舒燦偉， 曾 蕊， 楊 媚， 周而勛

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院/廣東省微生物信號與作物病害防控重點實驗室，廣東 廣州 510642)

香蕉枯萎病菌4個生理小種核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)的RFLP分析

舒燦偉， 曾 蕊， 楊 媚， 周而勛

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院/廣東省微生物信號與作物病害防控重點實驗室，廣東 廣州 510642)

【目的】明確香蕉枯萎病菌Fusariumoxysporumf. sp.cubense4個生理小種的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。【方法】 利用PCR擴增該病菌4個生理小種的核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Internal transcribed spacer, ITS)，利用AIuI、HpaII和TaqI 3種限制性內(nèi)切酶對這些小種的ITS產(chǎn)物進行RFLP分析。【結(jié)果】 PCR擴增結(jié)果表明：來自4個生理小種的8個菌株均可擴增得到568 bp的ITS單一片段，但這些生理小種間的片段沒有明顯的多態(tài)性；對這些生理小種ITS產(chǎn)物進行RFLP分析發(fā)現(xiàn)，不同生理小種之間的差異很小?！窘Y(jié)論】 PCR-RFLP技術(shù)不適用香蕉枯萎病菌生理小種的分析鑒定。

香蕉枯萎病菌； 生理小種； 內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)； 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)； 限制性片段長度多態(tài)性

目前對香蕉枯萎病菌4個生理小種分子鑒定的報道較少。應(yīng)用核糖體DNA(Ribosomal DNA, rDNA)ITS序列的保守性鑒定菌種是植物病原菌分子鑒定中較常用的方法[5-8]?；贒NA限制性片段長度多態(tài)性(Restriction fragment length polymorphism，RFLP)的遺傳標(biāo)記技術(shù)目前已成為對生物物種及種以下單元分類的常用方法[5, 9-12]。

本研究利用真菌通用引物ITS4/ITS5對香蕉枯萎病菌不同生理小種的ITS序列進行擴增，并進行RFLP分析，旨在尋找香蕉枯萎病菌不同生理小種 ITS 序列的差異，闡明該方法是否可用于區(qū)分香蕉枯萎病菌的不同生理小種。

1 材料與方法

1.1 材料

1號生理小種WG02菌株、2號生理小種WG03菌株、3號生理小種WG04菌株、4號生理小種WG05菌株由澳大利亞Bentley博士惠贈。4號生理小種Z13和Z16菌株，1號生理小種Z14和Z15菌株，由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理系研究室姜子德教授提供。

限制性內(nèi)切酶AluI、HpaII和TaqI購于寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 真菌總DNA的提取及ITS序列的擴增 提取以上4個生理小種8個菌株的基因組DNA，具體方法參照OMEGA公司的真菌DNA提取試劑盒說明書。以香蕉枯萎病菌4個生理小種8個菌株的基因組DNA為模板，采用ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)和ITS5(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)引物PCR，擴增體系如下：10×緩沖液2.5 μL， 2.5 mmol·L-1dNTP 2 μL，5 μmol·L-1引物各1 μL， 5 U·μL-1Taq酶0.2 μL，模板DNA約30 ng，ddH2O 17.5 μL。PCR擴增程序為: 95 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性45 s，56 ℃復(fù)性45 s， 72 ℃延伸1.5 min，30個循環(huán)； 72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后取5 μL PCR產(chǎn)物電泳。將陽性PCR產(chǎn)物純化、連接和克隆，挑選出陽性轉(zhuǎn)化子，送北京奧科基因公司測序，每個菌株重復(fù)測序3次。PCR產(chǎn)物的測序結(jié)果用DNAMAN軟件和BLAST進行序列比對和同源性分析。

1.2.2 ITS-RFLP分析 將15 μL ITS-PCR產(chǎn)物，0.5 μL內(nèi)切酶(5 U)，2 μL酶切緩沖液和2.5 μL ddH2O依次加入0.2 mL PCR管內(nèi)，短暫離心混勻后，放入所需溫度的水浴鍋中反應(yīng)4 h，其中AluI、HpaII限制性內(nèi)切酶反應(yīng)溫度為37 ℃，TaqI限制性內(nèi)切酶反應(yīng)溫度為65 ℃，酶切產(chǎn)物通過電泳檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同生理小種ITS-PCR擴增

