葉宇蕓， 王清明,2， 馬建偉， 張銀平， 陳其陽， 湯浩茹， 張 勇

(1 四川農(nóng)業(yè)大學 園藝學院，四川 成都 611130； 2 廣元市農(nóng)業(yè)科學研究院，四川 廣元 628017)

基于SSR標記的桃品種遺傳多樣性分析及遺傳相似系數(shù)比較

葉宇蕓1， 王清明1,2， 馬建偉1， 張銀平1， 陳其陽1， 湯浩茹1， 張 勇1

(1 四川農(nóng)業(yè)大學 園藝學院，四川 成都 611130； 2 廣元市農(nóng)業(yè)科學研究院，四川 廣元 628017)

【目的】利用NCBI數(shù)據(jù)庫中桃的EST信息開發(fā)SSR引物,分析成都平原主栽桃品種的遺傳多樣性，探討各遺傳相似系數(shù)在桃SSR分析中的適用性，以期為桃種質(zhì)資源的研究提供參考?！痉椒ā坷脕碜訬CBI-EST數(shù)據(jù)庫的100對SSR引物對12個不同形態(tài)的桃品種進行PCR擴增，分析篩選20對多態(tài)性好、穩(wěn)定性高且均勻分布于桃8個連鎖群的引物對40個桃品種進行PCR擴增，并采用5個遺傳相似系數(shù)分別對擴增結(jié)果進行分析?！窘Y(jié)果】使用20對引物共檢測出68個多態(tài)性等位基因位點，每對引物的等位基因數(shù)在2～5之間, 平均為3.4。多態(tài)信息含量在0.36～0.73間變化，平均為0.54。Jaccard相似系數(shù)為0.106～1.000; Jaccard系數(shù)的共表型相關系數(shù)rc最高，為0.772; Dice系數(shù)次之，為0.719; Jaccard和Dice系數(shù)的系統(tǒng)樹一致性最高，CIc為1。Nei’s基因多樣性指數(shù)在種級水平上和類群水平上分別為0.603和0.374，相應的Shannon’s信息指數(shù)分別為1.041和0.591。40個桃品種在聚類中首先分為觀賞桃和食用桃2大類，再細分為各類群，聚類結(jié)果與傳統(tǒng)系譜基本吻合?！窘Y(jié)論】基于NCBI數(shù)據(jù)庫中桃的EST信息開發(fā)的SSR引物多態(tài)性較好，可用于桃的SSR分析。Jaccard和Dice系數(shù)適合桃的SSR分析。桃品種總體遺傳多樣性較豐富，但水蜜桃品種仍需加強種質(zhì)創(chuàng)新。

桃； 遺傳多樣性； 遺傳相似系數(shù)； EST-SSR； 引物篩選

桃Prunuspersica為薔薇科桃屬重要果樹，在長期的人工馴化和選擇中形成了適應不同生態(tài)條件、滿足不同需求的類型，這些資源為進一步改良桃的相關性狀提供了基礎，了解這些資源是利用的前提。中國的桃種質(zhì)資源十分豐富，目前國內(nèi)各種園圃共收集保存了2 000余份桃種質(zhì)資源[1]，桃作為全世界栽培最廣泛的落葉果樹之一，已遍布全球。《中國果樹志·桃卷》[2]中，桃品種按形態(tài)學、品種類群和生態(tài)類群等進行分類，這有助于栽培生產(chǎn)和果品利用，但部分品種僅依靠形態(tài)特征很難識別，而形態(tài)學標記位點較少且易受環(huán)境因素的影響[3]，開展桃樹分子標記輔助分類具有重要意義。

簡單序列重復(Simple sequence repeat, SSR)標記因多態(tài)性豐富、重復性好、檢測方便、共顯性、標記覆蓋整個基因組且均勻分布等特點，已成為分子育種中最重要的遺傳標記之一[4]。然而，桃的可用SSR引物較少，薔薇科其他植物的SSR引物更為稀少。2013年，Verde等[5]基于桃不同器官轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)研究后上傳至NCBI共80 797條ESTs序列，為挑選更好的桃SSR引物提供了豐富的資源。

