劉 擎，張瀟涵，仰明明，周澤啟，王麗京，李江超

(廣東藥科大學(xué) 基礎(chǔ)學(xué)院血管生物學(xué)研究所，廣州 510006)

研究報(bào)告

Shkbp1缺失對(duì)小鼠 T淋巴細(xì)胞系亞群的影響

劉 擎，張瀟涵，仰明明，周澤啟，王麗京，李江超

(廣東藥科大學(xué) 基礎(chǔ)學(xué)院血管生物學(xué)研究所，廣州 510006)

目的 探討Shkbp1缺失小鼠(Shkbp-1-/-)的血液、骨髓、脾臟中血液細(xì)胞分類和T細(xì)胞亞群的變化。方法 采用Shkbp-1-/-轉(zhuǎn)基因小鼠，經(jīng)PCR 鑒定基因型；利用全自動(dòng)血液檢測(cè)儀測(cè)定血液細(xì)胞分類；采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)Shkbp-1-/-和對(duì)照組小鼠血液、骨髓、和脾臟中T 淋巴細(xì)胞亞群。結(jié)果 血常規(guī)結(jié)果：中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞有增高趨勢(shì)，且有顯著差異。淋巴細(xì)胞未見顯著差異。流式結(jié)果顯示：對(duì)照組血液中CD4+CD8+雙陽性細(xì)胞降低，骨髓中CD3+、CD4+升高。 但脾臟組織中，其CD3+、CD4+、CD8+、CD4+CD8+雙陽性細(xì)胞均呈下降趨勢(shì)。結(jié)論 Shkbp1參與血液細(xì)胞的成熟分化，影響了免疫細(xì)胞數(shù)量，本研究為探索Shkbp1如何參與血液細(xì)胞的分化奠定了研究基礎(chǔ)。

Shkbp-1； T細(xì)胞亞群；CD3+；CD4+；CD8+；基因工程小鼠

Shkbp1基因于2008年通過酵母雙雜交的方法被篩選出來[1]，研究表明Shkbp1蛋白存在兩個(gè)富含脯氨酸(PXXXPR)的結(jié)構(gòu)域第618～623位氨基酸殘基(PSPSPR)和第679-684位氨基酸殘基(PTRApR)參與CIN85的SH3保守結(jié)構(gòu)域結(jié)合[2，3]。Shkbp1可以競(jìng)爭抑制CIN85和c-Cbl的結(jié)合,從而阻斷表皮生長因子受體(EGFR)的內(nèi)吞和降解。Cbl是一種泛素化激酶，有c-Cbl，Cbl-b和Cbl-3三個(gè)成員組成。c-Cbl它能夠與酪氨酸激酶和受體酪氨酸激酶結(jié)合并被磷酸化，磷酸化后的c-Cbl泛素化激酶活性被激活，使與其結(jié)合的酪氨酸激酶和受體酪氨酸激酶多聚泛素化降解[4]。

一般情況下，受體活化并傳遞信號(hào)后就會(huì)從細(xì)胞表面脫落，以避免信號(hào)持續(xù)活化對(duì)有機(jī)體產(chǎn)生傷害。當(dāng)受體酪氨酸激酶活化后的負(fù)調(diào)控被阻斷或者擾亂后，細(xì)胞功能異常，人體就會(huì)產(chǎn)生惡性腫瘤等疾病[5]。EGF(表皮生長因子)和EGFR結(jié)合，二聚化后自身磷酸化的EFGR與c-cbl(泛素化激酶)通過SH2保守結(jié)構(gòu)域結(jié)合并使之磷酸化，激活泛素酶活性使EGFR一部分降解[6-8]。其次，Shkbp1被報(bào)道與遺傳疾病相關(guān)，還有報(bào)道其與卵巢癌[9]和白血病[10]相關(guān)。

Shkbp1參與血細(xì)胞起源、增殖、分化和發(fā)育成熟的過程。血細(xì)胞在造血器官或組織中產(chǎn)生，發(fā)育成熟或接近成熟時(shí)才釋放到血液中，但是該基因的缺失是否能引起小鼠血液細(xì)胞分化和免疫細(xì)胞的改變，并未見報(bào)道。本研究針對(duì)Shkbp1基因缺失小鼠，檢測(cè)其免疫功能的變化，為深入了解Shkbp1提供了理論基礎(chǔ)，為了解Shkbp1對(duì)免疫的影響提供了動(dòng)物水平的模型。本文針對(duì)免疫功能檢測(cè)血常規(guī)及流式等一系列實(shí)驗(yàn)，旨在探討該基因缺失條件下的小鼠免疫功能的變化。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)環(huán)境

