鄧怡林，于合國，施敏，石翠翠，范建高，李光明

·肝衰竭·

Orionin對急性肝衰竭小鼠的保護(hù)作用及其對肝組織細(xì)胞因子水平的影響*

鄧怡林，于合國，施敏，石翠翠，范建高，李光明

目的探討冬凌草甲素（Oridonin）對脂多糖/D-氨基半乳糖氨（LPS/D-Gal）聯(lián)合誘導(dǎo)的急性肝衰竭（ALF）小鼠的保護(hù)作用及其對肝組織細(xì)胞因子水平的影響。方法取150只小鼠，隨機(jī)分成5組，每組30只。采用LPS/D-Gal腹腔注射建立小鼠ALF模型，設(shè)生理鹽水對照組、Oridonin對照組、LPS/D-Gal誘導(dǎo)模型組和LPS/D-Gal處理及不同劑量Oridonin干預(yù)組。采用Real-time PCR法檢測肝組織腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素（IL）-1α、IL-1β和IL-6 mRNA水平。結(jié)果模型組小鼠48 h存活率為0.0%（0/30），而兩個Oridonin干預(yù)組小鼠48 h存活率分別提高至64.5%（19/30）和80.6%（24/30，P＜0.01）；組織病理學(xué)檢查顯示模型組小鼠肝細(xì)胞呈大塊或/和亞大塊壞死，肝小葉結(jié)構(gòu)消失，殘存肝細(xì)胞腫脹、空泡變性，肝竇腫脹充血，炎細(xì)胞浸潤。Oridonin干預(yù)組小鼠肝細(xì)胞壞死、空泡變性和炎細(xì)胞浸潤等較模型組有明顯的改善；模型組小鼠血清ALT和AST水平分別為（345.3± 54.1）U/L和（500.2±53.5）U/L，明顯高于對照組的［（42.3±0.6）U/L和（117.1±9.8）U/L，P＜0.01］，兩個Oridonin干預(yù)組分別為（303.9±39.5）U/L和（340.6±2.8）U/L及［（130.2±38.3）U/L和（209.8±36.2）U/L，P＜0.05］；模型組小鼠肝組織TNF-α、IL-1α、IL-1β和IL-6 mRNA水平顯著高于正常對照組（P＜0.01），而兩個Oridonin干預(yù)組肝組織TNF-α、IL-1α、IL-1β和IL-6 mRNA水平顯著低于模型組（P＜0.01）。結(jié)論Oridonin對LPS/D-Gal誘導(dǎo)的ALF小鼠具有顯著的保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與降低肝組織細(xì)胞因子水平有關(guān)。

急性肝衰竭；脂多糖；D-氨基半乳糖氨；冬凌草甲素；細(xì)胞因子;小鼠

急性肝衰竭（Acute liver failure，ALF）病情兇險，死亡率高，目前尚無有效防治方法[1]。因此，探尋能改善ALF預(yù)后的治療新策略具有重要的臨床意義。ALF病情進(jìn)展與炎性細(xì)胞因子過度釋放及由此介導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡和壞死密切相關(guān)[1-3]。冬凌草甲素（oridonin）是從中藥冬凌草中分離出來的活性雙萜類化合物，具有廣泛的抗腫瘤和抗炎等生物活性[4-7]?；贏LF是一種炎癥相關(guān)性疾病，oridonin具有廣泛強(qiáng)大的抗炎效應(yīng)，提示oridonin可能對ALF具有保護(hù)作用。本研究以脂多糖/D-氨基半乳糖氨（Lipopolysaccharide/D-galactosamine，LPS/D-Gal）誘導(dǎo)小鼠ALF為模型，探討oridonin的保護(hù)作用，并初步探索其保護(hù)作用是否與抑制肝組織細(xì)胞因子的分泌水平有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑與藥物6～8周齡，雌性SPF級，體質(zhì)量為20～22 g的C57/BL6小鼠購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院，在清潔級動物實驗中心喂養(yǎng)（標(biāo)準(zhǔn)動物飼料及飲水，環(huán)境溫度為21±2℃,12 h的明暗交替光照時間）。所有動物實驗均符合本校動物倫理委員會的有關(guān)規(guī)定。D-Gal和LPS（E. Coli,菌株O111:B4）購自美國Sigma公司。Oridonin購自美國Selleck公司。蘇木素-伊紅染色試劑盒購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司。ReverTra Ace qPCR RT Kit購自日本Toyobo公司，SYBR@ Green Real-time PCR Master Mix購自上海ExCell Bio公司。

