巴翠玉， 張林波， 張培軍， 趙福廣, 李月紅

(1吉林農(nóng)業(yè)大學 動物科學技術(shù)學院，吉林 長春 130118； 2 吉林農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院，吉林 長春 130118；3吉林省衛(wèi)生監(jiān)測檢驗中心，吉林 長春 130000)

2株枯草芽孢桿菌的分離鑒定及特性研究

巴翠玉1,2， 張林波1,2， 張培軍3， 趙福廣1,2, 李月紅1,2

(1吉林農(nóng)業(yè)大學 動物科學技術(shù)學院，吉林 長春 130118； 2 吉林農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院，吉林 長春 130118；3吉林省衛(wèi)生監(jiān)測檢驗中心，吉林 長春 130000)

【目的】尋求適合制作水產(chǎn)類微生態(tài)制劑的益生菌?！痉椒ā?從養(yǎng)魚塘底泥和健康鯽魚Carassiusauratus腸道中分離芽孢桿菌，結(jié)合細菌形態(tài)學、生理生化特征和16S rRNA序列分析對其進行鑒定，對菌株安全性、高溫耐受性、酸性耐受性、拮抗性及產(chǎn)酶情況等特性進行研究?！窘Y(jié)果】分離到2株芽孢桿菌，分別命名為B1和B2，細菌形態(tài)學、生理生化特征和16S rRNA序列分析的結(jié)果顯示，B1和B2均為枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis。特性研究結(jié)果證實B1、B2菌株都具有較好的安全性、高溫耐受性和酸性耐受性，可對致病性大腸埃希菌Escherichiacoli、金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus、嗜水氣單胞菌Aeromonashydrophila以及溫和氣單胞菌A.sobria有良好的體外抑菌能力，均具有產(chǎn)脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶和纖維素酶的能力?！窘Y(jié)論】分離到2株性能優(yōu)良的枯草芽孢桿菌，可將其作為水產(chǎn)微生態(tài)制劑的候選菌株。

枯草芽孢桿菌； 分離鑒定； 菌株特性； 鯽魚； 16S rRNA

枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis是一類好氧產(chǎn)芽孢的革蘭陽性桿狀細菌，大小為(0.7～0.8)μm×(2～3)μm，無莢膜，有鞭毛， 能運動，廣泛存在于土壤、湖泊、海洋和動植物的體表，無致病性。菌落粗糙、不透明、擴張、污白色或微帶黃色。在營養(yǎng)缺乏的條件下，枯草芽孢桿菌停止生長，同時加快代謝作用，產(chǎn)生多種大分子的水解酶和抗生素，并誘導自身的能動性和趨化性，從而恢復生長。在極端的條件下，還可以誘導產(chǎn)生抗逆性很強的內(nèi)源孢子[1]。由于枯草芽孢桿菌具有生長速度快、營養(yǎng)簡單以及耐熱、可產(chǎn)抗逆芽孢等突出特征,而使其不僅有利于在微生態(tài)制劑生產(chǎn)、加工等環(huán)境中的存活、定殖與繁殖, 并且其成本較低，施用方便，儲存期長，因此現(xiàn)已成為一種理想的微生態(tài)制劑菌種，可有效減少或替代抗生素在養(yǎng)殖過程中的使用。我國農(nóng)業(yè)部2003年12月9日在第318號公告中公布了15種可以作為微生物飼料添加劑的菌種，其中就包括枯草芽孢桿菌。本試驗對從鯽魚腸道和養(yǎng)殖池底泥中分離到的2株芽孢桿菌進行菌落形態(tài)觀察、生理生化特征和16S rRNA 序列分析來綜合鑒定，并對其安全性、耐受性、拮抗性和產(chǎn)酶情況進行了分析，以期得到高生物活性的益生菌菌株，為進一步研制水產(chǎn)類微生態(tài)制劑提供優(yōu)良的益生菌菌種。

1 材料與方法

1.1 供試菌株及試驗材料

指示菌：嗜水氣單胞菌Aeromonashydrophila、溫和氣單胞菌A.sobria、金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus和大腸埃希菌Escherichiacoli均由吉林農(nóng)業(yè)大學水產(chǎn)研究室保存。

