, OCT-1)等潛在結(jié)合位點(diǎn)。其中，NFκB成員NFκB1和RelA分別位于：-1 143/-1 132和-664/-655區(qū)域(圖5A)。根據(jù)在線預(yù)測結(jié)果，以2 261 bp(-2 231/+30)的片段(圖6A)為模板，用p0-promoter-F和 p0-promoter-R引物對擴(kuò)增-2 175/+30區(qū)域(圖6B)，并將其連接構(gòu)建報(bào)告基因重組載體，酶切鑒定結(jié)果符合預(yù)期(圖6C)。

A:豬FAM213B基因啟動子與mRNA結(jié)構(gòu)示意圖；B：豬FAM213B基因啟動子長順式作用元件及結(jié)合因子預(yù)測結(jié)果。

Fig.5 The structure of theFAM213BmRNA and prediction of cis-acting elements and transcription factors inFAM213Bgene promoter

M為DS5000 Marker，從上到下為：5 000、3 000、2 000、1 500、1 000、750、500、250和100 bp；1：2 261 bp啟動子片段；2：2 205 bp啟動子片段；3：2 205 bp片段重組載體雙酶切結(jié)果。

圖6 豬FAM213B基因啟動子報(bào)告基因重組載體的構(gòu)建

Fig.6 The bioinformatics analysis and the construction of the reporter gene recombinant vector ofFAM213Bgene promoter

2.5 豬子宮內(nèi)膜細(xì)胞培養(yǎng)及FAM213B基因啟動子活性的初步鑒定

采用膠原酶消化法，分離培養(yǎng)上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞。豬子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞大概在24 h左右開始貼壁并成旋渦狀排列的致密單層細(xì)胞集落，采用離心的方法并不能夠?qū)⑸掀ぜ?xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞完全分離，因而偶見散在的間質(zhì)細(xì)胞插入性生長(圖7A)。雖然間質(zhì)細(xì)胞在數(shù)小時(shí)內(nèi)開始貼壁成單個(gè)生長，但并不影響啟動子活性的檢測。子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞在3～5 d后可達(dá)到80%融合，上皮細(xì)胞呈梭形，邊界清楚，排列緊密，胞質(zhì)呈顆粒狀，胞核大而圓，鋪滿瓶底時(shí)，細(xì)胞集落擴(kuò)大并相互融合成片(圖7B)。

采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染方法，將豬FAM213B基因啟動子報(bào)告基因重組載體P0轉(zhuǎn)染豬子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞，同時(shí)共轉(zhuǎn)染內(nèi)參pGL-TK質(zhì)粒。分別檢測螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的活性，螢火蟲熒光素酶與海腎熒光素酶活性的比值即表示啟動子片段的活性，啟動子報(bào)告基因瞬時(shí)轉(zhuǎn)染結(jié)果如圖8所示：重組質(zhì)粒P0轉(zhuǎn)錄活性遠(yuǎn)高于對照，表明克隆所獲得片段具有啟動子轉(zhuǎn)錄活性。

圖7 豬子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)形態(tài)

