李 彤， 翟二濤， 許麗霞， 黃霖琳， 彭 穗， 曾志榮

(中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科， 廣東 廣州 510080)

阿帕替尼通過(guò)阻斷VEGF通路增強(qiáng)胃癌放療療效*

李 彤， 翟二濤， 許麗霞， 黃霖琳， 彭 穗， 曾志榮△

(中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科， 廣東 廣州 510080)

目的： 探討血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)受體2酪氨酸激酶抑制劑阿帕替尼對(duì)胃癌細(xì)胞株SGC-7901放療療效的影響及其可能機(jī)制。方法: 試驗(yàn)設(shè)對(duì)照組、阿帕替尼組、單純放療組與聯(lián)合組。CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力，流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡比例與細(xì)胞周期，免疫熒光染色觀察細(xì)胞核內(nèi)γ-H2AX的表達(dá)，Western blot法檢測(cè)細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)蛋白。結(jié)果: 與阿帕替尼組或單純放療組相比，阿帕替尼聯(lián)合X射線顯著降低SGC-7901細(xì)胞的生長(zhǎng)活力(P<0.01)，增殖相關(guān)蛋白p-PLCγ1和p-ERK1/2的水平下降；細(xì)胞凋亡比例明顯升高(P<0.01)，凋亡相關(guān)蛋白PARP、cleaved caspase-9和cleaved caspase-3蛋白水平上調(diào)，Bcl-2表達(dá)下降；SGC-7901細(xì)胞核內(nèi)γ-H2AX焦點(diǎn)淬滅延遲，表明阿帕替尼干擾放射線誘導(dǎo)的DNA雙鏈斷裂的修復(fù)；SGC-7901 G2期細(xì)胞比例顯著增高(P<0.01)。結(jié)論: 阿帕替尼通過(guò)阻斷VEGF通路增加胃癌細(xì)胞對(duì)X射線照射的敏感性。

胃癌； 放療； 阿帕替尼； 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子

胃癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一[1]，我國(guó)每年約有40萬(wàn)例新發(fā)胃癌，占全球的43%[2]。我國(guó)胃癌篩查沒(méi)有韓國(guó)、日本等東亞國(guó)家普遍，多數(shù)患者確診時(shí)屬胃癌中晚期。胃癌的主要治療方法包括外科手術(shù)、化療、放療。盡管化療和手術(shù)治療的方法在不斷進(jìn)步，但晚期胃癌患者的預(yù)后依然較差[3]。對(duì)于初期或手術(shù)后的病人，放療是良好的局部區(qū)域控制治療手段。研究表明，腫瘤組織中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的高表達(dá)與放療抵抗顯著相關(guān)[4]，靶向阻斷VEGF信號(hào)通路有潛在放療增敏的可能性。阿帕替尼(apatinib)是VEGF受體(VEGF receptor，VEGFR)2的酪氨酸激酶抑制劑，可靶向殺傷腫瘤細(xì)胞[5]。目前尚缺乏對(duì)阿帕替尼與胃癌放療相關(guān)性的研究。本研究擬觀察X線照射聯(lián)合阿帕替尼干預(yù)對(duì)胃癌細(xì)胞的細(xì)胞周期、細(xì)胞活力及凋亡的影響，并初步探討其分子信號(hào)通路，明確阿帕替尼是否可以增加胃癌對(duì)放療的敏感性，為指導(dǎo)臨床治療提供新的理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞和主要試劑

人胃癌細(xì)胞株SGC-7901購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)。

RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶(Gibco)；PBS和RIPA細(xì)胞裂解液(Thermo Fisher Scientific)；阿帕替尼(恒瑞)；CCK-8試劑盒(Dojindo)；抗磷脂酶C(phospholipase C，PLC)、p-PLCγ1、p-ERK1/2、ERK1/2、多聚(ADP-核糖)聚合酶[poly(ADP-ribose) polymerase，PARP]、caspase-3、caspase-9、Bcl-2、GAPDH抗體和相應(yīng) II 抗(Cell Signaling Technology)；5% Triton、DAPI、山羊血清和多聚甲醛；兔抗人磷酸化組蛋白H2AX(γ-H2AX)抗體(Bioworld)；羊抗兔IgG(Santa Cruz)。