Shkbp1敲除小鼠，簡稱Shkbp-/-小鼠，以C57BL/6背景，是耿建國教授(密歇根大學(xué))饋贈(zèng)[11]，由本實(shí)驗(yàn)室何曉東老師飼養(yǎng)保種，并且開展了一些早期實(shí)驗(yàn)，其結(jié)果已經(jīng)發(fā)表[12]。于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(粵)2008-0002)購買C57BL/6小鼠。以上實(shí)驗(yàn)用鼠均自由飼養(yǎng)在SPF環(huán)境條件，使用許可證號(hào)改為【SYXK(粵)2012-0125】。室內(nèi)溫度維持在(24±2)℃之間，濕度保持在40%～60%，噪聲小于60 db。

小鼠飼養(yǎng)和鑒定:所有小鼠均于SPF 級(jí)環(huán)境下飼養(yǎng)，將Shkbp-1+/-雄鼠和Shkbp-1+/-雌鼠雜交，得到的子代有三種情況Shkbp-1+/-、Shkbp-1+/+、Shkbp-1-/-，經(jīng)鑒定后得到實(shí)驗(yàn)鼠Shkbp-/-小鼠和對(duì)照鼠Shkbp-1+/+。Shkbp-1 小鼠鑒定引物序列為：P1：5-′CTAAATCACTCCAAAGGATCC-3′；P2：5-′TACCGGTGGATGTGGAATGT-3′；P3：5-′CTAAATCA CTCCAAAGGATCCC-3′；P4：5-′ATTCATGCATTCT CCTTTGGCA-3′。PCR 反應(yīng)條件為：95℃ 5 min預(yù)變性，94℃ 30 s變性，58℃ 30 s退火40 個(gè)循環(huán)；72℃ 45 s延伸，72℃ 2 min充分延伸，4℃冷卻擴(kuò)增產(chǎn)物。P1 和P2是鑒定突變型條帶，擴(kuò)增條帶為307 bp，P3和P4 是鑒定野生型條帶，擴(kuò)增條帶為483 bp。在配置好的1.2%瓊脂糖凝膠中，利用TAE 電泳緩沖液進(jìn)行電泳設(shè)定條件：165 V，30 min。再將凝膠放置在凝膠成像系統(tǒng)里，電腦成像系統(tǒng)里觀察PCR的電泳結(jié)果[13]。

1.2 儀器與試劑

PCR 引物購自Life上海分公司，PCR Mix購自美國Thermo Fisher公司；EDTA·K2抗凝管采集血樣；利用全自動(dòng)五分類血液分析儀進(jìn)行檢測(cè)分析，其型號(hào)XT-2000i，Sysmex，日本；檢測(cè)時(shí)，設(shè)置小鼠血樣程序進(jìn)行檢測(cè)。流式細(xì)胞儀型號(hào)為：BD FACSCantoTMII，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)抗體：CD3-FITC(11-0032)，CD4-PE(12-0041)，CD8e-PerCP-Cyanine 5.5(45-0081)以上抗體均購自eBioscience 公司。

1.3 血常規(guī)檢測(cè)

取8 周齡的Shkbp-1-/-，C57 小鼠各6 只，乙醚麻醉約1 min，眼眶取血200 μL到1 mL 的EDTA·K2抗凝管中，上機(jī)前4℃放置。

1.4 血液CD3、CD4、CD8 細(xì)胞檢測(cè)

取8 周齡的Shkbp-1-/-，C57 小鼠各6 只，眼眶取血到1 mL的EDTA·K2抗凝管中，抽取50 μL，加入CD3、CD4、CD8 抗體避光孵育30 min，用紅細(xì)胞裂解液裂解15 min，1500 r/min，離心5 min；棄上清液，用0.5% BSA 1 mL 細(xì)胞重懸，1 500 r/min，離心5 min，棄上清液；重復(fù)1次，取200 μL 混勻，上機(jī)檢測(cè)[14]。

1.5 脾臟CD3、CD4、CD8 細(xì)胞檢測(cè)