圖8 FAM213B基因啟動子在豬子宮內(nèi)膜細(xì)胞轉(zhuǎn)錄活性

Fig.8 The transcriptional activity of the promoter of procineFAM213Bgene

3 討論與結(jié)論

3.1 豬FAM213B基因mRNA獲得與轉(zhuǎn)錄本分析

前列腺酰胺合成酶GFS存在3種同工酶，分別是PGFS I、PGFS II和FAM213B。前2種是醛酮還原酶(Aldo-keto reductase,AKR)超家族，F(xiàn)AM213B則屬于硫氧還蛋白樣超家族成員[10]。FAM213B是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種氧化還原酶，這種新型酶不同于之前所報(bào)道的PGF酶。FAM213B蛋白質(zhì)在NADPH 作為質(zhì)子供體情況下，能直接將PGH2做為底物一步合成PGF2α，并且FAM213B合成PGF2α效率優(yōu)于其他PGF酶[1]。在通過5′RACE和3′RACE技術(shù)獲得了豬FAM213B基因完整mRNA序列(GenBank序列號：KX444503)的基礎(chǔ)上，并確定了該基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)位于其起始密碼子前67 bp。由于FAM213B基因在人上存在多個(gè)轉(zhuǎn)錄本，推測在豬上該基因也可能存在多個(gè)轉(zhuǎn)錄本。將獲得的轉(zhuǎn)錄本序列與GenBank提交的FAM213B基因其他2個(gè)轉(zhuǎn)錄本(940 bp，XM_013998922.1； 824 bp，XM_005664949.2)進(jìn)行了基因結(jié)構(gòu)和蛋白三維結(jié)構(gòu)比較，發(fā)現(xiàn)三者在1～108位氨基酸序列相同，而這在17～106位氨基酸之間存在硫氧還蛋白折疊功能結(jié)構(gòu)域，這可能與其共同的催化功能有關(guān)。蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)雖然有較大差異，但是功能域形成的α螺旋基本一致，因此推測其不同的轉(zhuǎn)錄本的翻譯蛋白其催化功能是一致的。不過本研究在豬子宮內(nèi)膜僅發(fā)現(xiàn)了1種轉(zhuǎn)錄本，其他2個(gè)計(jì)算模擬的轉(zhuǎn)錄本尚未檢測到，但是這并不意味著豬FAM213B基因只有1種轉(zhuǎn)錄本。目前，發(fā)現(xiàn)小鼠FAM213B基因只有1個(gè)轉(zhuǎn)錄本。對人、豬、牛、山羊、綿羊、小鼠、大鼠、斑馬魚、爪蟾等9個(gè)物種的FAM213B氨基酸序列相似性進(jìn)行分析，豬與山羊、牛和綿羊有更高的相似性。同時(shí)，豬、人和小鼠的FAM213B基因結(jié)構(gòu)相似，都由7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子組成，第2、第3、第4和第5外顯子的長度在3個(gè)物種相同，第7外顯子的長度差異較大。而比較有趣的現(xiàn)象是在公共數(shù)據(jù)庫中尚未檢索到家禽如雞、鴨等物種FAM213B基因信息。

3.2 豬FAM213B基因啟動子在豬子宮內(nèi)膜的轉(zhuǎn)錄調(diào)控

妊娠的建立需要功能性黃體持續(xù)分泌孕酮，而孕酮又可促進(jìn)子宮內(nèi)膜的分泌活動，這對胚胎附植及發(fā)育具有關(guān)鍵作用[11]，PG與孕酮的溶解、維持密切相關(guān)。前人研究表明豬和小鼠FAM213BmRNA存在腦組織與脊髓中，而且主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，表明FAM213B在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮著重要的作用[1]；前期研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AM213B在懷孕豬子宮內(nèi)膜中表達(dá)[9]，推測FAM213B基因在子宮內(nèi)膜中對母豬妊娠和胚胎發(fā)育起著調(diào)控作用。FAM213B和CBR1/2均可以催化PGE2向PGF2α轉(zhuǎn)變[12]，但FAM213B也能夠直接催化PGH2向PGF2α的轉(zhuǎn)變，因此推測FAM213B在母豬妊娠期間的低催化效率對于較高PGE2/PGF2α的比率可能是必需的，F(xiàn)AM213B基因的mRNA和蛋白表達(dá)量在豬子宮內(nèi)膜可能會受到嚴(yán)格控制。因此，本研究在RACE技術(shù)獲得完整FAM213B基因mRNA基礎(chǔ)上，精準(zhǔn)定位其轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，并且發(fā)現(xiàn)獲得的FAM213B基因啟動子序列(-2 175/+30)在豬子宮內(nèi)膜中具有轉(zhuǎn)錄下游報(bào)告基因的活性。通過對豬FAM213B基因的啟動子序列生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)除了典型的TATA box、CAAT box等順式作用元件外，還存在其他的一些潛在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，如E-box、NFκB、OCT-1等，而這些因子也決定了FAM213B基因在豬子宮內(nèi)膜中的表達(dá)規(guī)律。例如，母豬的妊娠建立類似一種炎性過程[13]，而炎性因子NFκB對于妊娠相關(guān)基因的表達(dá)則具有促進(jìn)或者抑制作用，在該啟動子-1 143和-664位點(diǎn)預(yù)測到了NFκB1和RelA結(jié)合位點(diǎn)，NFκB1和RelA均為NFκB家族成員[14]。有研究表明，分泌期人類子宮NFκB1和RelA表達(dá)上調(diào)[15]；RelA表達(dá)量在胚胎植入窗口期表達(dá)量也會升高[13]。有文獻(xiàn)報(bào)道，在母豬胚胎植入前NFκB就被開始被激活[16]，NFκB常常作為轉(zhuǎn)錄因子激活炎性相關(guān)基因的表達(dá)[17]。