2 主要方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組 SGC7901細(xì)胞置于含10% 胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基(含1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素)中，于37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)設(shè)4個(gè)組別：對(duì)照(control)組不作處理；阿帕替尼組使用終濃度為5 mmol/L的阿帕替尼處理；單純放療組接受10 Gy X射線的電離輻射(ionizing radiation，IR);聯(lián)合(combination)組使用5 mmol/L阿帕替尼處理24 h后接受10 Gy的X射線照射。

2.2 細(xì)胞活力的檢測(cè) 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SGC7901細(xì)胞接種于96孔板，每孔含有1×104細(xì)胞懸液100 μL。使用含10% 胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)對(duì)照組和單純放療組細(xì)胞；在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中加入終濃度為5 mmol/L的阿帕替尼培養(yǎng)阿帕替尼組和聯(lián)合組細(xì)胞。培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜，單純放療組與聯(lián)合組接受10 Gy的X線照射。向每孔加入10 μL CCK-8溶液(此后所有操作步驟均為避光進(jìn)行)，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育3 h。用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度(A450)值，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)分析 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SGC7901細(xì)胞均勻接種于6孔板，每孔含5×105細(xì)胞。對(duì)照組和單純放療組常規(guī)培養(yǎng)，阿帕替尼組和聯(lián)合組給予終濃度為5 mmol/L的阿帕替尼處理，24 h后單純放療組和聯(lián)合組給予10 Gy X射線照射。各組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h。PBS輕柔沖洗各組SGC-7901細(xì)胞后，將各組樣品一部分以PBS重懸為3×109/L單細(xì)胞懸液，每組取1 mL立即進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)；另一部分以70%冰乙醇重懸為3×109/L單細(xì)胞懸液，-20 ℃固定過(guò)夜，每組取1 mL進(jìn)行細(xì)胞周期檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

2.4 Western blot法檢測(cè)蛋白質(zhì) 細(xì)胞處理同上。棄細(xì)胞培養(yǎng)液，用RIPA細(xì)胞裂解液∶PMSF(10∶1)的混合溶液提取細(xì)胞總蛋白，酶標(biāo)儀測(cè)定蛋白濃度。配10%的SDS-PAGE膠，每組取總蛋白30 μg上樣，恒壓，濃縮膠 80 V、分離膠 100 V電泳100 min， 4 ℃、400 mA轉(zhuǎn)膜120 min。裁膜，5% BSA室溫封閉 1.5 h，加入I抗于4 ℃孵育過(guò)夜，1×TBST洗膜，加入相應(yīng) II 抗室溫孵育2 h，1×TBST洗膜，曝光顯影。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

2.5 免疫熒光技術(shù) 細(xì)胞處理同上。將單純放療組、聯(lián)合組細(xì)胞分別在照射后1 h、6 h、12 h和24 h收集細(xì)胞，-20 ℃保存?zhèn)溆?。全部?xì)胞收集好后加3% H2O2室溫孵育30 min，PBS振蕩洗滌，多聚甲醛固定20 min，PBS振蕩洗滌；0.5% Triton破膜，PBS振蕩洗滌；滴加正常山羊血清封閉液，室溫放置60 min；滴加適當(dāng)稀釋的兔抗人單克隆抗體，空白對(duì)照不加 I 抗，用PBS代替，室溫放置2 h，PBS振蕩洗滌；避光加入DAPI稀釋的熒光 II 抗，37 ℃溫箱、濕盒孵育60 min。PBS振蕩洗滌，水溶性封片劑封片，激光共聚焦顯微鏡調(diào)至油鏡下觀察。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用重復(fù)測(cè)量定量資料的方差分析，組間兩兩比較采用Bonferroni法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 阿帕替尼聯(lián)合X線照射對(duì)SGC-7901細(xì)胞活力的影響

與阿帕替尼組或單純放療組相比，聯(lián)合組顯著降低SGC-7901細(xì)胞活力，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。Western blot法檢測(cè)進(jìn)一步證實(shí)，與單純放療組或阿帕替尼組相比，聯(lián)合組增殖相關(guān)蛋白p-PLCγ1和p-ERK1/2表達(dá)顯著下降，見(jiàn)圖1。

Figure 1.Apatinib and X-ray synergistically inhibited SGC-7901 cell viability. A:Avalues detected by CCK-8 assay; B: the protein levels of p-PLCγ1 and p-ERK1/2 determined by Western blot analysis. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsIR group;##P<0.01vsapatinib group.