試驗動物：健康的當年鯽魚Carassiusauratus200尾，平均體質(zhì)量(55.42±0.58) g，購自吉林省新立城水庫。

主要試劑：產(chǎn)淀粉酶篩選培養(yǎng)基、蛋白酶篩選培養(yǎng)基和纖維素酶篩選培養(yǎng)基按趙東等[2]方法配制，產(chǎn)脂肪酶篩選培養(yǎng)基按李璟等[3]方法配制，革蘭染色試劑盒購自上海銘睿生物科技有限公司、細菌基因組DNA提取試劑盒、Taq酶等購自TaKaRa公司。

主要設備： PhoenixTM100 型全自動微生物分析儀(美國BD公司)，YXQ-LS-50A立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠)，恒溫培養(yǎng)箱(金壇市國旺試驗儀器廠 )，SW-CJ-2FD型超凈工作臺(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠)，TG-16WS臺式高速離心機(長沙湘智離心機儀器有限公司)，LifePro梯度PCR儀(杭州博日科技有限公司)，凝膠成像系統(tǒng)(基因有限公司)。

1.2 菌株的分離

無菌條件下分別取養(yǎng)殖池底泥和鯽魚腸道，加入無菌的生理鹽水制成勻漿，將勻漿稀釋至合適稀釋度，取其中3個最適稀釋度的稀釋液200 μL涂布于芽孢桿菌分離培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。挑取形態(tài)一致的優(yōu)勢菌群進行純培養(yǎng)，待菌落形態(tài)生長一致時，挑取單菌落，用體積分數(shù)為80%的甘油對其進行菌落的保藏，備用。

1.3 菌株的鑒定

1.3.1 形態(tài)學及生理生化鑒定 觀察菌落形態(tài)及革蘭染色效果，并用PhoenixTM100 型全自動微生物分析儀，參考說明書方法對菌落進行生理生化鑒定。

1.3.2 16S rRNA序列分析鑒定 16S rRNA序列擴增參考魏亞松等[4]設計的特異性引物：正向引物Primer A 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，反向引物Primer B：5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′，由上海生工生物工程有限公司合成。用細菌基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA，以此為模板進行PCR擴增。PCR反應體系(50 μL)：TaKaRa LA-Taq0.5 μL， DNA模板2 μL，10×PCR Buffer 5 μL，dNTP Mixture 8 μL，上、下游引物各2 μL，雙蒸水30.5 μL。PCR程序：94 ℃預變性5 min，94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物純化后交由上海生工生物工程有限公司進行測序。測序結(jié)果通過NCBI數(shù)據(jù)庫進行Blast比對分析，通過MEGA5.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 安全性試驗

試驗鯽魚經(jīng)1周馴化后，選擇適應環(huán)境、體格健壯的鯽魚200尾，隨機分4組，1組為對照組，其余3組為試驗組(試驗I、II和III組)，每組50尾魚，采用腹腔注射方法，對照組每尾魚注射0.1 mL無菌液體LB，3個試驗組分別注射0.1 mL含有芽孢桿菌菌懸液1×109、1×108和1×107cfu·mL-1的液體LB。23 ℃ 水溫條件下飼養(yǎng) 7 d，觀察并記錄死亡情況，最后剖檢，觀察有無病變。

1.5 高溫耐受性試驗

參照文獻[5]的方法，將菌株用液體LB培養(yǎng)基培養(yǎng) 48 h后， 3 500 r· min-1離心 30 min，取上清液，無菌操作將其稀釋至一定的倍數(shù)，將最后2個梯度各分成3組，分別置于 80、90和100 ℃水浴鍋中30 min，流水冷卻，以室溫下未經(jīng)水浴的菌株培養(yǎng)作為對照，采用平板計數(shù)法計算水浴后的存活率，據(jù)此判斷其對溫度的耐受性，每個試驗重復3次。

1.6 酸性耐受性試驗

參照文獻[6]，將芽孢桿菌菌懸液分別接種到pH為3.0、4.0、5.0的液體LB培養(yǎng)基中，使芽孢桿菌初始濃度約為1×106cfu·mL-1，37 ℃條件下 120 r· min-1搖床中培養(yǎng)，1 h后取200 μL涂布于固體培養(yǎng)基上，進行平板計數(shù)，計算存活率，每個試驗重復3次。

1.7 體外抑菌試驗

采用牛津杯法測定各個菌株的抑菌活性[7]?；罨甘揪脱挎邨U菌，調(diào)整菌濃度為106cfu·mL-1，取指示菌200 μL用涂布棒均勻涂布于固體LB平板，取無菌牛津杯置于其上，使其緊貼于培養(yǎng)基上，每個牛津杯加入0.2 mL 芽孢桿菌菌液。將平板置于30 ℃恒溫箱培養(yǎng)24 h后測抑菌圈直徑，計算抑菌圈與菌圈直徑的比值。試驗重復3次。