以上小鼠摘除脾臟，用0.5% BSA 在0.22 mm 尼龍篩網(wǎng)研磨過濾，取篩網(wǎng)下的液體50 μL，加入CD3、CD4、CD8 抗體避光孵育30 min，用紅細(xì)胞裂解液裂解10 min，1 500 r/min，離心5 min；棄上清液，用0.5% BSA 1 mL 細(xì)胞重懸，1 500 r/min，離心5 min，棄上清；重復(fù)1次，取200 μL 混勻，上機(jī)檢測(cè)。

1.6 骨髓CD3、CD4、CD8 細(xì)胞檢測(cè)

將以上小鼠后腿取下，抽提骨髓，同上述分離單細(xì)胞，進(jìn)行流式實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)涉及的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法：采用M依SD 或中位數(shù)表示，利用Gradprim 5.0 軟件，采用t檢驗(yàn)，假設(shè)條件P<0.05 具有統(tǒng)計(jì)意義。

2 結(jié)果

2.1 Shkbp-1-/-小鼠基因型鑒定

Shkbp1敲除小鼠構(gòu)建是敲除了Shkbp1基因的1-6個(gè)六個(gè)外顯子而獲得的(圖1A)。將Shkbp-1+/-雄鼠和Shkbp-1+/-雌鼠雜交，得到的子代有三種情況Shkbp-1+ /-、Shkbp-1+ / +、Shkbp-1-/-，經(jīng)鑒定后得到實(shí)驗(yàn)鼠Shkbp-1-/-小鼠和對(duì)照鼠Shkbp-1+/+。其中野生條帶在483 bp處，突變條帶在307 bp處(圖1B)。

2.2 Shkbp-1-/-小鼠血常規(guī)檢測(cè)變化

通過全自動(dòng)五分類血液分析儀分析血液，設(shè)置小鼠血液分類檢測(cè)程序。檢測(cè)正常生理?xiàng)l件8周齡的Shkbp-1-/-小鼠與同周齡的C57對(duì)比，白細(xì)胞總數(shù)無明顯差異(圖2A)。在白細(xì)胞分類中，Shkbp-1-/-小鼠與C57相比，淋巴細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)有降低趨勢(shì)，但無顯著差異(圖2B)；單核細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)，兩組之間無差異(圖2C)。但是，Shkbp-1-/-小鼠與C57相比，中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞有增高趨勢(shì)(圖2D-圖2E)，并且有顯著差異(P<0.05)。

2.3 Shkbp-1-/-小鼠外周血中CD4+CD8+雙陽性細(xì)胞數(shù)目降低

T細(xì)胞是重要的免疫細(xì)胞，CD3+抗體標(biāo)記的是T淋巴細(xì)胞，它是胸腺依賴淋巴細(xì)胞，其具有多種重要的免疫功能。不同的免疫功能與其細(xì)胞膜上的分化抗原(CD)的種類相關(guān)聯(lián)，其中CD4和CD8是關(guān)鍵的分化抗原。為探究它是否發(fā)生變化，我們利用流式檢測(cè)CD3+，CD4+，CD8+細(xì)胞亞群的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，將C57 小鼠和Shkbp-1-/-小鼠的外周血進(jìn)行紅細(xì)胞裂解，而后標(biāo)記CD3、CD4、CD8 抗體，用流式細(xì)胞技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)[15，16]。將CD3 陽性細(xì)胞進(jìn)行設(shè)區(qū)域設(shè)門(圖3A和3B)。檢測(cè)結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組小鼠CD4+CD8+雙陽性細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)和百分比都有下降趨勢(shì)，與正常小鼠對(duì)比(圖3E～圖3F)，差異明顯(P<0.05)[17，18]。CD4+、CD8+細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)及百分比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，所以數(shù)據(jù)未展示。

2.4 Shkbp-1-/-小鼠骨髓中CD3+、CD4+細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)升高

骨髓是免疫器官中樞免疫器官之一。主要作用為造血及B細(xì)胞分化發(fā)育提供場(chǎng)所，為再次體液免疫應(yīng)答發(fā)生提供場(chǎng)所[19]。同樣，制備單細(xì)胞懸液后，進(jìn)行流式檢測(cè)，將CD3陽性細(xì)胞進(jìn)行設(shè)區(qū)域設(shè)門(圖4A～圖4B)，流式檢測(cè)CD4 和CD8 細(xì)胞(圖4C～圖4D)。檢測(cè)結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組小鼠CD3細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)和百分比都有上升趨勢(shì)，與正常小鼠對(duì)比(圖4E～圖4F)，差異明顯(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)組小鼠CD4細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)也有上升趨勢(shì)(圖4G)，差異明顯(P<0.05)。