圖1 阿帕替尼聯(lián)合X線照射協(xié)同抑制SGC-7901細(xì)胞活力

2 阿帕替尼聯(lián)合X線照射對(duì)SGC-7901細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示，對(duì)照組細(xì)胞的凋亡比例為4.081%，阿帕替尼組的細(xì)胞凋亡比例為10.42%，單純放療組的細(xì)胞凋亡比例為16.19%，聯(lián)合組的細(xì)胞凋亡比例為27.49%。阿帕替尼組與單純放療組的細(xì)胞凋亡比例均高于對(duì)照組，而聯(lián)合組的細(xì)胞凋亡比例明顯高于阿帕替尼組與單純放療組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。聯(lián)合組凋亡相關(guān)蛋白PARP、cleaved caspase-9和cleaved caspase-3表達(dá)水平上調(diào)，Bcl-2表達(dá)下降，見(jiàn)圖2。

3 阿帕替尼聯(lián)合X線照射對(duì)SGC-7901細(xì)胞中γ-H2AX表達(dá)的影響

我們前期研究發(fā)現(xiàn)，VEGF通路關(guān)鍵蛋白在SGC-7901胃癌細(xì)胞株中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)。應(yīng)用10 Gy電離輻射劑量照射單純放療組與聯(lián)合組SGC-7901細(xì)胞株，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2組1 h時(shí)均可見(jiàn)γ-H2AX核內(nèi)焦點(diǎn)出現(xiàn)。單純放療組隨后核內(nèi)焦點(diǎn)逐漸減少，12 h時(shí)接近照射前水平。而聯(lián)合組核內(nèi)焦點(diǎn)淬滅延遲，24 h未恢復(fù)照射前水平，見(jiàn)圖3，表明聯(lián)合組雙鏈斷裂(double-strand breaks，DSBs)修復(fù)過(guò)程被干擾。

4 阿帕替尼聯(lián)合X線照射對(duì)SGC-7901細(xì)胞細(xì)胞周期影響

流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示，對(duì)照組的G2期細(xì)胞比例為7.08%，阿帕替尼組的G2期細(xì)胞比例為12.13%，單純放療組的G2期細(xì)胞比例為23.49%，聯(lián)合組的G2期SGC-7901細(xì)胞比例升高，為40.16%。與阿帕替尼組或單純放療組對(duì)比，聯(lián)合組阻滯于G2期的細(xì)胞比例顯著增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)圖4。

討 論

胃癌根除術(shù)成功的患者因局部復(fù)發(fā)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)高，5年生存率依然很低，放療可明顯減少淋巴引流區(qū)域復(fù)發(fā)，提高術(shù)后3年生存率和5年生存率[6-7]。對(duì)無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(M0)的IV期胃癌患者實(shí)施放療可以降低腫瘤分期、減小瘤體，從而降低手術(shù)難度、增加胃癌根除術(shù)的成功率。而伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(M1)的IV期胃癌患者，放療可緩解或治療出血、狹窄、疼痛等癥狀[8]。對(duì)于初期或手術(shù)后的病人，放療是一種良好的局部區(qū)域控制治療。但一部分胃癌患者會(huì)發(fā)生放療抵抗，導(dǎo)致放療療效不佳。胃周圍重要器官對(duì)放射線的耐受性限制了射線劑量的提高，因此尋找可增強(qiáng)胃癌的放療敏感性的藥物或手段，對(duì)于胃癌的治療有重要意義。