“變”背后的辯證思維促使阿契貝用動態(tài)的、全面的觀點看待非洲文化和思想的發(fā)展。阿契貝不能用靜止的和孤立的方法讓非洲文化一直自產(chǎn)自銷，而是改變原有的風(fēng)格，結(jié)合英語的特點，創(chuàng)造出一種新的英語并用其書寫出獨特的非洲思想，讓邊緣化的非洲文化重回世界舞臺，讓全世界的讀者重新認(rèn)識真實和真正的非洲文化與哲學(xué)思想。

利用ITS4/ITS5和優(yōu)化的擴增條件，對香蕉枯萎病菌4個生理小種共8個菌株的rDNA-ITS區(qū)進行了擴增。PCR擴增結(jié)果表明，8個菌株擴增出的特異性條帶大小一致，位于500～700 bp，經(jīng)測序確定其大小為568 bp(圖1)。

M:DL2000 DNA Marker；1:WG02；2:WG03；3:WG04；4:WG05；5:Z13；6:Z14；7:Z15;8:Z16；9:ddH2O。

圖1 香蕉枯萎病菌4個生理小種的ITS-PCR擴增產(chǎn)物

Fig.1 ITS-PCR products of four physiological races ofFusariumoxysporumf. sp.cubense

2.2 不同生理小種ITS的序列分析

對4個生理小種8個菌株的ITS區(qū)段進行克隆并測序，結(jié)果均得到568 bp的片段。用DNAMAN對8個菌株的ITS全長序列進行比對，結(jié)果(圖2)發(fā)現(xiàn)，8個菌株只在第344、390和409個堿基處存在差異：在344 bp處，除3號生理小種(WG04)的堿基為C外，其他的均為T；在390 bp處，除4號生理小種(Z13、Z16)的堿基為C外，其余的均為T；在409 bp處，1號和2號生理小種的為T，3號和4號生理小種的為C。用DNAMAN對4個生理小種8個菌株進行序列比對，相似性高達(dá)99.85%。國內(nèi)、外的1號生理小種ITS序列基本相同；除WG05外，國內(nèi)、外的4號生理小種的ITS序列基本相同。WG02和WG03 ITS序列完全相同。與 GenBank 中的已知序列進行相似性比對，發(fā)現(xiàn)其與GenBank中的尖鐮孢F.oxys-WG02、WG03、WG04、WG05分別為國外的1～4號生理小種菌株；Z13和Z16為國內(nèi)的4號生理小種菌株；Z14和Z15為國內(nèi)的1號生理小種菌株。

圖2 香蕉枯萎病菌4個生理小種的ITS序列比對

Fig.2 ITS sequences alignment of four physiological races ofFusariumoxysporumf. sp.cubense

porum的序列相似性高達(dá)100%，表明ITS序列可以作為鑒定尖鐮孢F.oxysporum的依據(jù)。

2.3 不同生理小種ITS-RFLP分析

3種限制性內(nèi)切酶(AluI、HpaII、TaqI)對ITS擴增產(chǎn)物的酶切圖譜見圖3。由圖3A可看出，AluI對供試的4個生理小種8個菌株均有2個共同的酶切位點，供試菌株只有1種酶切圖譜，每個菌株的ITS片段被酶切為大約380、130 和50 bp的3個片段，50 bp左右的片段很模糊甚至不容易觀察到。由圖3B可看出，HpaII對供試菌株的酶切位點較少，且比較保守；4個生理小種8個菌株均有1個共同的酶切位點，每個菌株的ITS片段被酶切為大約430 和130 bp的2個片段；供試菌株只有1種酶切圖譜。由圖3C可以看出，TaqI對供試的8個菌株的酶切位點較多，均有3個共同的酶切位點，每個菌株的ITS片段被酶切為大約240、140、90和60 bp的4個片段；供試菌株只有1種酶切圖譜。