1.8 產(chǎn)酶試驗

1.8.1 平板法胞外酶活性初篩 挑選單菌落點種于纖維素酶篩選培養(yǎng)基、淀粉酶篩選培養(yǎng)基、蛋白酶篩選培養(yǎng)基和脂肪酶篩選培養(yǎng)基，37 ℃條件下培養(yǎng)48 h后觀察，如有透明圈則表示細菌產(chǎn)酶。觀察淀粉酶篩選培養(yǎng)基時需滴加魯哥氏碘液。計算水解圈與菌落直徑的比值，其大小表示初篩酶活性。

1.8.2 發(fā)酵液法胞外酶活性測定 選取胞外酶活性初篩結(jié)果中4種胞外酶均有活性的菌株進行胞外酶活性測定。淀粉酶活性采用碘-淀粉比色法[8]測定，纖維素酶活性采用羧甲基纖維素鈉鹽( CMC-Na) 酶活性測定方法[9]測定，蛋白酶活性采用福林酚法[10]測定。脂肪酶活性采用橄欖油乳化液法[11]測定。

1.9 數(shù)據(jù)處理

用Excel統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)，試驗結(jié)果用平均數(shù)±標準差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學及生理生化鑒定結(jié)果

從養(yǎng)殖池底泥和鯽魚腸道中各分離出1株芽孢桿菌，分別命名為B1和B2。2株菌的菌落形態(tài)都呈白色近似圓形，不透明，表面干燥沒有光澤，中間褶皺邊緣不整齊；革蘭染色結(jié)果為陽性，在顯微鏡下觀察菌體呈桿狀，兩端鈍圓，孢囊無明顯膨脹，無伴孢晶體。用PhoenixTM100 型全自動微生物分析儀對菌株B1和B2 進行鑒定，結(jié)果見表1，參照《伯杰細菌鑒定手冊》及儀器分析結(jié)果，初步鑒定這2株菌均為枯草芽孢桿菌。

表1 菌株生化鑒定結(jié)果1)

1)“+ ”表示生化反應陽性; “- ”表示生化反應陰性。

2.2 分子生物學鑒定結(jié)果

以菌株B1和B2的基因組DNA為模板進行PCR擴增，結(jié)果擴增到特異性的16S rRNA片段大小為1 500 bp(圖1)。將2株菌的測序結(jié)果在NCBI中進行Blast比對，結(jié)果表明：菌株B1與菌株BacillussubtilisBS3902(登錄號：EU047884.1)的序列相似性為99%；菌株B2與B.subtilisAER314-2(登錄號：KR967391.1)的序列相似性為99%。通過MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，結(jié)果顯示菌株B1和B2都與枯草芽孢桿菌親緣關系最近，聚類為一支(圖2)。

M:250 bp DNA marker DL4500；1：菌株B1；2：菌株B2 。

圖1 菌株 16S rRNA PCR擴增結(jié)果

Fig.1 PCR amplification of 16S rRNA gene in two strains

圖2 菌株16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育分析

2.3 安全性試驗結(jié)果

注射0.1 mL濃度分別為1×109、1×108和1×107cfu·mL-1的枯草芽孢桿菌菌懸液后，與對照組相比，鯽魚未出現(xiàn)死亡，解剖發(fā)現(xiàn)對照組和試驗組內(nèi)臟菌正常無變異。說明2株枯草芽孢桿菌都有很好的安全性。

2.4 高溫耐受性試驗結(jié)果

高溫耐受性試驗結(jié)果見表2。由表2可知，2株枯草芽孢桿菌對不同溫度的耐受性不同，在相同時間(30 min)內(nèi)，菌株在80 ℃條件下的存活率明顯高于100 ℃條件下的存活率，并隨著溫度的上升存活率不斷下降。表2數(shù)據(jù)顯示，菌株B2對高溫的耐受能力略強于B1。

表2 不同水浴溫度下枯草芽孢桿菌的存活率

Tab.2 The livability ofBacillussubtilisstrain under different temperatures%

2.5 酸性耐受性試驗結(jié)果

由表3可知，2株芽孢桿菌分別在pH 3.0、4.0、5.0條件下處理1 h后的存活率都在97%以上，說明2個菌株都有較好的酸性耐受能力。在pH3.0、4.0和5.0條件下，菌株B1的存活率分別為97.16%、98.43%和99.27%，菌株B2的存活率分別為97.37%、98.83%和99.43%。