2.5 Shkbp-1-/-小鼠脾臟中CD3+、CD4+、CD8+、CD4+CD8+雙陽性細(xì)胞均顯著減少

脾臟是機(jī)體最大的免疫器官，占全身淋巴組織總量的25%，含有大量的淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，是機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫的中心[20，21]。通過制備單細(xì)胞懸液，進(jìn)行流式檢測(cè)，將CD3 陽性細(xì)胞進(jìn)行設(shè)區(qū)域設(shè)門(圖5A～圖5B)，流式檢測(cè)CD4 和CD8 細(xì)胞代表圖(圖5C和圖5D)。結(jié)果提示：Shkbp-/-小鼠脾臟中CD3+絕對(duì)計(jì)數(shù)降低(圖5E)，并且有顯著差異(P<0.001); CD4+絕對(duì)計(jì)數(shù)降低(圖5F)，有顯著差異(P<0.01);CD8+絕對(duì)計(jì)數(shù)降低(圖5G)，有顯著差異(P<0.001)。并且CD4+CD8+雙陽性細(xì)胞也降低(圖5H)，差異顯著(P<0.001)。

注：A: Shkbp-1-/- 小鼠的構(gòu)建，我們的小鼠為敲除了前六個(gè)外顯子構(gòu)建的；B：Shkbp-1-/- 小鼠的鑒定，2號(hào)為Shkbp-1+/+ 基因型小鼠，4號(hào)為Shkbp-1-/- 基因型小鼠，7號(hào)為Shkbp-1+/- 基因型小鼠。圖1 Shkbp-1-/-小鼠的構(gòu)建與鑒定Note. A: Construction of the Shkbp1 knockout mice, obtained by knocking out the 1-6 exons of the Shkbp1 gene; B: Identification of Shkbp-1-/- mouse. No. 2 is of Shkbp-1 +/+ genotype mouse, No. 4 is of Shkbp-1 -/- mouse genotype, No. 7 is of Shkbp-1+/- genotype mouse.Fig.1 Construction and identification of the Shkbp-1 - / - mice

圖2 全自動(dòng)血液細(xì)胞分類儀檢測(cè)小鼠血液中白細(xì)胞分類變化Fig.2 Changes of leukocyte classification in the blood of mice detected with an automatic blood cell sorter. *P<0.05, **P<0.01

注：A, B: 流式檢測(cè)C57 小鼠和Shkbp-1-/- 小鼠血液中CD3+ 淋巴細(xì)胞的區(qū)域設(shè)門; C、D：流式檢測(cè)CD4和CD8細(xì)胞；E：CD4+CD8+ 雙陽性細(xì)胞在CD3+ 細(xì)胞中的絕對(duì)計(jì)數(shù)；F：CD4+CD8+ 雙陽性細(xì)胞占CD3+ 細(xì)胞的百分比;*p<0.05圖3 Shkbp-/-小鼠血液中CD4+CD8+ 雙陽性細(xì)胞降低Note. A, B: The gated area of CD3 + lymphocytes in the blood of C57 mice and shkbp-1-/- mice. C, D: CD4 and CD8 cells detected with flow cytometry; E: The absolute number of CD4 +CD8 + double-positive cells in CD3+ cells; F: Percentage of CD4+CD8+ double positive cells in CD3+ cells. *P<0.05.Fig.3 Count of CD4+CD8+ double-positive cells is decreased in the blood of Shkbp-1- / - mice