聚類分析是應用于種質(zhì)資源親緣關系鑒定、新品種鑒定和遺傳多樣性分析等研究的一種方法。Bouhadida等[6]利用聚類分析鑒別了94份西班牙桃品種；張俊佳等[7]完成了桃新品種‘保佳紅’親緣關系的鑒定；廖安紅等[8]分析了71份桃資源的遺傳多樣性。聚類分析因用途廣泛而在桃種質(zhì)資源的研究工作中占有非常重要的地位。遺傳相似系數(shù)的選擇為聚類分析的重要一環(huán)，過去的研究中對于遺傳相似系數(shù)的選擇多基于默認設置或慣性，而基于不同的遺傳相似系數(shù)進行聚類分析，其結(jié)果存在較大差異[9]，故選擇一個合適的遺傳相似系數(shù)對于后續(xù)各種基于聚類分析進行的工作顯得尤為重要。

本研究以成都平原主栽的40個桃品種為研究對象，根據(jù)現(xiàn)有EST序列設計100對SSR引物，從中挑選出20對可用引物，分析了成都平原主栽桃品種的遺傳多樣性，利用SSR標記探討了不同的遺傳相似系數(shù)在桃的SSR分析中的適用性，以期為桃種質(zhì)資源的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

基于《中國果樹志:桃卷》[2]中的各品種類群對成都平原桃的主栽品種進行取材，本試驗所用40份材料(表1)分別來自四川省農(nóng)業(yè)科學院龍泉資源圃、華陽資源圃和四川農(nóng)業(yè)大學臨濟資源圃。

表1 試驗種質(zhì)和分類

1.2 引物設計及篩選

利用MISA(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)對NCBI數(shù)據(jù)庫ESTs序列處理后所得的EST序列進行SSR位點搜索，選取含SSR位點且最容易發(fā)生變異的二核苷酸重復EST-SSR引物，搜索標準為：二核苷酸重復基序的最少重復次數(shù)為6次，且間隔序列小于100 bp，然后利用Primer3模塊(http://sourceforge.net/projects/primer3/files/primer3/1.1.4/primer3-1.1.4-WINXP.zip/download)設計EST-SSR引物，設計標準為：產(chǎn)物大小100～280 bp,引物長度18～27 bp,復性溫度57～63 ℃，上下游引物相差小于3 ℃。

利用UltraEdit軟件對自NCBI下載的桃全基因組序列進行處理，具體方法為：在軟件中搜索“scaffold_1”、“scaffold_2”、“scaffold_3”直至“scaffold_8”，分別記錄各連鎖群的始末位置，再將供試引物序列在軟件中搜索，以確定各引物在連鎖群上的分布情況，并結(jié)合引物驗證結(jié)果篩選可用引物。

1.3 DNA提取及引物PCR驗證

采用CTAB法提取DNA。PCR擴增在Bio-rad DNA Engine Single bay PCR儀(Eppendorf, 德國)上進行。SSR-PCR采用包含10×10-9mo1 引物，40 ng DNA模板，2 UTaqDNA聚合酶，2.5 μL 10×Buffer(含Mg2+)，7.5×10-6mol dNTPs，50×10-6mol Mg2+共25 μL反應體系。其反應程序為：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，57～63 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min， 32個循環(huán)；72 ℃延伸5 min；于4 ℃保存20 min，得擴增產(chǎn)物。PCR擴增產(chǎn)物使用80 g·L-1非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離，銀染至條帶清晰為止，照相并記錄。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用PIC_CALC軟件得到SSR位點多態(tài)信息含量(Polymorphism information content, PIC)，結(jié)合多態(tài)性條帶率來評價位點的擴增情況。利用NTsys-2.10e計算5個遺傳相似系數(shù)(表2)，并用非加權組平均法(Unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA)建立相應的系統(tǒng)樹。利用Mantel檢驗[10]分析遺傳相似矩陣間相關性；采用Cophenetic模塊計算共表型相關系數(shù)(rc)，此系數(shù)可檢驗聚類方法和原始遺傳相似矩陣間的擬合優(yōu)度；采用CONSENSUS-consensus tree模塊計算聚類樹狀圖系統(tǒng)樹一致性指數(shù)(Consistency index，CIc)，以估計各系統(tǒng)樹間的相對一致性[11]。