表3 不同pH環(huán)境下枯草芽孢桿菌的存活率

Tab.3 The livability ofBacillussubtilisstrain under different pH%

2.6 體外抑菌試驗結(jié)果

以大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、嗜水氣單胞菌和溫和氣單胞菌為指示菌，進行抑菌性分析，抑菌圈直徑大小可反映這2株枯草芽孢桿菌對致病菌體外抑制能力的強弱，結(jié)果見表4，菌株B2的抑菌圈/菌圈直徑比數(shù)值上均大于菌株B1，說明菌株B2比B1對這4種指示菌可能有較強的抑制作用。

表4 枯草芽孢桿菌對指示菌的拮抗作用

2.7 產(chǎn)酶試驗結(jié)果

2.7.1 平板法胞外酶活性初篩結(jié)果 由表5可以看出，菌株B1和B2都可產(chǎn)淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶和纖維素酶，不同菌株產(chǎn)酶種類和能力不同。對于2株枯草芽孢桿菌，反映其產(chǎn)淀粉酶能力的染色圈直徑/菌落直徑(H/C)及產(chǎn)蛋白酶能力的H/C數(shù)值上均為B2>B1；反映其產(chǎn)纖維素酶能力的H/C及產(chǎn)脂肪酶能力的H/C數(shù)值上均為B1>B2；說明菌株B2較B1產(chǎn)淀粉酶和蛋白酶能力水平可能較高，產(chǎn)纖維素酶和脂肪酶能力可能稍弱。

表5 不同菌株胞外酶活性初篩結(jié)果

2.7.2 發(fā)酵液法胞外酶活性測定結(jié)果 因發(fā)現(xiàn)平板法H/C不能完全代表菌株產(chǎn)酶能力，所以對產(chǎn)酶菌株進行發(fā)酵液法胞外酶產(chǎn)酶活性測定是非常必要的。由表6可以看出，產(chǎn)蛋白酶、纖維素酶和脂肪酶活力較高的菌株為B2，產(chǎn)淀粉酶活力較高的菌株為B1，與初篩結(jié)果有所不同。

表6 不同菌株發(fā)酵液的胞外酶活性

3 討論與結(jié)論

近年來，芽孢桿菌類微生態(tài)制劑被廣泛應用于水產(chǎn)養(yǎng)殖以替代或減少抗生素的使用，降低其帶來的危害，使用的芽孢桿菌類型也是多種多樣?？莶菅挎邨U菌因在缺乏營養(yǎng)或不良環(huán)境時，可以通過生成內(nèi)生孢子來增強其抗逆性，并且其耐加工、耐儲藏、耐胃酸，穩(wěn)定性較好，也可以通過孢子形式進入到消化道，并且可與腸道上的特異性結(jié)合位點結(jié)合，形成優(yōu)勢菌群，進行生物奪氧，也可以產(chǎn)生多種代謝物質(zhì)，抑制病原菌的生長，是較好的微生態(tài)制劑菌種，具有開發(fā)為微生態(tài)制劑的潛在優(yōu)勢。胡凡光等[12]選用從健康大菱鲆魚Psettamaxima體腸道分離培養(yǎng)的同源枯草芽孢桿菌制成的飼料添加劑對大菱鲆進行促生長影響的研究。結(jié)果表明：與對照組相比試驗組降低了飼料系數(shù)，提高了蛋白質(zhì)效率和增重率。李衛(wèi)芬等[13]將草魚Ctenopharyngodonidellus試驗組飼喂含枯草芽孢桿菌( 108cfu·kg-1) 的基礎日糧，結(jié)果發(fā)現(xiàn):試驗組腸道內(nèi)容物中胰蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性比對照組顯著提高；肝胰臟中脂肪酶和胰蛋白酶活性也比對照組顯著提高。腸道菌群數(shù)量分析顯示，與對照組相比，試驗組腸道芽孢桿菌和假單胞菌數(shù)量極顯著提高，而致病性弧菌和大腸埃希菌數(shù)量卻極顯著降低。丁祥力等[14]從淡水養(yǎng)殖污水和底泥中分離出1株枯草芽孢桿菌WH-5，試驗證明其具有改善淡水養(yǎng)殖水體水質(zhì)的有效作用。

