張偉，董政，孔慧芳，張百龍，毛威，高旭東，榮義輝

·原發(fā)性肝癌·

肝癌組織HNF4α mRNA 定量檢測(cè)方法的建立與初步應(yīng)用

張偉，董政，孔慧芳，張百龍，毛威，高旭東，榮義輝

目的建立一種定量檢測(cè)肝細(xì)胞癌（HCC）組織肝細(xì)胞核因子4α（HNF4α）mRNA的方法。方法取手術(shù)獲得的HCC組織16例，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增獲得全長(zhǎng)HNF4α mRNA對(duì)應(yīng)cDNA產(chǎn)物，經(jīng)TA克隆后，測(cè)序確認(rèn)。根據(jù)獲得序列，設(shè)計(jì)檢測(cè)HNF4α mRNA引物及MGB熒光探針。以體外轉(zhuǎn)錄HNF4α mRNA為標(biāo)準(zhǔn)品，建立一步法逆轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR檢測(cè)方法，同時(shí)設(shè)定β-actin mRNA為內(nèi)參對(duì)照，最終計(jì)算得到組織HNF4α mRNA水平。采用免疫組化染色檢測(cè)HNF4α蛋白表達(dá)，比較HNF4α mRNA水平與HNF4α蛋白表達(dá)的對(duì)應(yīng)結(jié)果。結(jié)果HCC組織HNF4α mRNA定量標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率為-3.237，相關(guān)系數(shù)r值達(dá)0.994，β-actin mRNA定量標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率為-3.037，相關(guān)系數(shù)r值為0.996，表明建立的方法可用于檢測(cè)HNF4α mRNA定量（V-4α值），16例HCC組織HNF4α mRNA與HNF4α蛋白表達(dá)結(jié)果呈一致性對(duì)應(yīng)關(guān)系。結(jié)論我們初步成功建立了定量檢測(cè)HCC組織HNF4α mRNA水平方法，其意義還需要進(jìn)一步研究。

肝細(xì)胞癌；肝細(xì)胞核因子4α；逆轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR法

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是指發(fā)生于肝細(xì)胞的惡性腫瘤,是侵襲力最強(qiáng)的惡性腫瘤之一，在東南亞地區(qū)較為常見[1，2]，超過80%HCC患者同時(shí)伴有病毒性肝炎和肝硬化[1-3]。研究發(fā)現(xiàn)[4-9]，肝細(xì)胞核因子4α（hepatocyte nuclear factor 4α，HNF4α）是核激素受體超家族HNF4的成員之一，是一種保守性的配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子，處于轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的上游，可通過多種機(jī)制參與肝臟特異性基因的表達(dá)和調(diào)控，是肝細(xì)胞正常生理功能發(fā)揮和維持的關(guān)鍵調(diào)控因子之一[10-12]。HNF4α表達(dá)異常與各種肝臟疾病，如非酒精性脂肪肝、原發(fā)性肝癌、肝纖維化和病毒性肝炎等密切相關(guān)[13-17]。目前認(rèn)為，HNF4α是HCC治療的潛在靶點(diǎn)，并可作為HCC患者治療后預(yù)測(cè)其預(yù)后的參考指標(biāo)，HNF4α蛋白在肝組織中的表達(dá)強(qiáng)弱直接影響HCC患者預(yù)后。但到目前為止，采用免疫組化法檢測(cè)組織HNF4α表達(dá)，存在檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，結(jié)果易受讀片醫(yī)師主觀判斷的影響等缺點(diǎn)。我們建立了實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)HCC組織HNF4α mRNA水平，確定其閾值，以判斷HCC組織HNF4α水平的高低作為臨床快速定量檢測(cè)的手段，以判定HCC組織的分化程度，為HCC患者的早期診斷和預(yù)后提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源2014年1月～2015年12月在解放軍第302醫(yī)院經(jīng)手術(shù)切除并經(jīng)病理學(xué)檢查確診為HCC組織16例，男性13例，女性3例；年齡30～78歲，平均年齡為51.17±10.9歲。標(biāo)本保存于組織RNA保存液中，凍存于-80℃。