表2 不同遺傳相似系數(shù)的計算方法

Tab.2 Calculation methods of five genetic similarity coefficients

相似系數(shù)計算公式1)區(qū)間SimpleMatching(SM)(a+d)/(b+c)(0，1)Jaccard(J)a/{[(a+d)+(b+c)]-d}(0，1)RusselandRao(RR)a/[(a+d)+(b+c)](0，1)Dice2a/(2a+b+c)(0，1)Phi(ad-bc)/(a+b)(c+d))(a+c)(b+d)(-1，1)

1)a表示品種i、j共有條帶數(shù)；b表示品種i特有條帶數(shù)；c表示品種j特有條帶數(shù)；d表示品種i、j共有缺失條帶數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR引物篩選及擴增結(jié)果

根據(jù)已公布的80 797條桃EST序列，去除低質(zhì)量和冗余的9 965條，剩余的70 360條包含38.2 M信息量，占桃全基因組的16.8%；共檢測得12 519個SSR位點，位點出現(xiàn)總頻率為14.6%。利用Primer3模塊從12 519條含有SSR位點的EST序列中設計了1 306對二核苷酸重復的SSR引物。利用隨機分層抽樣的方法，按照重復單位的重復數(shù)(5～10、10～15、16～20、20～25、25～n)將二核苷酸重復引物分為5組，分別從5組中隨機抽取相同數(shù)量(各20對)共100對引物。利用12個不同形態(tài)的桃品種(早鳳王、早紅蟠、錦園、春雪、曙光、千姬、壽紅、紅垂枝、白垂枝、菊花桃、紅葉桃、報春)對100對二核苷酸SSR引物進行了驗證，擴增結(jié)果表明等位基因數(shù)量≥3的引物占43%，擴增情況較好。利用UltraEdit軟件對自NCBI下載的桃全基因組序列進行處理，確定了各引物在連鎖群上的分布情況，結(jié)合引物驗證結(jié)果，篩選出20對均勻分散于8個連鎖群的、等位基因數(shù)量多、穩(wěn)定性高的引物(表3)以代表全基因組信息，對40個桃品種進行PCR擴增。

20對SSR引物的擴增結(jié)果(表3)顯示，共擴增出68個多態(tài)性等位基因位點，單對引物擴增條帶數(shù)變幅為2～5，平均每對引物擴增出約3.4個多態(tài)性條帶，多態(tài)信息含量(PIC)介于0.36～0.73，平均值為0.54，表明這些引物PIC值較高，可用于桃種質(zhì)資源的鑒定和研究。

2.2 遺傳相似系數(shù)分析

基于不同遺傳相似系數(shù)的品種遺傳相似度矩陣，對成對矩陣的相關系數(shù)進行計算的結(jié)果(表4)顯示，各系數(shù)間成對的相關系數(shù)變幅為0.861～0.996。SM系數(shù)與Phi系數(shù)相關性最高，為0.996；RR系數(shù)與SM系數(shù)相關性最低，為0.861。

表3 20對桃EST-SSR引物信息

1)括號內(nèi)的英文字符為簡單重復序列，括號外的數(shù)字為該序列的重復次數(shù)。

表4 基于不同相似系數(shù)的遺傳相似性矩陣間的相關系數(shù)

Tab.4 Correlation coefficients of genetic similarity matrix based on different similarity coefficients