1.2 ALF模型的建立取150只小鼠，隨機(jī)分成5組，每組30只。a組（正常對照組）：給予生理鹽水0.5 ml腹腔注射，1 h后注射同等體積的生理鹽水；b組（藥物對照組）：給予Oridonin（將oridonin溶于生理鹽水，0.2 mg/只）0.5 ml腹腔注射，1 h后注射同等體積的生理鹽水；c組（模型組）：給予LPS（40 μg/只）/D-Gal（5 mg/只）/生理鹽水0.5 ml腹腔注射，1 h后注射同等體積的LPS/D-Gal混合溶液；d組和e組（藥物干預(yù)組）：給予Oridonin（0.2 mg/只）/LPS（40 μg/只）/D-Gal（5 mg/只），其中d組給予Oridonin（0.2 mg/只）0.5 ml腹腔注射，1 h后給予同等體積的LPS/D-Gal混合溶液腹腔注射，e組給予Oridonin 0.5 ml腹腔注射，1次/4 d，共3次，最后一次在給藥后1 h給予同等體積的LPS/D-Gal混合溶液腹腔注射。觀察并記錄各組小鼠存活情況，1次/6 h，計算小鼠48 h存活率。另取25只小鼠，隨機(jī)分成5組，每組5只，分組和藥物處理方法同上。在腹腔注射LPS/D-Gal后6 h，經(jīng)眼球采血，分離血清，保存于-80℃，備檢。取肝組織，浸泡于4%多聚甲醛溶液中，經(jīng)過常規(guī)脫水、浸蠟、包埋，制成5μM切片，行HE染色。另取肝組織經(jīng)液氮速凍后，置于-80℃冰箱保存，備檢。

1.3 血清ALT和AST水平檢測使用日立7180全自動血生化分析儀檢測。

1.4 肝組織細(xì)胞因子mRNA水平檢測采用RT-PCR法，以Trizol法提取肝組織RNA，經(jīng)紫外分光光度計測定RNA純度，取吸光度A260/A280為1.8～2.0的RNA用于逆轉(zhuǎn)錄，采用Real-time PCR試劑盒行PCR擴(kuò)增，每個反應(yīng)體系共20μl，包括DNA模板（10 ng/μl）1.4μl，SYBR 10μl，引物1.6μl（10μM）和ddH2O 7μl。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性10 min，95℃變性20 s，58℃退火30 s，72℃延伸25 s，40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參照，運用2-△△CT法分析結(jié)果。所有引物均由美國Thermo Fisher Scientific公司合成，其序列分別為：TNF-α：正義鏈，5’-CTCCCAGGTATATGGGCT CA-3’，反義鏈：5’-CCA GGT TCT CTT CAA GGG AC-3’；IL-1α：正義鏈，5’-AGT ATC AGC AAC GTC AAG CAA-3’，反義鏈：5’-TCC AGA TCA TGG GTT ATG GAC TG-3’；IL-1β：正義鏈，5’-GAAATGCCACCTTTTGACAGT G-3’，反義鏈：5’-TGG ATG CTC TCA TCA GGA CAG-3’；IL-6：正義鏈，5’-TAG TCC TTC CTA CCC CAA TTT CC-3’，反義鏈：5’-TTG GTC CTT AGC CAC TCC TTC-3’；GAPDH：正義鏈，5’-TCC AAG GAG TAA GAA ACC CTG GAC-3’，反義鏈，5’-GTTATTATGGGGGTCTGGGAT GG-3’。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用GraphPad Prism 6.0行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以±s表示，組間比較采取獨立樣本t檢驗，兩個和兩個以上樣本率的比較采用卡方檢驗。P＜0.05和P＜0.01分別表示差異具有顯著性和非常顯著性統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Oridonin可顯著提高ALF小鼠存活率在LPS/D-Gal刺激后，模型組小鼠48 h存活率為0.0%（0/30）；經(jīng)Oridonin干預(yù)的d組和e組小鼠48h存活率分別提高至64.5%（19/30）和80.6%（24/30，P＜0.01，圖1），表明Oridonin可明顯提高ALF小鼠的存活率。