從上述ITS酶切圖譜的分析中可知，3種內(nèi)切酶對香蕉枯萎病菌4個生理小種8個菌株所產(chǎn)生的酶切帶型一致，并不能將香蕉枯萎病菌的不同生理小種區(qū)分開來，表明該病菌的種內(nèi)rDNA ITS區(qū)段比較保守，遺傳多樣性有限。

M:DL500 Marker;1:WG02；2:WG03；3:WG04；4:WG05；5:Z13；6:Z14；7:Z15；8:Z16；9:ddH2O。

圖3 香蕉枯萎病菌4個生理小種ITS-PCR產(chǎn)物的酶切圖譜

Fig.3 Restriction patterns of ITS-PCR products of four physiological races ofFusariumoxysporumf. sp.cubense

3 討論與結(jié)論

rDNA已被廣泛應(yīng)用于植物病原菌親緣關(guān)系以及致病性相關(guān)的研究。ITS區(qū)段在核基因組中是高度保守的，可用與它們序列互補的通用引物對ITS區(qū)進行PCR擴增、序列對比[8, 13]以及RFLP分析[11, 14-15]。Mills等[16]用RFLP區(qū)分不同地理來源和不同果樹寄主的膠孢炭疽病菌Colletotrichumgloeosporioides，但不能區(qū)分不同地理來源芒果上的膠孢炭疽病菌的菌株。張瑞萍等[17]通過rDNA-ITS序列分析法成功鑒定出大豆根腐病菌F.oxysporum的菌株。李志芳等[6]用ITS-RFLP快速鑒定了棉花上的 6 種主要病原真菌，其ITS-RFLP產(chǎn)物大小各異、具有多態(tài)性，參考標(biāo)準(zhǔn)電子圖譜可準(zhǔn)確鑒定其種類。ITS-RFLP技術(shù)在擔(dān)子菌的鑒定方面也有很多成功的例子[18-20]，表明該技術(shù)適用性強。

本研究利用真菌通用引物ITS4/ITS5對香蕉枯萎病菌4個生理小種8個菌株的ITS進行了克隆和序列分析以及ITS-RFLP比較研究。結(jié)果表明，4個生理小種菌株的ITS序列只有3個堿基的差異，序列相似性高達(dá)99.85%，與 GenBank中尖鐮孢菊花?；虵.oxysporumf. sp.chrysanthemi(編號DQ452449.1)、尖鐮孢黃瓜?；虵.oxysporumf. sp.cucumerinum(編號DQ452450.1)和一品冠(仙客來)枯萎病菌F.oxysporumf. sp.cyclaminisstrain ATCC 16061(編號DQ452451.1)的序列相似性為99%以上，表明尖鐮孢不同?；驮趓DNA-ITS序列上差異性較小，因而 rDNA-ITS 區(qū)段序列在一定程度上不適合于種內(nèi)?；图吧硇》N的鑒定。

通過序列比對，發(fā)現(xiàn)香蕉枯萎病菌1 號生理小種的3 個菌株(WG02，Z14和Z15)的 rDNA-ITS 區(qū)段序列完全一致，而4號生理小種的3個菌株(WG05，Z13和Z16)的 rDNA-ITS 區(qū)段序列存在著一定程度的差異，可以推斷現(xiàn)階段香蕉枯萎病菌4 號生理小種的變異頻率比1號生理小種快，這與王文華[7]的研究結(jié)果一致，其原因可能是地域差異導(dǎo)致的生理分化。

通過比對香蕉枯萎病菌 4個生理小種8個供試菌株的序列，還發(fā)現(xiàn)4 號生理小種(Z13、Z16)在390 bp 與409 bp 位點的堿基為C，而1號生理小種在此位點的堿基為T。筆者推測，4號生理小種在rDNA-ITS區(qū)段序列這2個位點上存在著專一性，為通過rDNA-ITS序列比對鑒定4號和1號生理小種提供了一定的理論依據(jù)。