本研究發(fā)現(xiàn)FAM213B基因的啟動子上存在潛在的NFκB和RelA結(jié)合位點(diǎn)，推測FAM213B基因可能會受到NFκB的調(diào)控，不過需要進(jìn)行深入研究。總之，初步檢測到所獲啟動子片段具有轉(zhuǎn)錄活性，而且發(fā)現(xiàn)與母豬妊娠密切相關(guān)的潛在順式作用元件，這些結(jié)果為進(jìn)一步分析豬FAM213B基因轉(zhuǎn)錄活性區(qū)域、特異性轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)鑒定等研究奠定了基礎(chǔ)。

[1] MORIUCHI H, KODA N, OKUDA-ASHITAKA E, et al. Molecular characterization of a novel type of prostamide/prostaglandin F synthase, belonging to the thioredoxin-like superfamily[J]. J Biol Chem, 2008, 283(2): 792-801.

[2] KOMOTO J, YAMADA T, WATANABE K, et al. Prostaglandin F2alpha formation from prostaglandin H2 by prostaglandin F synthase (PGFS): Crystal structure of PGFS containing bimatoprost[J]. Biochemistry, 2006, 45(7): 1987-1996.

[3] WACLAWIK A, ZIECIK A J. Differential expression of prostaglandin (PG) synthesis enzymes in conceptus during peri-implantation period and endometrial expression of carbonyl reductase/PG 9-ketoreductase in the pig[J]. J Endocrinol, 2007, 194(3): 499-510.

[4] CHRISTENSON L K, FARLEY D B, Anderson L H, et al. Luteal maintenance during early pregnancy in the pig: Role for prostaglandin E2[J]. Prostaglandins, 1994, 47(1): 61-75.

[5] ZIECIK A J. Old, new and the newest concepts of inhibition of luteolysis during early pregnancy in pig[J]. Domest Anim Endocrinol, 2002, 23(1/2): 265-275.

[6] GADSBY J E, LOVDAL J A, BRITT J H, et al. Prostaglandin F2 alpha receptor concentrations in corpora lutea of cycling, pregnant, and pseudopregnant pigs[J]. Biol Reprod, 1993, 49(3): 604-608.

[7] WEEMS C W, WEEMSY S, RANDELR D. Prostaglandins and reproduction in female farm animals[J]. Vet J, 2006, 171(2): 206-228.

[8] BAZER F W, THATCHER W W, MATINAT-BOTTEF, et al. Composition of uterine flushings from Large White and prolific Chinese Meishan gilts[J]. Reprod Fertil Dev, 1991, 3(1): 51-60.

[9] ZHANG H, WANG S, LIU M, et al. Differential gene expression in the endometrium on gestation day 12 provides insight into sow prolificacy[J]. Bmc Genomics, 2013, 14: 45.

[10]SUZUKI-YAMAMOTO T, TOIDA K, SUGIMOTO Y, et al. Colocalization of prostaglandin F(2alpha) receptor FP and prostaglandin F synthase-I in the spinal cord[J]. J Lipid Res, 2009, 50(10): 1996-2003.

[11]ZIECIK A J, WACLAWIK A, KACZMAREK M M, et al. Mechanisms for the establishment of pregnancy in the pig[J]. Reprod Domest Anim, 2011, 46(Suppl 3): 31-41.

[12]WACLAWIK A, JABBOUR H N, BLITEK A, et al. Estradiol-17beta, prostaglandin E2 (PGE2), and the PGE2 receptor are involved in PGE2 positive feedback loop in the porcine endometrium[J]. Endocrinology, 2009, 150(8): 3823-3832.