X射線用于腫瘤治療的原理是其能夠誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂[9]。DSBs修復(fù)缺陷的細(xì)胞對(duì)放射線敏感性增加，DSBs修復(fù)蛋白高表達(dá)的細(xì)胞對(duì)射線耐受[10-11]。熒光標(biāo)記的磷酸化組蛋白H2AX(γ-H2AX)是識(shí)別細(xì)胞內(nèi)DSBs的有效標(biāo)記物，細(xì)胞內(nèi)殘留γ-H2AX焦點(diǎn)數(shù)量代表了細(xì)胞對(duì)DSBs的修復(fù)能力，與細(xì)胞放射敏感性有密切關(guān)系[12]。研究顯示，抑制VEGF信號(hào)通路可能減緩腫瘤細(xì)胞DSBs修復(fù)過(guò)程而增敏放療[13]。在本研究中，與單純放療組相比，聯(lián)合組細(xì)胞核內(nèi)γ-H2AX熒光淬滅時(shí)間延遲，提示DSBs修復(fù)過(guò)程被干擾。其機(jī)制可能是放療誘導(dǎo)DSBs形成，而阿帕替尼通過(guò)抑制VEGF信號(hào)通路來(lái)干擾DSBs修復(fù)，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖，實(shí)現(xiàn)增敏放療。

Figure 2.Combination of apatinib and X-ray induced SGC-7901 cell apoptosis. A: the apoptotic rate determined by flow cytometry; B: the protein levels of cell apoptosis biomarkers determined by Western blot analysis. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsIR group;##P<0.01vsapatinib group.

圖2 阿帕替尼聯(lián)合X線照射通過(guò)線粒體途徑誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞凋亡

放療會(huì)誘導(dǎo)VEGF、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2和血小板源性生長(zhǎng)因子等促血管生長(zhǎng)因子的表達(dá)[14]，促進(jìn)腫瘤血管生成，為腫瘤提供營(yíng)養(yǎng)，抑制腫瘤血管生成可顯著增敏放療[15]。VEGF是很多實(shí)體腫瘤都分泌的調(diào)節(jié)血管形成最重要的信號(hào)分子，腫瘤組織中VEGF的高表達(dá)與放療抵抗顯著相關(guān)[4]。VEGFR包括VEGFR1、VEGFR2和VEGFR3[16]。VEGFR2與配體結(jié)合后，比其它受體更顯著地增強(qiáng)激酶的活性，導(dǎo)致血管形成增強(qiáng)，微血管密度增大，血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖增強(qiáng)，與不良臨床預(yù)后更相關(guān)[17]。阿帕替尼靶向抑制VEGFR2的酪氨酸激酶發(fā)揮殺傷腫瘤的作用[5]，可顯著延長(zhǎng)一線或二線化療失敗的晚期胃癌患者的中位生存期與無(wú)進(jìn)展生存期[18]。

目前認(rèn)為細(xì)胞凋亡途徑包括死亡受體通路介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和線粒體途徑介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[19]。有研究顯示，VEGF通路的激活可以抑制細(xì)胞凋亡，并通過(guò)PLC依賴的信號(hào)通路促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖[20-21]，而放療過(guò)程中腫瘤細(xì)胞恢復(fù)增殖、凋亡信號(hào)傳導(dǎo)途徑中斷，是腫瘤對(duì)放射不敏感又一重要機(jī)制[22]。阿帕替尼可通過(guò)阻滯VEGFR2-PLCγ1-ERK1/2信號(hào)通路抑制胃癌細(xì)胞增殖，并減少VEGF的分泌[21]。在整個(gè)細(xì)胞增殖周期中，G2/M期對(duì)放射損傷最為敏感。細(xì)胞周期阻滯于G2期的腫瘤細(xì)胞對(duì)放療敏感性普遍高于阻滯在細(xì)胞周期其它階段的腫瘤細(xì)胞[23]。有報(bào)道阿帕替尼可引起細(xì)胞周期抑制蛋白p21和p27的上調(diào)及cyclin B1和Cdc1的下調(diào)，阻滯細(xì)胞周期于G2/M期[24]。

Figure 3.Detection of γ-H2AX expression by immunofluorescence cytochemistry. The combination group showed a delay of fluorescence quenching.