本研究采用3種不同的限制性內(nèi)切酶進行了ITS-RFLP分析，均未能將4個生理小種的8個菌株區(qū)分開，再次證實了其ITS序列的保守性。曾莉莎等[21]通過ITS遺傳進化樹將18個香蕉枯萎病菌分為4個分支，其中1號生理小種、2號生理小種及非致病性香蕉枯萎病菌共享1個分支，3號生理小種和4號生理小種也共享1個分支，提出了ITS不能代表香蕉枯萎病菌的種間親緣關(guān)系，不適合做系統(tǒng)發(fā)育分析。本研究對ITS片段進行RFLP分析，結(jié)果獲得的酶切譜帶很單一，在一定程度上可能是因為內(nèi)切酶種類太少，或者是因為單酶切的局限性等。盡管單個內(nèi)切酶在一定程度上可以區(qū)分一些種和小種，如AluI能夠?qū)⒋蠖够野卟【鶦ercosporasojinaHara[22]與其他種分開，但是僅有的單個酶對菌株進行鑒定是不可靠的，因為種內(nèi)該位點可能存在多態(tài)性，酶切位點的突變也可能帶來錯誤的結(jié)果。因此，為了更好地鑒定和監(jiān)測香蕉枯萎病菌的生理小種，應(yīng)結(jié)合4個生理小種的致病性試驗[7]，同時選擇TEF-1α、IGS、histoneH3等基因[21]以及復(fù)合限制性內(nèi)切酶進行RFLP分析，以獲得更為有力的證據(jù)和更為準(zhǔn)確的鑒定結(jié)果。

[1] GHAG S B, SHEKHAWAT U K S, GANAPATHI T R. Fusarium wilt of banana: Biology, epidemiology and management[J]. Int J Pest Manage, 2015, 61(3): 250-263.

[2] 楊旸. 香蕉枯萎病菌兩個生理小種fgb和fmk基因的克隆與序列分析[D]. 廣州: 華南農(nóng)業(yè)大學(xué), 2010.

[3] 呂順, 曾莉莎, 劉文清, 等. 大蕉枯萎病病原菌鑒定及TEF-1α序列分析[J]. 植物病理學(xué)報, 2014, 44(4): 337-348.

[4] 劉景梅, 王璧生, 陳霞, 等. 廣東香蕉枯萎病菌生理小種RAPD技術(shù)的建立[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué), 2004(4): 43-45.

[5] FOULY H M. ITS ribosomal DNA phylogeny ofGaeumannomycesgraminis[J]. Arab J Biotech, 2002, 7(1): 45-52.

[6] 李志芳, 馮自力, 趙麗紅, 等. 棉花主要真菌病害病原菌ITS-RFLP快速鑒定方法[J]. 中國棉花, 2013, 40(12): 13-16.

[7] 王文華. 香蕉枯萎鐮刀菌1、4號小種rDNA-ITS序列分析及4號小種遺傳轉(zhuǎn)化體系建立[D]. ?？? 海南大學(xué), 2007.

[8] 王洪凱, 張?zhí)煊? 張猛. 應(yīng)用5.8S rDNA及ITS區(qū)序列分析鏈格孢種級分類[J]. 菌物學(xué)報, 2001, 20(2): 168-173.

[9] BURGERMEISTER W, BRAASCH H, METGE K, et al. ITS-RFLP analysis, an efficient tool for differentiation ofBursaphelenchusspecies[J]. Nematology, 2009, 11(5): 649-668.

[11]VIAUD M, PASQUIER A, BRYGOO Y. Diversity of soil fungi studied by PCR-RFLP of ITS[J]. Mycol Res, 2000, 104(9): 1027-1032.

[12]ERLAND S, HENRION B, MARTIN F, et al. Identification of the ectomycorrhizal basidiomyceteTylosporafibrillosaDonk by RFLP analysis of the PCR-amplified ITS and IGS regions of ribosomal DNA[J]. New Phytol, 1994, 126(3): 525-532.