相似系數(shù)PhiSMJaccardRRSM0．996Jaccard0．9760．959RR0．8980．8610．954Dice0．9820．9630．9900．961

不同遺傳相似系數(shù)的UPGMA系統(tǒng)樹一致性分析結(jié)果(表5)顯示，系統(tǒng)樹一致性指數(shù)(CIc)介于0.474～1.000。Dice系數(shù)與Jaccard系數(shù)的系統(tǒng)樹一致性最高，CIc為1.000，表明2個系統(tǒng)樹的聚類結(jié)果完全一致。最低的是RR系數(shù)與SM系數(shù)，CIc為0.474。系統(tǒng)樹的一致性分析結(jié)果表明不同的遺傳相似系數(shù)進行聚類分析，其結(jié)果存在較大差異。

表5 基于不同相似系數(shù)的UPGMA系統(tǒng)樹的一致性指數(shù)

Tab.5 The consistency indexes of UPGMA system trees based on different similarity coefficients

相似系數(shù)PhiSMJaccardRRSM0．868Jaccard0．9740．842RR0．5000．4740．500Dice0．9740．8421．0000．500

5個遺傳相似系數(shù)的建樹結(jié)果表明，品種間遺傳相似度在UPGMA聚類分析中有較良好的表現(xiàn)，各系數(shù)的共表型相關系數(shù)(rc)的變幅為0.660～0.772，其中Jaccard系數(shù)的rc最大, 為0.772， Dice、PHI、SM和RR系數(shù)的rc分別為0.719、0.709、0.708和0.660。

2.3 遺傳多樣性分析

利用Jaccard遺傳相似系數(shù)對桃品種間遺傳相似度進行計算，建立UPGMA系統(tǒng)樹(圖1)。

20對引物在40份桃種質(zhì)上的Jaccard系數(shù)變幅為0.106～1.000，品種‘晚湖景’和‘紅垂枝’的遺傳相似系數(shù)最小，為0.106；‘單粉’和‘灑紅’的遺傳相似系數(shù)最大，為1.000。由圖1可知，在相似系數(shù)為0.300時，40個桃品種分為了觀賞桃品種和食用桃品種2個大類，兩者表現(xiàn)出了明顯的界限；各品種基本表現(xiàn)為同一類群品種聚在一起，僅個別品種發(fā)生類群間“跳躍”，聚類結(jié)果與傳統(tǒng)系譜基本一致。在相似系數(shù)為0.360時，可將供試材料分為6組。第I組包括7個水蜜桃品種；第II組為3個黃桃品種；第III組則包括6個油桃品種和1個蟠桃品種；第IV組包括5個硬肉桃品種，1個黃桃品種和1個白桃品種，3個來自日本的品種(‘紅清水’、‘千丸’和‘千姬’)聚在了一起；第V組主要由12個直枝型觀賞桃品種組成；第VI組則為3個垂直型觀賞桃品種。

圖1 基于Jaccard系數(shù)的聚類分析

供試材料的Nei’s基因多樣性指數(shù)在種級水平和類群水平分別為0.603 0和0.374 0。在類群水平上，直枝桃品種群的基因多樣性指數(shù)最高，為0.858 4，除僅包含1個品種的蟠桃類群(0.315 8)、白桃類群(0.236 8)和壽星桃類群(0.250 0)外，水蜜桃的基因多樣性指數(shù)最低，為0.369 7。水蜜桃的期望雜合度與觀測雜合度也最低，分別為0.398 7和0.310 7，均遠低于種級水平的0.611 0和0.405 0。Shannon’s信息指數(shù)與基因多樣性指數(shù)呈正相關，類群的基因多樣性指數(shù)越高，其Shannon’s信息指數(shù)也越高(表6)。