[13]KING A E, COLLINS F, KLONISCH T, et al. An additive interaction between the NFkappaB and estrogen receptor signalling pathways in human endometrial epithelial cells[J]. Hum Reprod, 2010, 25(2): 510-518.

[14]LINDSTROM T M, BENNETT P R. The role of nuclear factor kappaB in human labour[J]. Reproduction, 2005, 130(5): 569-581.

[15]LAIRD S M, TUCKERMAN E M, CORK B A, et al. Expression of nuclear factor kappaB in human endometrium; role in the control of interleukin 6 and leukaemia inhibitory factor production[J]. Mol Hum Reprod, 2000, 6(1): 34-40.

[16]MATHEW D J, SELLNER E M, GREEN J C, et al. Uterine progesterone receptor expression, conceptus development, and ovarian function in pigs treated with RU 486 during early pregnancy[J]. Biol Reprod, 2011, 84(1): 130-139.

[17]INOUE J, GOHDA J, AKIYAMA T, et al. NF-kappaB activation in development and progression of cancer[J]. Cancer Sci, 2007, 98(3): 268-274.

【責(zé)任編輯 莊 延】

Cloning and sequence analysis of mRNA andpromoter of pigFAM213Bgene

ZHANG Ailing1，2, SUN Xianyue2, LU Xiaozhang2, LI Jiaqi2, ZHANG Hao2

(1 Biology and Food Engineering Institute, Guangdong University of Education/Guangdong Development Center ofApplied Ecology and Ecological Engineering in Universities, Guangzhou 510303, China;2 College of Animal Science, South China Agricultural University/Guangdong Provincial KeyLaboratory of Agro-animal Genomics and Molecular Breeding, Guangzhou 510642, China)

【Objective】 To obtain the complete mRNA and promoter sequences of pigFAM213Bgene, and provide a basis for studying the mechanism of theFAM213Bgene in regulating gestation establishment and embryo development of female pigs.【Method】The complete mRNA sequence of theFAM213Bgene was obtained using 5′ and 3′RACE methods.The amino acid sequence similarities of different species were analyzed. The gene promoter was cloned, and its transcription activity was detected by the dual luciferase report system in porcine endometrial cells.【Result】The mRNA of pigFAM213Bgene was 808 bp in full length, including the 5′UTR, CDS and 3′UTR of 67, 609 (including the termination codon) and 132 bp (excluding poly A), respectively. A thioredoxin fold domain was predicted from the 17th to 106th amino acid residues. The obtained transcript and the other two computed transcripts all contained the thioredoxin fold domains, but the tertiary structures of three proteins were highly different. The amino acid sequence of pig FAM213B showed 94.03%, 93.03% and 91.54% similarities with those of goat, cattle and sheep, respectively. The cloned promoter sequence (-2 231/+30) of theFAM213Bgene was linked with the dual luciferase report vector, and transfected into the endometrial cells. The promoter fragment could drive the expression of the downstream report gene. There were potential binding sites of transcription factors such as NFκB within the promoter. 【Conclusion】The complete sequence of the transcript of pigFAM213Bgene is 808 bp. The FAM213B protein contains a thioredoxin fold domain. TheFAM213Bpromoter (-2 231/+30) has strong transcription activity in porcine endometrial cells.

pig;FAM213Bgene;transcription; promoter; cloning; endometrial cell；thioredoxin

2016- 07- 24 優(yōu)先出版時(shí)間：2017-04-12

張愛玲(1977—)，女，講師，博士， E-mail: zhangmeixiaL@163.com；通信作者：張 豪(1965—)，男，教授，博士， E-mail: zhanghao@scau.edu.cn

國家自然科學(xué)基金(31201771)；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)(CARS-36)

S828

A

1001- 411X(2017)03- 0001- 08

優(yōu)先出版網(wǎng)址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/44.1110.s.20170412.1434.024.html

張愛玲， 孫顯月， 盧孝璋， 等.豬FAM213B基因mRNA和啟動子的克隆及序列分析[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2017,38(3):1- 8.