[13]陳永青, 姜子德, 戚佩坤. RAPD分析與ITS序列分析在擬莖點霉分類鑒定上的應(yīng)用[J]. 菌物學(xué)報, 2002, 21(1): 39-46.

[14]GARDES M, BRUNS T D. ITS-RFLP matching for identification of fungi[J]. Methods Mol Biol, 1996, 50: 177-186.

[15]PANDEY A K, REDDY M S, SURYANARAYANAN T S. ITS-RFLP and ITS sequence analysis of a foliar endophyticPhyllostictafrom different tropical trees[J]. Mycol Res, 2003, 107(4): 439-444.

[16]MILLS P R, SREENIVASAPRASAD S, BROWN A E. Detection and differentiation ofColletotrichumgloeosporioidesisolates using PCR[J]. FEMS Microbiol Lett, 1992, 98(1/2/3): 137-143.

[17]張瑞萍, 王家軍, 魏崍, 等. 一株大豆腐霉菌(PSHH1)rDNA的ITS序列鑒定[J]. 大豆科學(xué), 2015, 34(5): 867-873.

[18]岳萬松. 云南牛肝菌的分子鑒定及其多糖抗氧化性研究[D]. 昆明: 云南民族大學(xué), 2015.

[19]劉新銳, 謝寶貴, 熊芳, 等. 高溫平菇種質(zhì)資源的ITS-RFLP分析[J]. 熱帶作物學(xué)報, 2010, 31(9): 1509-1513.

[20]張文娟, 康帥, 魏鋒, 等. 基于ITS序列分析鑒別冬蟲夏草與古尼蟲草[J]. 藥物分析雜志, 2015(9): 1551-1555.

[21]曾莉莎, 呂順, 劉文清, 等. 基于多基因序列分析對尖孢鐮孢菌古巴?；?香蕉枯萎病菌)生理小種的鑒定[J]. 菌物學(xué)報, 2014, 33(4): 867-882.

[22]張俊華, 張明, 韓英鵬, 等. 大豆灰斑病菌生理小種PCR-RFLP分子檢測[J]. 中國油料作物學(xué)報, 2010, 32(1): 128-131.

【責(zé)任編輯 霍 歡】

RFLP analysis of the ribosomal DNA ITS regions of four physiological racesofFusariumoxysporumf. sp.cubense

SHU Canwei, ZENG Rui, YANG Mei, ZHOU Erxun

(College of Agriculture, South China Agricultural University/Guangdong Province Key Laboratory of MicrobialSignals and Disease Control, Guangzhou 510642, China)

【Objective】 To clarify the phylogenetic relationship of four physiological races ofFusariumoxysporumf. sp.cubense(Foc), the causal agent of fusarial wilt of banana.【Method】 The ribosomal DNA internal transcribed spacer (ITS) regions of the four physiological races ofFocwere first amplified using PCR technique, and then RFLP analysis of the ITS products of these races were performed using three restriction endonucleases includingAIuI,HpaII andTaqI.【Result】A single 568 bp ITS fragment was amplified specifically from eight strains belonging to four races, respectively, but there was no obvious polymorphism among these races. RFLP analysis of the ITS products from these races showed that the differences among races were very small. 【Conclusion】 PCR-RFLP technique was unsuitable to be used as the identification basis for the physiological races ofFoc.

Fusariumoxysporumf. sp.cubense；physiological race；internal transcribed spacer (ITS)； polymerase chain reaction (PCR)；restriction fragment length polymorphism (RFLP)

2016- 08- 04 優(yōu)先出版時間：2017-04-12

舒燦偉(1985—)，男，副教授，博士，E-mail：shucanwei@scau.edu.cn；通信作者：周而勛(1963—)，男，教授，博士，E-mail: exzhou@scau.edu.cn

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)(香蕉)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(CARS-32)

S436.67

A

1001- 411X(2017)03- 0052- 05

優(yōu)先出版網(wǎng)址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/44.1110.s.20170412.1417.008.html

舒燦偉， 曾 蕊， 楊 媚， 等.香蕉枯萎病菌4個生理小種核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)的RFLP分析[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2017,38(3):52- 56.