圖1 各組小鼠存活率比較正常對照組及藥物對照組小鼠48 h存活率為100%（30/30）；在LPS/D-Gal刺激后，模型組小鼠48 h存活率為0.0%（0/30），經(jīng)Oridonin干預(yù)的d組和e組小鼠48 h存活率分別提高至64.5%（19/30）和80.6%（24/30）

2.2 Oridonin顯著改善ALF小鼠肝組織損傷正常對照組及藥物對照組肝組織細(xì)胞及肝小葉結(jié)構(gòu)完整；在LPS/D-Gal處理6 h后，模型組小鼠肝組織呈大塊或/和亞大塊壞死，小葉結(jié)構(gòu)消失，殘存肝細(xì)胞腫脹、空泡變性，肝竇腫脹充血，炎細(xì)胞浸潤；Oridonin干預(yù)組小鼠肝細(xì)胞壞死、空泡變性及炎細(xì)胞浸潤等較模型組有明顯的改善（圖2）。

圖2 肝組織病理學(xué)表現(xiàn)（HE，200×）a：正常對照組，b：藥物對照組；c：模型組；d和e：藥物干預(yù)組

2.3 各組小鼠血清ALT和AST水平比較在LPS/D-Gal處理6 h后，模型組小鼠血清ALT和AST水平分別為（345.3±54.1）U/L和（500.2± 53.5）U/L，顯著高于對照組的（42.3±0.6）U/L和（117.1±9.8）U/L，P＜0.01）；Oridonin干預(yù)的d組血清ALT和AST水平分別下降為（303.9±39.5）U/L和（340.6±2.8）U/L，Oridonin干預(yù)的e組血清ALT和AST水平分別顯著下降為（130.2±38.3）U/L和（209.8±36.2）U/L（P＜0.05，圖3）。

圖3 各組血清轉(zhuǎn)氨酶水平變化比較與正常對照組比，##P＜0.01；與模型組比，*P＜0.01

2.4 各組小鼠肝組織炎癥因子mRNA水平比較見圖4，提示Oridonin對LPS/D-Gal誘導(dǎo)的小鼠肝組織炎癥因子水平具有顯著的阻抑作用。

圖4 肝組織細(xì)胞因子mRNA水平變化與正常對照組比，##P＜0.01；與模型組比，*P＜0.01

3 討論

LPS/D-Gal誘導(dǎo)的ALF與臨床ALF病理過程相似，是研究ALF的經(jīng)典動物模型[11-13]，也是篩選ALF治療新藥的重要手段。因此，利用此動物模型，我們探討了Oridonin對ALF小鼠的保護(hù)作用及其可能的機(jī)制。

我們選擇在LPS/D-Gal刺激前，給予Oridonin預(yù)處理[14-18]。結(jié)果顯示，給予Oridonin預(yù)處理可明顯提高ALF小鼠48 h存活率，表明Oridonin對ALF具有顯著的保護(hù)作用。我們進(jìn)一步研究了LPS/D-Gal處理6 h后模型組小鼠肝組織呈大塊和/或亞大塊壞死伴血清ALT/AST顯著升高，提示小鼠ALF模型構(gòu)建成功，Oridonin干預(yù)組小鼠不僅血清ALT/AST水平明顯降低，而且肝細(xì)胞變性、壞死及炎性細(xì)胞浸潤也顯著減輕，提示Oridonin對LPS/D-Gal誘導(dǎo)的ALF小鼠具有顯著的保護(hù)作用。