1.2 主要試劑和儀器組織RNA保存液、PCR產(chǎn)物純化試劑盒和組織RNA提取試劑盒（Qiagen，德國(guó)），DEPC（Sigma，美國(guó)），Ex TaqHS（TaKaRa，美國(guó)），RNase Inhibitor和T-A克隆試劑盒（Promega，美國(guó)），M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶（Fermentas，立陶宛），質(zhì)粒提取試劑盒（上海生工，中國(guó)），DNA純化試劑盒（Qiagen，德國(guó)），體外RNA制備試劑盒（Promega，美國(guó)）。β-actin mRNA標(biāo)準(zhǔn)品【全國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)（NCCLs），中國(guó)】，抗HNF4α單克隆抗體（Eptomics，美國(guó)），免疫組化試劑盒和DAB顯色試劑盒（中杉金橋，中國(guó)），其它生化試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。臺(tái)式高速低溫離心機(jī)（Thermo，美國(guó)），實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（宏石，中國(guó)）。

1.3 引物探針設(shè)計(jì)與合成自NCBI獲得HNF4α cDNA序列（GenBanknumber：NM_000545），按照序列信息（表1）合成HNF4α擴(kuò)增引物以及熒光定量探針。

1.4 肝組織HNF4α mRNA的提取及cDNA擴(kuò)增取HCC手術(shù)患者獲得的新鮮腫瘤組織或液氮保存的冰凍HCC組織，立即加入液氮，在研缽內(nèi)研碎。然后，嚴(yán)格按照Qiagen組織RNA提取試劑盒說明書提取總RNA。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書以oligd T引物在42℃作用90 min，70℃15 min，滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。PCR擴(kuò)增體系：2× PCR Mix 25μl，4αF 0.5μl，4αR 0.5μl，cDNA產(chǎn)物5μl，加ddH2O補(bǔ)足到50 μl；PCR擴(kuò)增條件：94℃3 min；94℃15 s，55℃20 s，72℃40 s，35個(gè)循環(huán)；72℃10 min；4℃保持。將全部PCR產(chǎn)物加入至1%TAE瓊脂糖凝膠中，110 v，25 min，進(jìn)行電泳鑒定，在約500 bp的位置出現(xiàn)陽性條帶，對(duì)樣本進(jìn)行切膠，按照試劑盒說明回收目的PCR產(chǎn)物片段，以30 μl EB重溶產(chǎn)物DNA，置于-20℃保存。

表1 HNF4α mRNA和β-actin擴(kuò)增引物及探針

1.5 全長(zhǎng)HNF4αcDNA的克隆在1.5 ml EP管中，加T4 DNA連接酶Buffer 1μl，pGEM-T Easy載體（50ng）1μl，HNF4αcDNA膠回收產(chǎn)物3 μl，T4 DNA連接酶（3 U/μl）1μl，加ddH2O補(bǔ)足至10 μl，輕柔混勻后，短暫離心，置于4℃過夜。自-70℃冰箱中取出JM109感受態(tài)細(xì)胞，置于冰上5 min，待菌液完全融化后，輕柔吹打混合，取感受態(tài)細(xì)胞50 μl，將其加入到連接體系的EP管中，靜置于冰上20 min，在42℃水浴中熱擊1 min，確保轉(zhuǎn)化EP管不會(huì)震動(dòng)。隨后，迅速將EP管移到冰浴中，讓細(xì)胞冷卻2 min。在每管連接反應(yīng)的轉(zhuǎn)化細(xì)胞中加入平衡至室溫的SOC培養(yǎng)基500 μl。在轉(zhuǎn)化管恒溫振蕩器中振蕩培養(yǎng)，37℃，180 r/m搖菌1 h。按照每細(xì)菌培養(yǎng)板300 μl轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基比例將培養(yǎng)基均勻涂布于含有X-Gal/IPTG/氨芐青霉素的固體平板培養(yǎng)皿表面。將培養(yǎng)皿置于37℃過夜。次日，挑取白色單克隆菌斑進(jìn)行鑒定。取雙蒸水10 μl，加入PCR反應(yīng)管中，采用無菌牙簽挑取白色單克隆菌落，置于水中沖涮，再在復(fù)制板膠上劃數(shù)下，將編好號(hào)的PCR管置于95℃金屬浴中10 min，隨后冰浴3 min，裂解細(xì)菌。將復(fù)制板置于37℃孵箱中過夜培養(yǎng)。以裂解菌液產(chǎn)物為模板，與前述1.4中PCR反應(yīng)條件和體系相同，進(jìn)行目的片段擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%TAE瓊脂糖凝膠電泳鑒定，出現(xiàn)目的片段則為陽性克隆。取陽性克隆菌液送測(cè)序鑒定。