表6 桃品種遺傳多樣性水平

3 討論與結(jié)論

桃EST-SSR基序類型從單核苷酸到六核苷酸共159種，其中二核苷酸重復序列占比最大，達36.43%，其最容易產(chǎn)生變異，相應的引物多態(tài)性也均較豐富。本試驗中40個桃品種在20個SSR位點上共擴增出68個多態(tài)性條帶，每對引物平均為3.4，與史紅麗等[12]在47個桃品種上報道的3.4個相同，低于俞明亮等[13]在135份桃種質(zhì)中平均每對引物擴增出5.68個多態(tài)性條帶。這并不代表本試驗中的引物多態(tài)性低，只實踐證明了供試材料種質(zhì)數(shù)量越大，遺傳背景越豐富，越容易擴增出更豐富的條帶。本試驗20對引物PIC平均為0.54，且多態(tài)率均為100%，可見其多態(tài)性均較豐富。

Murguía等[14]通過假定矩陣分析，指出Jaccard和Dice系數(shù)的分類拓撲結(jié)果和矩陣結(jié)構所產(chǎn)生結(jié)果均一致。本研究中Dice和Jaccard系數(shù)的相關系數(shù)為0.990，且兩者的系統(tǒng)樹一致性指數(shù)為1.000，但Jaccard系數(shù)的rc高于Dice系數(shù)，表明二者的計算原理可能相似，但Jaccard系數(shù)的聚類結(jié)果與其相似性結(jié)構矩陣間的相關性高于Dice系數(shù)。Phi和SM系數(shù)的聚類結(jié)果與原始遺傳相似矩陣間的擬合度則次于Dice系數(shù)。RR系數(shù)不適于SSR標記的數(shù)據(jù)分析，其rc最低，且桃等位變異數(shù)量大，使基于RR系數(shù)的相似性結(jié)構矩陣中種質(zhì)間遺傳相似度明顯降低。總體上，Jaccard和Dice系數(shù)適合桃的SSR分析。

Nei’s基因多樣性指數(shù)為評價種質(zhì)遺傳多樣性的重要指標，程中平等[15 ]于2004報道的桃基因多樣性指數(shù)在種級水平上為0.150，2007年陳巍等[16]和2014年魏姍姍等[17]檢測出的種級水平的桃基因多樣性指數(shù)分別為0.224和0.565，本研究檢測出種級水平的基因多樣性指數(shù)為0.603，可見近年來桃的變異程度正逐步上升，種質(zhì)之間的遺傳交流大，桃整體上創(chuàng)新種質(zhì)豐富。垂枝桃與其他類群桃品種間的親緣關系較遠，最先聚為1組，與程中平等[15]的各類群聚類圖結(jié)果相同，表明其變異程度較大，推測其可能較直枝桃更為進化[18]。在本研究中，供試的9個類群的遺傳多樣性，由于受資源圃材料所限，垂直桃等取樣較少，可能檢測到較低的遺傳多樣性，但是水蜜桃在供試類群中數(shù)量僅次于直枝桃，它的遺傳多樣性卻比樣本數(shù)少的垂枝桃等的3個類群的遺傳多樣性低，與程中平等[15]的研究結(jié)果相似，表明近年來成都平原地區(qū)水蜜桃的遺傳多樣性保持在較低的水平，可能是由于其主栽品種數(shù)量較少，需要加強種質(zhì)創(chuàng)新。第IV組中的‘紅清水’、‘千丸’和‘千姬’均為日本品種，它們互為不同的類群的桃品種，在聚類時表現(xiàn)出較近的親緣關系，表明地理因素為影響種質(zhì)基因交流的主因[19]。進行種質(zhì)分析時，可能出現(xiàn)同物異名的現(xiàn)象[20]，本研究中‘單粉’與‘灑紅’于組V中聚在了一起，且相似系數(shù)為1.000，前人的研究中也存在無法將二者分開的情況，但‘單粉’與‘灑紅’的形態(tài)特征具有較明顯差異，基本排除了同物異名現(xiàn)象[20]，表明這2個品種可能具有相同或相近的親本來源，同時也說明了開發(fā)并篩選驗證桃可用SSR引物的重要性。

