賈 坤， 韓太光， 遠(yuǎn)立國(guó)， 孫凌霜， 寧章勇， 王 衡， 李守軍

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院/廣東省獸醫(yī)臨床重大疾病綜合防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省寵物工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510642)

牛流行熱病毒可視化RT-LAMP檢測(cè)技術(shù)的建立及應(yīng)用

賈 坤， 韓太光， 遠(yuǎn)立國(guó)， 孫凌霜， 寧章勇， 王 衡， 李守軍

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院/廣東省獸醫(yī)臨床重大疾病綜合防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省寵物工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510642)

【目的】建立一種能夠快速、簡(jiǎn)便、可視化地檢測(cè)牛流行熱病毒的分子生物學(xué)方法?！痉椒ā扛鶕?jù)牛流行熱病毒G蛋白基因的6個(gè)保守區(qū)域設(shè)計(jì)2對(duì)引物，建立牛流行熱病毒可視化逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification，RT-LAMP)檢測(cè)技術(shù)，優(yōu)化RT-LAMP的反應(yīng)條件，將其與PCR方法進(jìn)行比較?！窘Y(jié)果】當(dāng)Mg2+濃度為3 mmol·L-1、甜菜堿濃度為0.4 mol·L-1、dNTPs mix濃度為1.2 μmol·L-1、內(nèi)外引物濃度比例為8∶1、反應(yīng)溫度為63 ℃時(shí),反應(yīng)梯形條帶最明顯，在反應(yīng)40 min后可以觀察到明顯的梯形條帶。建立的RT-LAMP檢測(cè)方法特異性好，只對(duì)牛流行熱病毒進(jìn)行擴(kuò)增；靈敏度比普通PCR高10倍。【結(jié)論】該方法操作簡(jiǎn)便，特異性強(qiáng)，結(jié)果判讀方便，可用于牛流行熱的快速檢測(cè)。

牛流行熱； 病毒檢測(cè)； RT-LAMP； PCR； 靈敏性； 特異性

牛流行熱是由牛流行熱病毒(Bovine ephemeral fever virus, BEFV)引起的一種非接觸傳染性疾病，黃牛、奶牛和水牛易感，其他反芻動(dòng)物也可感染本病[1]。該病主要由蚊蟲叮咬而傳播，臨床上以突然發(fā)熱、精神沉郁、大量流涎、僵硬、跛行，甚至臥地不起等為特征。本病傳播迅速，發(fā)病率高，病死率近年來(lái)有所上升，甚至出現(xiàn)急性呼吸衰竭病例。本病通常呈周期性流行，每隔3～5年發(fā)生1次較大規(guī)模的流行，發(fā)病季節(jié)多為5—10月份。世界多地均有此病流行[2]。我國(guó)最早在1955年就出現(xiàn)過本病的報(bào)道，1976年首次分離到牛流行熱病毒株JB76H[3-4]。廣東地區(qū)近幾年均有發(fā)生，該病的發(fā)生周期有變短的趨勢(shì)，嚴(yán)重危害養(yǎng)牛業(yè)[4]。

牛流行熱的常規(guī)診斷方法為血清學(xué)檢測(cè)方法[5-7]，目前，國(guó)內(nèi)主要采用微量血清中和試驗(yàn)方法，由于需使用活病毒，且在試驗(yàn)前需要測(cè)定病毒的TCID50，不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力，檢測(cè)周期長(zhǎng)，影響了牛流行熱的快速診斷，還存在病毒污染擴(kuò)散的風(fēng)險(xiǎn)。ELISA檢測(cè)技術(shù)的建立，某種程度也為牛流行熱抗體的篩查提供了便利條件[8]，核酸檢測(cè)技術(shù)中的普通PCR和熒光定量PCR等技術(shù)，具有敏感、快速、特異和高通量等優(yōu)點(diǎn)[9-10]，已廣泛用于多種重要疫病病原體的檢測(cè)，劉志玲等[11]建立了牛流行熱病毒LUX-TM熒光RT-PCR檢測(cè)方法，具有較好的檢測(cè)準(zhǔn)確度和靈敏度，但是熒光定量檢測(cè)需要昂貴的儀器，且檢測(cè)試劑成本較高。建立快速高效、低成本的分子生物學(xué)診斷方法，對(duì)牛流行熱的防控具有重要的意義。

逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Reverse transcription loop-mediated isthermal amplification，LAMP)技術(shù)的出現(xiàn)，在多種病原的檢測(cè)方面發(fā)揮了巨大的作用，尤其是該方法簡(jiǎn)便、易于操作，對(duì)儀器設(shè)備要求不高，適合臨床生產(chǎn)一線使用[12-14]。通過對(duì)LAMP技術(shù)的改進(jìn)，在反應(yīng)體系中加入顯色成分鈣黃綠素，還能實(shí)現(xiàn)反應(yīng)產(chǎn)物的可視化[15]。這樣直接通過肉眼觀察顏色變化即可判定結(jié)果，具有較好的臨床應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 病毒RNA

2013—2015年廣東地區(qū)牛流行熱流行期病?？鼓杀緦?shí)驗(yàn)室采集保存，赤羽病病毒(Akabane virus, AKV)核酸、牛傳染性鼻氣管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus, IBRV)核酸、牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus, BVDV)核酸由廣東檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心動(dòng)檢實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。

1.2 試劑

RNA抽提試劑盒購(gòu)自Invitrogen；AMV Reverse Transcriptase購(gòu)自Promega公司；Bst DNA 聚合酶購(gòu)自TOYOBO公司；甜菜堿購(gòu)自Sigma公司。

1.3 儀器

Bio-Rad梯度PCR儀、Bio-Rad型電泳儀：美國(guó)Bio-Rad公司生產(chǎn)；凝膠成像系統(tǒng)：美國(guó)Alpha公司生產(chǎn)；5810R冷凍離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf公司生產(chǎn)；恒溫水浴箱：德國(guó)GFL公司生產(chǎn)。

1.4 引物的設(shè)計(jì)與合成

參照Genbank中BEFV糖蛋白G的基因序列，應(yīng)用DNAStar 7.0軟件MegAlign 5.0程序進(jìn)行分析，利用在線軟件(http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html)在序列保守區(qū)域設(shè)計(jì)LAMP 引物(表1)，其中，F(xiàn)3、B3為外引物，F(xiàn)IP、BIP為內(nèi)引物。

表1 LAMP引物

1.5 模板的制備

按照RNA抽提試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行病毒RNA的抽提，提取的RNA在-80 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 RT-LAMP方法的優(yōu)化及建立

參照國(guó)內(nèi)其它病毒的LAMP檢測(cè)反應(yīng)體系，以牛流行熱病毒RNA為模板，先建立一個(gè)25 μL LAMP反應(yīng)體系：5 mmol·L-1的 甜菜堿 5.0 μL、100 mmol·L-1的MgSO41.0 μL、8 U·μL-1的Bst DNA 聚合酶1.0 μL、10×Bst DNA 聚合酶緩沖液2.5 μL、10 mmol·L-1的 dNTPs 3.0 μL、BIP(20 μmol·L-1)2.0 μL +FIP(20 μmol·L-1)2.0 μL、F3(20 μmol·L-1)2.0 μL +B3(20 μmol·L-1)2.0 μL、模板RNA 1 μL、5 U·μL-1的AMV 反轉(zhuǎn)錄酶1.0 μL、RNase inhibitor 0.5 μL、加DEPC水至25 μL。陰性對(duì)照模板為DEPC水，反應(yīng)后用15 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。

之后根據(jù)反應(yīng)優(yōu)化策略，對(duì)Mg2+濃度、甜菜堿濃度、Bst DNA聚合酶濃度、dNTP濃度、引物濃度等條件分別進(jìn)行優(yōu)化。設(shè)置反應(yīng)溫度為60、61、62、63、64和65 ℃，確定最佳退火溫度。反應(yīng)時(shí)間以10 min起始，每隔10 min取樣檢測(cè)至1 h，確定最佳反應(yīng)時(shí)間。