1.6 體外轉(zhuǎn)錄合成cRNA，制備標(biāo)準(zhǔn)品提取測(cè)序正確的HNF4α全長(zhǎng)cDNA克隆質(zhì)粒，按照前述1.4中引物擴(kuò)增HNF4α全長(zhǎng)基因，利用Qiagen公司的PCR產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行純化回收，之后將其作為模板，按照Promega公司體外RNA制備試劑盒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)無RNase的Dnase I消化，除去其中的DNA模板后，75℃10 min，將DNase I滅活，經(jīng)RT-PCR驗(yàn)證所合成的cRNA，測(cè)定其A260吸收值，并計(jì)算濃度為1.0×108copies/10 μl，保存于-70℃?zhèn)溆谩?/p>

1.7 檢測(cè)HNF4α mRNA熒光定量RT-PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化和標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立以制備的cRNA為模板，對(duì)反應(yīng)體系中的引物、MGB探針、dNTP、Mg2+濃度以及退火溫度進(jìn)行優(yōu)化篩選，選擇靈敏度高、背景信號(hào)低、擴(kuò)增熒光信號(hào)曲線呈典型S型的反應(yīng)條件作為最適反應(yīng)條件。然后，用滅菌雙蒸水將純化的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品倍比稀釋至108、107、106、105、104、103、102copies/ml，采用最適條件進(jìn)行PCR反應(yīng)。在反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)擴(kuò)增曲線情況，設(shè)定和調(diào)整CT值的基線和閾值，通過收集的熒光曲線和CT值，計(jì)算機(jī)自動(dòng)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.8 HCC組織HNF4α免疫組化檢測(cè)及其HNF4α mRNA閾值的確定免疫組化主要步驟：采用Maxvision法，將切片置于60℃烤箱1 h；脫蠟水化，即石蠟切片經(jīng)二甲苯15 min，梯度酒精100%、100%、95%、90%、80%、70%各5 min；蒸餾水新配的3%H2O2室溫浸泡10 min，蒸餾水沖洗3次；將切片浸入0.01mol/L枸櫞酸鹽緩沖液（PH 6.0），在高壓鍋中加熱2 min，冷卻至室溫。PBS洗滌5 min×3次。滴加適當(dāng)稀釋（1:150）的一抗，37℃放置1 h，PBS洗滌5 min×3次。滴加二抗（1:1000），37℃放置20 min，PBS洗滌5 min×3次。滴加新配DAB顯色劑，室溫下控制顯色時(shí)間（約5 min），蒸餾水終止顯色時(shí)間；蘇木素復(fù)染核，沖洗，1%鹽酸酒精分化，自來水沖洗。梯度酒精70%、80%、90%、95%、100%、100%脫水各5 min，二甲苯20 min，中性樹膠封片。至少2名病理學(xué)醫(yī)師在雙盲情況下對(duì)免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行讀片，結(jié)果判定方法和參照標(biāo)準(zhǔn)具體如下：（1）染色強(qiáng)度（intensity）評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；（2）染色程度(extent)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，根據(jù)每個(gè)視野中陽性細(xì)胞的比例進(jìn)行評(píng)分，0%為0分，1%～10%為1分，11～50%為2分，51%～80%為3分，＞80%為4分；（3）免疫組化評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：染色強(qiáng)度得分與染色程度得分相乘，結(jié)果0～1分為0級(jí)，2～4分為1級(jí)，5～7分為2級(jí)，8～12分為3級(jí)；（4）表達(dá)水平判斷標(biāo)準(zhǔn)：0～1級(jí)定義為蛋白低表達(dá)，2～3級(jí)定義為蛋白高表達(dá)。同時(shí)提取HCC組織mRNA，用建立的方法檢測(cè)HNF4α mRNA和內(nèi)參照β-actin，分別將HNF4α mRNA和β-actin mRNA定量水平取lg值后相比，得到肝組織HNF4α mRNA水平（V-4α）。V-4α=[lg（HNF4α mRNA定量水平）]/lg (β-actin mRNA定量水平)。將V-4α水平與免疫組化檢測(cè)結(jié)果0～3對(duì)應(yīng)，從而得到V-4α的閾值。