微生態(tài)制劑在生產(chǎn)過程中一般把篩選益生菌作為關鍵的一步，因為種屬特異性是篩選合適益生菌的一個先決條件，不同來源的芽孢桿菌在不同動物胃腸道內(nèi)的黏附繁殖能力及相關生理功能有所不同，故一般認為從相應的水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境分離菌株用于篩選水產(chǎn)微生態(tài)制劑更具合理性，所以本試驗從養(yǎng)殖池底泥和鯽魚腸道中進行芽孢桿菌的分離，分離得到2株芽孢桿菌，分別命名為B1和B2。運用傳統(tǒng)的細菌形態(tài)學觀察、生理生化試驗及16S rRNA序列對分離出的2株芽孢桿菌進行分析鑒定，結(jié)果B1和B2均為枯草芽孢桿菌。優(yōu)良的水產(chǎn)微生態(tài)制劑應具備安全、耐高溫、抗酸腐蝕、抑菌能力強、可產(chǎn)酶等特點[15]，故本試驗從這幾方面對B1和B2這2株枯草芽孢桿菌的益生特性進行了探究。菌株安全性試驗結(jié)果表明，這2株枯草芽孢桿菌均具有安全性，無致病能力。高溫耐受性和pH耐受性試驗發(fā)現(xiàn)，這2株枯草芽孢桿菌均具有良好的耐高溫和耐酸能力，且B2菌株的效果數(shù)值上好于B1菌株。體外抑菌試驗的抑菌能力：B2>B1，兩者均對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、嗜水氣單胞菌和溫和氣單胞菌有抑制效果，對大腸埃希菌的抑制效果最好。產(chǎn)酶試驗結(jié)果表明：B1和B2菌株都能夠分泌淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶和脂肪酶，有望用于魚蝦等的飼料添加劑，促進魚蝦生長及提高飼料利用率；同時，可利用枯草芽孢桿菌分解養(yǎng)殖水體中過剩餌料中的有機物，凈化水體及脫氮[16]。因此，枯草芽孢桿菌B1和B2適合用于研發(fā)水產(chǎn)類微生態(tài)制劑，并需進一步研究其功能和機理。本研究為進一步研制水產(chǎn)類微生態(tài)制劑提供了優(yōu)良的益生菌菌種參考。

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【責任編輯 李曉卉】

Isolation, identification and characterization oftwo strains ofBacillussubtilis

BA Cuiyu1,2， ZHANG Linbo1,2， ZHANG Peijun3, ZHAO Fuguang1,2， LI Yuehong1,2

(1 Animal Science and Technology College，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China；2 College of Life Sciences，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China;3 Jilin Province Health Surveillance Inspection Center，Changchun 130000，China)

【Objective】 To explore potential probiotics in order to develop microecological agents for aquiculture.【Method】Bacillusstains were isolated from the pond sediment and healthy carp (Carassiusauratus) intestine. The strains were identified by the morphological, physiological and biochemical characteristics and 16S rRNA sequence analysis. The safety, high temperature tolerance, pH tolerance, antagonistic effects and enzyme production of the strains were studied.【Result】 TwoBacillusstrains were isolated and named B1 and B2. They were identified asB.subtilisby morphology, physiological and biochemical characteristics and 16S rRNA sequence analysis. The B1 and B2 strains had good safety, high temperature tolerance and strong tolerance of acid. They had good antibacterial activity against pathogenicEscherichiacoli,Staphylococcusaureus,AeromonashydrophilaandA.sobriainvitro, and had the ability to produce lipase, amylase, protease and cellulase. 【Conclusion】TwoB.subtilisstrains were isolated, and both can be used as candidates for developing microecological agents for aquiculture.

Bacillussubtilis; isolation and identification; strain characteristic；Carassiusauratus；16S rRNA

2016- 06- 22 優(yōu)先出版時間：2017-04-12

巴翠玉(1992—)，女，碩士研究生，E-mail：bacuiyu@163.com； 通信作者：李月紅(1968—)，女，教授，博士，E-mail：liyhong@sina.com

國家自然科學基金(30972191)；吉林省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(201506)，吉林省留學人員創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項目(201523)

S917.1

A

1001- 411X(2017)03- 0046- 06

優(yōu)先出版網(wǎng)址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/44.1110.s.20170412.1427.018.html

巴翠玉， 張林波， 張培軍， 等.2株枯草芽孢桿菌的分離鑒定及特性研究[J].華南農(nóng)業(yè)大學學報，2017,38(3):46- 51.