1.7 RT-LAMP 方法的靈敏性檢測(cè)

將抽提獲得的RNA進(jìn)行10倍梯度逐級(jí)稀釋，以100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6不同稀釋液作為模板，利用所建立的RT-LAMP反應(yīng)體系和RT-PCR檢測(cè)方法進(jìn)行靈敏性比對(duì)。

1.8 RT-LAMP 方法的特異性檢測(cè)

分別抽提牛流行熱病毒(BEFV)、牛赤羽病病毒(AKV)、牛傳染性支氣管炎病毒(IBRV)、牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)RNA，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照，采用上面已經(jīng)優(yōu)化的反應(yīng)體系和條件，檢測(cè)RT-LAMP方法的特異性。

1.9 RT-LAMP 反應(yīng)產(chǎn)物的分析

LAMP反應(yīng)體系存在擴(kuò)增產(chǎn)物，在反應(yīng)前RT-LAMP體系中按體積比加入1∶10的鈣黃綠素和氯化錳，反應(yīng)結(jié)束后，樣品根據(jù)反應(yīng)結(jié)果不同而呈現(xiàn)不同顏色。使用瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析，陽(yáng)性反應(yīng)呈現(xiàn)彌散型條帶。

1.10 臨床樣品檢測(cè)

對(duì)采集自廣東地區(qū)的56份疑似病牛全血，經(jīng)RNA抽提后分別進(jìn)行LAMP檢測(cè)和普通PCR檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 LAMP反應(yīng)條件的優(yōu)化

通過對(duì)反應(yīng)體系的優(yōu)化，可見當(dāng)Mg2+濃度為3 mmol·L-1(圖1)、甜菜堿濃度為0.4 mol·L-1(圖2)、dNTPs mix濃度為1.2 μmol·L-1(圖3)、反應(yīng)溫度為63 ℃(圖4)、內(nèi)外引物濃度比例為8∶1(圖5)時(shí)反應(yīng)梯形條帶最明顯，在反應(yīng)40 min后可以觀察到明顯的梯形條帶(圖6)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，條帶變得更加清晰。

M：DL2000 Marker； 1：1 mmol·L-1； 2：2 mmol·L-1； 3：3 mmol·L-1； 4：4 mmol·L-1； 5：5 mmol·L-1； 6：6 mmol·L-1； N：陰性對(duì)照。

圖1 LAMP反應(yīng)體系Mg2+濃度的優(yōu)化

Fig.1 Optimization of Mg2+concentration in the LAMP reaction system

M：DL2000 Marker；1：0.4 mol·L-1；2：0.6 mol·L-1；3：0.8 mol·L-1； 4：1.0 mol·L-1； 5：1.2 mol·L-1； 6：1.4 mol·L-1； N：陰性對(duì)照。

圖2 LAMP反應(yīng)體系甜菜堿濃度的優(yōu)化

Fig.2 Optimization of betaine concentration in the LAMP reaction system

M：DL2000 Marker；1：0.8 μmol·L-1；2：1.2 μmol·L-1；3：1.6 μmol·L-1； 4：2.0 μmol·L-1； 5：2.4 μmol·L-1； 6：2.8 μmol·L-1； 7：3.2 μmol·L-1； N：陰性對(duì)照。

圖3 LAMP反應(yīng)體系dNTPs mix濃度的優(yōu)化

Fig.3 Optimization of dNTPs mix concentration in the LAMP reaction system

M：DL2000 Marker； 1：60℃； 2：61℃； 3：62℃； 4：63℃； 5：64℃； 6：65℃。

圖4 LAMP反應(yīng)溫度的優(yōu)化

Fig.4 Optimization of LAMP reaction temperature

M：DL2000 Marker； 1：0.2 μmol·L-1(FIP+BIP), 0.2 μmol·L-1(F3+B3)； 2：0.2 μmol·L-1(FIP+BIP), 0.4 μmol·L-1(F3+B3)； 3：0.2 μmol·L-1(FIP+BIP), 0.8 μmol·L-1(F3+B3)； 4：0.2 μmol·L-1(FIP+BIP), 1.0 μmol·L-1(F3+B3)； 5：0.2 μmol·L-1(FIP+BIP), 1.2 μmol·L-1(F3+B3)； 6：0.2 μmol·L-1(FIP+BIP), 1.6 μmol·L-1(F3+B3)； 7：0.2 μmol·L-1(FIP+BIP), 1.8 μmol·L-1(F3+B3)； 8：0.2 μmol·L-1(FIP+BIP), 2.0 μmol·L-1(F3+B3)； N：陰性對(duì)照。