2 結(jié)果

2.1 HNF4α基因cDNA擴(kuò)增情況取HCC患者外科手術(shù)切除的癌旁組織2份（患者A和患者B），提取肝組織總RNA，經(jīng)特異性引物擴(kuò)增，獲得HNF4αcDNA 1.5 kb產(chǎn)物，其1%TAE鑒定見圖1。

圖1 HNF4a cDNA擴(kuò)增產(chǎn)物電泳鑒定

2.2 HNF4α基因cDNA克隆情況取PCR產(chǎn)物鑒定條帶位置正確的樣本，經(jīng)膠回收目的片段，藍(lán)白斑篩選（圖2A），挑取白色陽性克隆菌落行PCR鑒定（圖2B），將菌液送測(cè)序、鑒定，結(jié)果顯示藍(lán)白斑篩選斑點(diǎn)均勻清晰，患者A和患者B分別挑選4個(gè)菌斑進(jìn)行菌落PCR，結(jié)果顯示克隆基因陽性且位置正確。

圖2 目的片段的克隆及鑒定

2.3 檢測(cè)HNF4α mRNA的熒光定量RT-PCR反應(yīng)條件的建立及優(yōu)化情況在PCR管中加入體外轉(zhuǎn)錄生成的cRNA 3 μl，作為標(biāo)準(zhǔn)品模板，經(jīng)多次重復(fù)性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該檢測(cè)方法最適反應(yīng)總體積為50 μL，其中模板3 μL；最適的引物濃度為0.2 μmol/L，探針濃度為0.3 μmol/L，Mg2+濃度為3.0 mmol/L，Taq DNA為1.25U，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶為300U，RNase Inhibitor為50 U。PCR反應(yīng)最適循環(huán)參數(shù)為42℃5 min，94℃3 min；之后94℃15 s，56℃15 s，72℃30 s，3個(gè)預(yù)擴(kuò)增循環(huán)；94℃15 s，60℃30 s，40個(gè)循環(huán)。

2.4 檢測(cè)HNF4α mRNA和β-actin mRNA標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立經(jīng)梯度稀釋的cRNA標(biāo)準(zhǔn)品在擴(kuò)增后呈現(xiàn)典型的S型擴(kuò)增曲線，對(duì)熒光信號(hào)分析顯示，在108、107、106、105、104、103、102copies/ml范圍內(nèi)，7個(gè)點(diǎn)具有良好的線性關(guān)系，斜率為-3.237，相關(guān)系數(shù)r值達(dá)0.994，表明該標(biāo)準(zhǔn)品達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。將2.5×108copies/ml的β-actin mRNA標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)稀釋為108、106、105、103copies/ml，標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率為-3.037，相關(guān)系數(shù)r值為0.996。以樣本的拷貝數(shù)對(duì)數(shù)（X）為橫坐標(biāo)，檢測(cè)的循環(huán)數(shù)CT值為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖3，以用于HNF4α mRNA和β-actin mRNA的絕對(duì)定量。

圖3 檢測(cè)HNF4α mRNA和β-actin mRNA的熒光定量PCR擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.5 HCC組織HNF4α蛋白表達(dá)情況經(jīng)免疫組化檢測(cè)，在16例HCC組織中，發(fā)現(xiàn)13例（81.3%）HNF4α蛋白表達(dá)陽性，其中0級(jí)3例（18.8%），1級(jí)6例（37.5%），2級(jí)5例（31.3%），3級(jí)2例（12.5%，圖4）。

圖4 HCC組織HNF4α蛋白表達(dá)情況（SP，400×）

2.6 HCC組織HNF4α mRNA水平與HNF4α蛋白表達(dá)強(qiáng)度的對(duì)應(yīng)比較檢測(cè)16例HCC組織HNF4α mRNA和β-actin mRNA，按上述方法計(jì)算V-4α值。免疫組化檢測(cè)結(jié)果與V-4α值的對(duì)應(yīng)結(jié)果為：0級(jí)對(duì)應(yīng)V-4α≤0.15；1級(jí)對(duì)應(yīng)0.15＜V-4α≤0.45；2級(jí)對(duì)應(yīng)0.46＜V-4α≤0.77；3級(jí)對(duì)應(yīng)V-4α＞0.77（表2），結(jié)果顯示HNF4α mRNA定量結(jié)果與HNF4α蛋白表達(dá)強(qiáng)度結(jié)果有一致性的對(duì)應(yīng)關(guān)系，但HNF4α mRNA定量結(jié)果更快捷，人為主觀影響因素更小，為后續(xù)大樣本分析其對(duì)應(yīng)關(guān)系，可能得到更精確的閾值，為臨床提供更可靠的診斷支持。