ALF發(fā)病機(jī)制與損傷因素誘導(dǎo)的炎性細(xì)胞因子過度釋放及其引起的肝組織急性炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[12，15，19]。有研究報道，Oridonin可以抑制LPS和β-淀粉樣蛋白刺激的神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞一氧化氮（NO）、TNF-α和IL-6等炎癥因子釋放，同時伴有對NF-κB信號通路的抑制[7，20]，說明Oridonin可能對炎癥相關(guān)性疾病具有保護(hù)作用。為了探討Oridonin對ALF小鼠的保護(hù)機(jī)制，我們評估了在ALF發(fā)病中起關(guān)鍵作用的促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1和IL-6基因水平變化。研究發(fā)現(xiàn)在LPS/D-Gal誘導(dǎo)的ALF小鼠肝組織TNF-α、IL-1α、IL-β和IL-6 mRNA水平顯著上調(diào)，Oriodnin預(yù)處理則可顯著抑制上述炎癥因子的上調(diào)，提示Oriodnin對ALF的保護(hù)作用可能與抑制肝臟炎癥反應(yīng)有關(guān)。

我們的研究首次證實Oridonin對ALF具有顯著保護(hù)作用，其機(jī)制可能與抑制肝臟炎癥反應(yīng)有關(guān)，預(yù)示Oridonin在ALF臨床干預(yù)方面可能具有潛在的應(yīng)用價值。

[1]Jedicke N，Struever N，Aggrawal N，et al.Alpha-1-antitrypsin inhibits acute liver failure in mice.Hepatology，2014，59（6）: 2299-2308.

[2]Guicciardi ME，Malhi H，Mott JL，et al.Apoptosis and necrosis in the liver.Compr Physiol，2013，3（2）:977-1010.

[3]Brenner C，Galluzzi L，Kepp O，et al.Decoding cell death signals in liver inflammation.J Hepatol，2013，59（3）:583-594.

[4]Gao SY，Li J，Qu XY，et al.Downregulation of cdk1 and cyclinb1expressioncontributestooridonin-inducedcellcycle arrestatG2/MphaseandgrowthinhibitioninSGC-7901 gastric cancer cells.Asian Pacif J Cancer Prevent，2014，15（15）:6437-6441.

[5]Wong AM，Zhang Y，Kesler K，et al.Genomic and in vivo evidence of synergy of a herbal extract compared to its most activeingredient:rabdosiarubescensvs.oridonin.ExpTher Med，2010，1（6）:1013-1017.

[6]Zhen T，Chen Z，Chen SJ.Targeting of AML1-ETO in t（8;21）leukemia byoridonin generates a tumor suppressor like protein.Cancer Biol Ther，2012，4:127-138.

[7]Wang S，Yang H，Yu L，et al.Oridonin attenuates abeta1-42-induced neuroinflammation and inhibits NF-kB pathway.PLoS One，2014，9（8）:e104745

[8]Lee W M，Squires R H，Jr.，Nyberg S L，et al.Acute liver failure:summaryofaworkshop.Hepatology，2008，47（4）: 1401-1415.

[9]Michael D.Josephs FRB，F(xiàn)ukuzuka K.Lipopolysaccharide and D-galactosamine-inducedhepaticinjuryismediatedby TNF-α and not by Fas ligand.Am J Physiol Regulatory Integrative Comp Physiol，2000，278:1196-1201.

[10]SchwabeRF，BrennerDA.MechanismsofLiverInjury.I. TNF-alpha-inducedliverinjury:roleofIKK，JNK，andROS pathways.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2006，290（4）:G583-589.

[11]Luo M，Zhao A，Li J，et al.Acute liver injury attenuation of a novel recombinant sTNFR through blocking hepatic apoptosis. Immunopharmacol Immunotoxicol，2015，37（3）:295-300.

[12]Silverstein R.D-galactosamine lethality model:scope and limitations.J Endotoxin Res，2004，10（3）:147-162.

[13]Tunón M J.An overview of animal models for investigating thepathogenesis andtherapeutic strategies inacutehepatic failure.World J Gastroenterol，2009，15（25）:3086.