圖5 LAMP反應(yīng)體系內(nèi)外引物比例優(yōu)化

Fig.5 Optimization of the ratio of inner to outer primers in the LAMP reaction system

M：DL2000 Marker； 1：10 min； 2：20 min； 3：30 min； 4：40 min； 5：50 min； 6：60 min。

圖6 LAMP反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化

Fig.6 Optimization of LAMP reaction time

2.2 靈敏度試驗(yàn)

由圖7可見，在將RNA原液稀釋100、10-1、10-2和10-3倍后作為模板時(shí)，LAMP擴(kuò)增的產(chǎn)物都出現(xiàn)明顯的梯形條帶，而普通PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物只有當(dāng)RNA原液稀釋100、10-1和10-2倍出現(xiàn)明顯的條帶，兩者的檢測(cè)靈敏度相比，LAMP的檢測(cè)靈敏度提高了10倍。

A: LAMP擴(kuò)增 B: PCR擴(kuò)增

M：DL2000 Marker； 1～6：RNA稀釋倍數(shù)依次為100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-6。

圖7 LAMP擴(kuò)增與PCR靈敏性對(duì)比

Fig.7 Sensitivity comparison of LAMP and PCR

2.3 特異性試驗(yàn)

分別以BEFV、AKV、IBRV、BVDV作為樣品，檢測(cè)建立的LAMP方法的特異性。從圖8中可以看出，只有以BEFV陽(yáng)性樣品為模板的泳道內(nèi)出現(xiàn)了明顯的梯形條帶，其他樣品為陰性。結(jié)果表明LAMP引物對(duì)BEFV具有專一性，依此可區(qū)分與牛流行熱癥狀相似的一些牛病。

2.4 可視化LAMP檢測(cè)

LAMP反應(yīng)體系存在擴(kuò)增產(chǎn)物，在反應(yīng)前RT-LAMP體系中按體積比加入1:10的鈣黃綠素和氯化錳，反應(yīng)結(jié)束后，陽(yáng)性樣品呈淺綠色，陰性樣品呈橘紅色(圖9)。

M：DL2000 Marker； 1：BEFV(牛流行熱病毒)； 2：AKV(赤羽病病毒)； 3：IBRV(牛傳染性鼻氣管炎病毒)； 4：BVDV(牛病毒性腹瀉病毒)； N：陰性對(duì)照。

圖8 BEFV LAMP反應(yīng)特異性

Fig.8 Specificity of the LAMP assay detecting BEFV

1：陰性樣品； 2～4：陽(yáng)性樣品。

2.5 臨床樣本檢測(cè)

對(duì)臨床采集的56份疑似牛流行熱樣品進(jìn)行檢測(cè)。PCR方法檢測(cè)出5份陽(yáng)性樣品，陽(yáng)性檢出率為8.93%，而LAMP方法則檢測(cè)出6份陽(yáng)性樣品，陽(yáng)性檢出率為10.70%。