注：A、B: 流式檢測(cè)C57 小鼠和Shkbp-1-/- 小鼠骨髓中CD3+ 淋巴細(xì)胞的區(qū)域設(shè)門；C、D：流式檢測(cè)CD4和CD8細(xì)胞；E、F：CD3+ 細(xì)胞在骨髓細(xì)胞中的絕對(duì)計(jì)數(shù)及百分比；G：CD4+ 細(xì)胞在CD3+ 細(xì)胞中的絕對(duì)計(jì)數(shù);* 表示P<0.05圖4 Shkbp-/-小鼠骨髓中CD3+、CD4+升高Note. A, B: The gated area of CD3 + lymphocytes in the bone marrow of C57 mice and shkbp-1-/- mice.C, D: The CD4 and CD8 cells detected by flow cytometry. E,F: Absolute number and percentage of CD3+ cells in the bone marrow cells. G: Absolute number of CD4 + cells in the CD3+ cells, *P<0.05.Fig.4 The Count of CD3 +, CD4 + double-positive cells is increased in the bone marrow of Shkbp-1- / - mice

注：A、B: 流式檢測(cè)C57 小鼠和Shkbp-1-/- 小鼠脾臟中CD3+ 淋巴細(xì)胞的區(qū)域設(shè)門; C、D：流式檢測(cè)CD4 和CD8 細(xì)胞；E：CD3+細(xì)胞在脾臟細(xì)胞中的絕對(duì)計(jì)數(shù)；F、G、H：CD4+ 細(xì)胞、CD8+細(xì)胞、CD4+CD8+ 雙陽性細(xì)胞在CD3+ 骨髓細(xì)胞中的絕對(duì)計(jì)數(shù)及百分比。*表示P<0.05,**表示P<0.01,***表示P<0.001 圖5 Shkbp-/-小鼠脾臟中CD3+、CD4+、CD8+、CD4+CD8+ 雙陽性細(xì)胞降低Note. A, B: Flow cytometry detection of spleen CD3+ lymphocytes gated area in the C57 mice and Shkbp-1-/- mice. C, D: Detection of CD4 and CD8 cells by flow cytometry; E: Absolute number and percentage of CD3+ cells in spleen cells. F, G, H: Absolute count and percentage of CD4+ cells, CD8+ cells, and CD4+CD8+ double-positive cells in CD3+ cells, *P<0.05, **P<0.01, *** P<0.001Fig.5 The counts of CD3+, CD4+, CD8+, and CD4+CD8+ double positive cells are significantly reduced in the spleen of Shkbp-1-/- mice

圖6 Shkbp-1-/-小鼠流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)結(jié)果Fig.6 Results of flow cytometry detection of Shkbp-1-/- mice

3 討論

Shkbp1是調(diào)控EGFR降解相關(guān)的分子，我們的研究表明Shkbp基因小鼠免疫細(xì)胞和血液細(xì)胞出現(xiàn)異常。本研究結(jié)果顯示，骨髓中CD3+、CD4+細(xì)胞數(shù)目升高，對(duì)照組血液中CD4+CD8+雙陽性細(xì)胞數(shù)目降低，并且在脾臟組織中，流式結(jié)果顯示其CD3+、CD4+、CD8+、CD4+CD8+雙陽性細(xì)胞數(shù)目均呈下降趨勢(shì)。(如圖6)脾臟為最大的免疫器官，淋巴細(xì)胞數(shù)量豐富。一般來說，T細(xì)胞一旦成熟，就隨血流離開胸腺進(jìn)入外周免疫器官或外周血。但是，我們發(fā)現(xiàn)Shkbp1敲除小鼠的脾臟中各種免疫細(xì)胞均顯著降低，提示Shkbp1在血液細(xì)胞的分化成熟調(diào)控中有重要作用。

在本研究中，我們采用的是專門設(shè)置檢測(cè)小鼠血液的儀器程序來檢測(cè)血常規(guī)，摒棄了原來用臨床檢測(cè)小鼠血常規(guī)的不足。但是，同我們以前的結(jié)果相比，對(duì)照組C57小鼠白細(xì)胞總數(shù)相差5.5×109個(gè)/L左右，淋巴細(xì)胞數(shù)量相差1.5×109個(gè)/L左右，單核細(xì)胞數(shù)量相差0.8×109個(gè)/L左右。其原因可能是：(1)在季節(jié)上，存在冬夏兩個(gè)季節(jié)氣溫的差異。(2)在小鼠來源問題上，本實(shí)驗(yàn)所用的C57小鼠為廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購買后于本實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物房內(nèi)飼養(yǎng)繁殖使用，以前所用的C57小鼠于廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購買后直接使用。 其原因有待進(jìn)一步深入檢測(cè)和了解，我們一直在關(guān)注該問題。