桃在我國種植范圍廣且栽培歷史悠久，本試驗中所用的桃品種遺傳相似系數(shù)差異較大，表明了我國為桃的遺傳多樣性豐富地區(qū)，另一方面由于各桃品種遺傳資源背景相對比較復雜，在對桃進行分類和親緣關系鑒定等工作時，需要借助分子標記與傳統(tǒng)形態(tài)標記來共同完成。目前，桃的可用SSR標記數(shù)量較少，薔薇科其他物種的SSR標記數(shù)量也十分有限，因此在進行園藝植物種質(zhì)創(chuàng)新的同時也需加強與其重要農(nóng)藝性狀相關分子標記的開發(fā)與篩選工作。

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【責任編輯 莊 延】

SSR analysis on genetic diversity of peach cultivars and comparisonof different genetic similarity coefficients

YE Yuyun1, WANG Qingming1,2, MA Jianwei1, ZHANG Yinping1,CHEN Qiyang1, TANG Haoru1, ZHANG Yong1

(1 College of Horticulture, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130, China;2 Guangyuan Academy of Agricultural Sciences, Guangyuan 628017, China)

【Objective】 To develop SSR primers based on peach ESTs in NCBI database, analyze genetic diversity of the major peach cultivars in Chengdu plain, investigate the applicability of different genetic similarity coefficients in SSR analysis of peach, and provide references for research on peach germplasm resources. 【Method】In total 100 pairs of SSR primers selected from NCBI-EST database were used in PCR amplification for 12 peach cultivars with various morphology. Twenty primers which had high polymorphism and stability, and evenly distributed in eight linkage groups were selected for PCR amplification of 40 peach cultivars. Five genetic similarity coefficients were used to analyze the amplification results. 【Result】Using 20 SSR primers, 68 polymorphic alleles were detected. The number of alleles per locus ranged from 2 to 5, with an average of 3.4. The polymorphism information content ranged from 0.36 to 0.73, and with an average of 0.54. The Jaccard genetic similarity coefficient ranged from 0.106 to 1.000. The Cophenetic correlation coefficient (rc) of Jaccard coefficient was the highest being 0.772， followed by Dice coefficient being 0.719. The consistency of consensus trees between Dice and Jaccard coefficients were the highest withCIcbeing 1.000. Nei’s gene diversity index was 0.603 and 0.374 respectively at the species level and the level of different classified groups, the corresponding Shannon’s information index was 1.041 and 0.591 respectively. The 40 peach cultivars were firstly divided into two major categories which were ornamental peach and edible peach, and then subdivided into different types of groups. The clustering result basically coincided with the traditional pedigree. 【Conclusion】The SSR primers developed based on peach ESTs in NCBI database have high polymorphism and can be used for SSR analysis of peach. Jaccard and Dice coefficients are the most appropriate for SSR analysis of peach. In general, the genetic diversity of peach is abundant, but variation of the honey peach group is relatively low, and germplasm innovation of this group needs to be improved.

peach; genetic diversity; genetic similarity coefficient; EST-SSR; primer screening

2016- 07- 31 優(yōu)先出版時間：2017-04-12

葉宇蕓(1994—)，男，碩士研究生，E-mail：yeyuyun690653415@qq.com；通信作者：張 勇 (1981—)，男，副教授，博士，E-mail：zhyong@sicau.edu.cn

四川省教育廳重點項目(12ZZ011)

S662.1

A

1001- 411X(2017)03- 0039- 07

優(yōu)先出版網(wǎng)址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/44.1110.s.20170412.1419.010.html

葉宇蕓， 王清明， 馬建偉， 等.基于SSR標記的桃品種遺傳多樣性分析及遺傳相似系數(shù)比較[J].華南農(nóng)業(yè)大學學報，2017,38(3):39- 45.