3 討論與結(jié)論

LAMP是一種在恒溫條件下，高效、特異、快速的擴(kuò)增靶標(biāo)序列的核酸檢測(cè)技術(shù)[11]。本研究在牛流行熱病毒G蛋白基因的6個(gè)位點(diǎn)設(shè)計(jì)4條引物，通過對(duì)反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立了可視化RT-LAMP檢測(cè)方法。利用該方法對(duì)牛流行熱病毒(BEFV)及IBRV、AKAV、BVDV的RNA進(jìn)行特異性檢測(cè)，結(jié)果表明該可視化LAMP檢測(cè)方法對(duì)BEFV具有良好的特異性，對(duì)BEFV病料中核酸的最低檢測(cè)限是常規(guī)PCR靈敏度的10倍。采用該方法對(duì)臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，其中陽(yáng)性檢出率為10.70%，高于普通PCR的檢出率(8.93%)。為了便于結(jié)果的觀測(cè)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)LAMP檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行顯色反應(yīng)[15]。目前的研究中多數(shù)采用SYBR Green I，該方法需在反應(yīng)結(jié)束后打開反應(yīng)管，加入SYBR Green I方能發(fā)揮顯色指示作用，根據(jù)顏色的不同，從而判定檢測(cè)結(jié)果，該方法簡(jiǎn)便易行，試劑也相對(duì)便宜，但是顯色反應(yīng)需要開蓋添加SYBR Green I，這時(shí)容易產(chǎn)生氣溶膠，由于LAMP反應(yīng)本身的高特異性和靈敏性，極易導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)室污染，產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果。也有研究者使用濁度儀實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)LAMP反應(yīng)結(jié)果，但該方法在實(shí)際操作中要使用價(jià)格昂貴的濁度儀，不利于基層實(shí)驗(yàn)室開展檢測(cè)工作。本研究利用鈣黃綠素與Mn2+結(jié)合而不發(fā)熒光，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，產(chǎn)生了大量更易與Mn2+結(jié)合的焦磷酸根離子，從而釋放鈣黃綠素，游離的鈣黃綠素可自發(fā)熒光，且Mg2+存在的環(huán)境中熒光效果得到加強(qiáng)的原理，使用鈣黃綠素+Mn2+混合液替代SYBR Green I進(jìn)行結(jié)果顯色指示[15]，無(wú)需開蓋，直接通過肉眼觀察顏色變化即可判定檢測(cè)結(jié)果[15]。

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【責(zé)任編輯 李曉卉】

Establishment and application of visual RT-LAMP technologyfor detecting bovine ephemeral fever virus

JIA Kun, HAN Taiguang, YUAN Liguo, SUN Lingshuang, NING Zhangyong, WANG Heng, LI Shoujun

(College of Veterinary Medicine，South China Agricultural University/Key Laboratory of Prevention and Control for Severe ClinicalAnimal Diseases of Guangdong Province/Guangdong Technological Engineering Research Center for Pet, Guangzhou 510642, China)

【Objective】 To develop a rapid, convenient and visual molecular assay for detecting bovine ephemeral fever virus (BEFV). 【Method】Two pairs of primers based on six conserved regions in G protein gene of BEFV were designed, and the visual reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) assay for detecting BEFV was developed. The reaction conditions of RT-LAMP assay were optimized, and the assay was compared with PCR.【Result】 The reaction ladder bands from the RT-LAMP assay were most obvious when the RT-LAMP reaction system contained 3 mmol·L-1Mg2+, 0.4 mol·L-1betaine and 1.2 μmol·L-1dNTPs mix, the ratio of inner to outer primers was 8∶1, and the reaction temperature was 63 ℃. Clear reaction ladder bands were observed after 40 min of reaction. The established RT-LAMP assay had excellent specificity with only BEFV being amplified. The sensitivity was 10 times higher than that of ordinary PCR.【Conclusion】The visual RT-LAMP assay is easy to operate and highly specific, and the results can be conveniently determined. This method can be used for the rapid detection of bovine epidemic fever.

bovine ephemeral fever; virus detection; RT-LAMP; PCR; sensitivity; specificity

2016- 06- 27 優(yōu)先出版時(shí)間：2017-04-12

賈 坤(1981—)，男，講師，博士，E-mail：jiakun@scau.edu.cn；通信作者：李守軍(1968—)，男，教授，博士，E-mail: shoujunli@scau.edu.cn

廣東省科技計(jì)劃(2015B020203005，2015A020224039)；廣東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新聯(lián)盟建設(shè)項(xiàng)目(2016LM2150)；廣州市珠江科技新星專項(xiàng)(201610010073)

S854；S855

A

1001- 411X(2017)03- 0015- 06

優(yōu)先出版網(wǎng)址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/44.1110.s.20170412.1429.020.html

賈 坤， 韓太光， 遠(yuǎn)立國(guó)， 等.牛流行熱病毒可視化RT-LAMP檢測(cè)技術(shù)的建立及應(yīng)用[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2017,38(3):15- 20.