[14]Gill RQ，Ark S.Acute liver failure.J Clin Gastroenterol，2001，33（3）:191-198.

[15]Li X，Gou C，Yang H，et al.Echinacoside ameliorates D-galactosamine plus lipopolysaccharide-induced acute liver injury in mice via inhibitionof apoptosis andinflammation.ScandJ Gastroenterol，2014，49（8）:993-1000.

[16]Zhan Y，Wang Z，Yang P，et al.Adenosine 5'-monophosphate ameliorates D-galactosamine/lipopolysaccharide-induced liver injury through an adenosine receptor-independent mechanism in mice.Cell Death Dis，2014，5:e985.

[17]PanCW，ZhouGY，ChenWL，etal.Protectiveeffectof forsythiasideAonlipopolysaccharide/d-galactosamine-induced liver injury.Int Immunopharmacol，2015，26（1）:80-85.

[18]Zhang J，Xu L，Zhang L，et al.Curcumin attenuates D-galactosamine/lipopolysaccharide-induced liver injury and mitochondrial dysfunction in mice.J Nutr，2014，144（8）:1211-1218.

[19]AdamsDH，JuC，RamaiahSK，etal.Mechanismsofimmune-mediated liver injury.Toxicol Sci，2010，115（2）:307-321.

[20]Xu Y，Xue Y，Wang Y，et al.Multiple-modulation effects of oridonin on the production of proinflammatory cytokines and neurotrophicfactorsinLPS-activatedmicroglia.IntImmunopharmacol，2009，9（3）:360-365.

（收稿：2016-10-14）

（本文編輯：陳從新）

Effect of oridonin on hepatic cytokine levels in mice with LPS/D-Gal-induced acute liver failure

Deng Yilin，Yu Heguo，Shi Min，et al.Department of Gastroenterology，Xinhua Hospital Affiliated to Jiaotong University School of Medicine，Shanghai 200092，China

ObjectiveTo investigate the effectoforidonin on hepatic cytokinelevelsinmicewith polysaccharide（LPS）/D-galactosamine（D-Gal）-induced acute liver failure.Methods150 mice were randomly divided into five groups（30 in each group），e.g.，normal，oridonin control，model，oridonin-intervened，and oridoninintervened for 12 days.ALF model was established in C57BL/6 mice by intraperitoneal injection of LPS/D-Gal. ResultsThe 48 h lethality rate in LPS/D-Gal-induced group reached an extremely high level of 100%. However，the 48 h survival rates in two oridonin-intervened groups were 64.5%（19/30）and 80.6%（24/30，P<0.01）；The damage in liver tissues was ameliorated in mice pretreatedwith oridonin as compared with that in the model group；Serum ALT and AST levels in model group were（345.3±54.1）U/L and（500.2±53.5）u/L，significantly higher than those in control group[（42.3±0.6）U/L and（117.1±9.8）U/L，P<0.01]or in oridonin-treated group[（303.9± 39.5）U/L and（340.6±2.8）U/L or[（130.2±38.3）U/L and（209.8±36.2）U/L，P<0.05]；Administration of oridonin in mice with LPS/D-Gal-induced ALF significantly decreased mRNA levels of hepatic TNF-α，IL-1α，IL-1β and IL-6 compared with in model group（P<0.01）.ConclusionOridonin has a protective effect on mice with LPS/DGal-induced ALF，and the mechanism might be related to inhibition of hepatic cytokine activities.

Acute liver failure；Lipopolysaccharide；D-galactosamine；Oridonin；Cytokines；Mice

10.3969/j.issn.1672-5069.2017.03.010

國家自然科學(xué)基金資助項目（編號：81400631/81570549）

200092上海市上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院消化內(nèi)科（鄧怡林，石翠翠，范建高，李光明）；同仁醫(yī)院消化內(nèi)科（施敏）；上海市計劃生育科學(xué)研究所（于合國，刁華）

鄧怡林，女，25，碩士研究生。主要從事肝損傷及肝纖維化的防治研究。E-mail:yilindeng1991@163.com

李光明，E-mail:ligm68@126.com