表2 HCC組織HNF4α mRNA水平與HNF4α蛋白表達(dá)強(qiáng)度比較

3 討論

積極尋找預(yù)測(cè)HCC發(fā)生、轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)，判斷HCC患者預(yù)后的腫瘤標(biāo)志物成為目前HCC研究的重點(diǎn)及熱點(diǎn)內(nèi)容[18]。HNF4α作為一個(gè)新的HCC生物標(biāo)志物，在HCC的診斷，判斷腫瘤轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)、治療結(jié)果和預(yù)后等方面可能具有重要價(jià)值。HNF4α在正常肝組織中表達(dá)最高，高分化和中分化組織腫瘤HNF4α表達(dá)高于低分化肝細(xì)胞癌。鑒于HNF4α蛋白只在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，臨床只能采用免疫組化檢測(cè)判斷HNF4α蛋白在HCC組織中的表達(dá)量。我們建立了檢測(cè)HCC組織HNF4α mRNA的定量方法，通過內(nèi)參矯正后，可以反映HCC組織HNF4α的表達(dá)量。我們隨機(jī)挑選16例HCC患者檢測(cè)HNF4α mRNA水平，同時(shí)采用免疫組化法檢測(cè)了HNF4α蛋白表達(dá)，經(jīng)比較兩者結(jié)果，得到了HNF4α mRNA水平閾值，即0級(jí)對(duì)應(yīng)V-4α≤0.15，1級(jí)對(duì)應(yīng)0.15＜V-4α≤0.45，2級(jí)對(duì)應(yīng)0.46＜V-4α≤0.77，3級(jí)對(duì)應(yīng)V-4α＞0.77。這樣可以快速判斷HCC組織的分化程度，從而獲得其生物學(xué)性質(zhì)的判定。

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（收稿：2016-11-17）

（本文編輯：陳從新）

EstablishmentofRT-PCRforthedetectionofhepatocytenuclearfactor4αinhepatocellular carcinoma

Zhang Wei，Dong Zheng，Kong Huifang，et al.Research Center for Liver Cancer，302nd Hospital，Beijing，100039

ObjectiveTo establish a quantified reverse transcription-polymerase chain reaction（RT-PCR）for the detection of hepatocyte nuclear factor 4α（HNF4α）mRNA in hepatocellular carcinoma tissues.Method Total RNA was extracted from 16 cancerous tissues of patients with hepatocellular carcinoma（HCC）.The fulllength cDNA was obtained by RT-PCR and the products was sequenced after TA cloning.Then，the primer and MGB fluorescent probe were designed for HNF4α mRNA quantification.A one-step RT quantitative PCR assay was established and β-actin mRNA acted as internal control.The HNF4aα mRNA levels in the tissues was calculated.The expression of HNF4α protein was also detected in cancerous tissues by immunohistochemical staining.ResultsThequantitativedetectionofHNF4αmRN（V-4α）inHCCtissueswasestablished successfully，and the slope of the standard curve was-3.237 with the correlation coefficient（r）being 0.994.The standard curve of β-actin mRNA was-3.037，and the correlation coefficient（r）was 0.996.The HNF4α mRNA levels were consistent with the HNF4α protein expression in the 16 HCC tissues.ConclusionWe successfully establish a quantitative PCR for the detection of HNF4α mRNA in HCC patients，which warrants further study.

Hepatocellularcarcinoma；Hepatocytenuclearfactor4α；Quantifiedreversetranscriptionpolymerase chain reaction

10.3969/j.issn.1672-5069.2017.03.012

100039北京市解放軍第302醫(yī)院肝臟腫瘤診療與研究中心

張偉，男，35歲，碩士研究生，主治醫(yī)師。主要從事肝癌臨床診治研究。E-mail：yanjiu3369@126.com

榮義輝，E-mail：ryh3021977@hotmail.com