另外，還利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞亞群。此次研究取材于8周大小的Shkbp-/-小鼠及對(duì)照組C57小鼠，對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組各取材6只。取其外周血進(jìn)行流式測(cè)定，研究結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組CD4+CD8+雙陽性細(xì)胞數(shù)目降低，目前關(guān)于這一概念的相關(guān)報(bào)道較少。近年來，越來越多的證據(jù)表明：人類和其他動(dòng)物外周血中存在少量CD4+CD8+雙陽性T細(xì)胞，并具有獨(dú)特的免疫活性。至于為什么實(shí)驗(yàn)組CD4+CD8+雙陽性細(xì)胞數(shù)目降低，目前尚不清楚，仍需做進(jìn)一步研究。

胚胎時(shí)期的脾臟曾一度為造血器官，可產(chǎn)生各種血細(xì)胞。出生后脾臟在異常情況下可髓外造血，但脾臟仍能制造淋巴細(xì)胞等與免疫相關(guān)系的細(xì)胞和物質(zhì)。它有過濾血液的作用，還會(huì)對(duì)新生的紅細(xì)胞進(jìn)行必要的“修整”，并貯有大量的血小板。根據(jù)以往的報(bào)道，Shkbp1可以競(jìng)爭抑制CIN85和c-Cbl的結(jié)合,從而阻斷表皮生長因子受體的內(nèi)吞和降解,也能上調(diào)表皮生長因子受體相關(guān)的報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄水平,那么是否Shkbp1可能也是通過與CIN85競(jìng)爭引起了c-Cb-1變化，參與了血液的分化，有待進(jìn)一步研究。

總之，我們研究結(jié)果表明Shkbp1參與血液的成熟分化，并影響了免疫細(xì)胞數(shù)量的改變，為深入了解血液的分化奠定了基礎(chǔ)。

4 致謝

本研究由國家自然基金(No.81472336 和No.31471290)和廣東省科技計(jì)劃(2015A030302086、201-4A020212313和2015A030302085)共同資助，感謝廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所羅挺老師在流式檢測(cè)方面給予的支持。

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Effects of Shkbp1 deletion on mouse T lymphocyte subsets

LIU Qing, ZHANG Xiao-han, YANG Ming-ming, ZHOU Ze-qi, WANG Li-jing, LI Jiang-chao

(Guangdong Pharmaceutical University，School of Basic Courses, the Vascular Biology Institute, Guangzhou 510006，China)

Objective Shkbp is also called Shkbp1, can competitively inhibit binding CIN85 and c-Cbl, thereby blocking the epidermal growth factor receptor (EGFR) endocytosis and degradation, to play a role in tumor promotion. This study aims to explore the changes in blood cell classification and T cell subsets in blood, bone marrow, and spleen in Shkbp1-deletion (Shkbp-1- / -) mice. Methods Shkbp-1- / -transgenic mice were identified by PCR genotyping. Blood cell classification was performed using an automatic classification system. Flow cytometry was used to detect the T lymphocyte subsets in the blood, bone marrow, and spleen of Shkbp-1- / -and control mice. Results Routine blood examination showed that neutrophils and eosinophils tended to increase and showing significant differences, and there was no significant difference in lymphocytes. The flow cytometry results showed that there was a decrease of CD4+CD8+double positive cells and increase of bone marrow CD3+and CD4+cells in the control group. However, there was a decreasing trend of CD3+, CD4+, CD8+, and CD4+CD8+cellsin the spleen tissues. Conclusions Shkbp1 is involved in the maturation and differentiation of blood cells, and affects the number of immune cells. This study lays a foundation for the study of how Shkbp1 is involved in the differentiation of blood cells.

Shkbp-1; Leukocytes; T cell subsets; CD3+, CD4+, CD8+, CD4+CD8+lymphocytes；Genetically engineered mice

國家自然基金(No.81472336 和No.31471290)和廣東省科技計(jì)劃(2015A030302086 和2014A020212313) 共同資助。

劉擎(1992-)，女，研究生，專業(yè)：病理學(xué)與病理生理學(xué)。Email:liuqing6620@163.com。

李江超(1976-)，男，副研究員，研究方向：腫瘤微環(huán)境。Email:lijiangchao1234@163.com。

R-33

A

1671-7856(2017) 04-0056-07

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.04.010

2016-11-16