圖3 免疫熒光觀察阿帕替尼聯(lián)合X射線組γ-H2AX核內(nèi)焦點(diǎn)淬滅延遲

Figure 4.Apatinib combined with X-ray blocked cell cycle in the G2/M phase. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsIR group;##P<0.01vsapatinib group.

圖4 阿帕替尼聯(lián)合X線照射使細(xì)胞周期阻滯于G2/M期

本研究發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于阿帕替尼組或單純放療組，阿帕替尼聯(lián)合X射線可顯著提高SGC-7901細(xì)胞的凋亡比例，上調(diào)凋亡通路的標(biāo)志物PARP、cleaved caspase-9和cleaved caspase-3蛋白水平，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)，提示通過(guò)線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。此外，兩者聯(lián)合可協(xié)同增加對(duì)SGC-7901胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用，顯著下調(diào)增殖相關(guān)蛋白p-PLC和p-ERK1/2的蛋白水平。阿帕替尼聯(lián)合X線照射可使G2期細(xì)胞比例較明顯增加，細(xì)胞周期阻滯于G2期，抑制腫瘤增殖，提高腫瘤細(xì)胞的放射敏感性。

基于本研究的初步探索，認(rèn)為阿帕替尼可通過(guò)與VEGFR2結(jié)合，靶向阻斷VEGF通路，從而抑制DSBs修復(fù)，降低放療誘導(dǎo)的腫瘤血管形成效應(yīng)，增加阻滯在G2期的胃癌細(xì)胞數(shù)目，抑制腫瘤增殖，誘導(dǎo)腫瘤凋亡，從而影響腫瘤組織對(duì)射線的敏感性，增強(qiáng)胃癌放療的效應(yīng)，可為臨床胃癌實(shí)施放療時(shí)用阿帕替尼增敏放療提供理論依據(jù)。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅 森)

Apatinib increases radiosensitivity of gastric cancer by inhibiting VEGF pathway

LI Tong, ZHAI Er-tao, XU Li-xia, HUANG Lin-lin, PENG Sui, ZENG Zhi-rong

(DepartmentofGastroenterology,TheFirstAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China.E-mail:zengzhirong@vip.163.com)

AIM: To investigate radiosensitization effect of apatinib, a vascular endothelial growth factor (VEGF) receptor2 tyrosine kinase inhibitor, on human gastric carcinoma cell line SGC-7901 and its mechanism. METHODS: SGC-7901 cells were divided into control group, apatinib group, radiotherapy group and combination group. The cell viability was measured by CCK-8 assay. The changes of cell apoptosis and cell cycle were analyzed by flow cytometry. The protein levels of cell apoptosis biomarkers, such as PARP, cleaved caspase-9, cleaved caspase-3 and Bcl-2, and cell proliferation biomarkers, p-PLCγ1 and p-ERK1/2, were detected by Western blot. γ-H2AX expression was detected by immunofluorescence.RESULTS: Compared with apatinib group and radiation group, the cell viability was inhibited after treatment with both apatinib and X-ray (P<0.01). The protein levels of cell proliferation markers p-PLCγ1 and p-ERK1/2 were down-regulated. The cell apoptosis was enhanced (P<0.01). The protein levels of cell apoptosis makers such as PARP, cleaved caspase-9 and cleaved caspase-3 were up-regulated, while Bcl-2 was down-regulated. The disappearance of γ-H2AX foci in the nucleus was delayed, indicating that apatinib impaired the repair of radiation-induced DNA double-strand breaks. The proportion of G2phase was significantly increased (P<0.01). The combination treatment had more significant effect on SGC-7901 cells than treating with apatinib or radiotherapy alone. CONCLUSION: Apatinib increases the radiosensitivity of gastric cancer cells via blocking VEGF pathway.

Gastric carcinoma; Radiotherapy; Apatinib; Vascular endothelial growth factor

1000- 4718(2017)05- 0776- 06

2017- 01- 03

2017- 04- 06

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81502079)； 廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(No. 201607010074)

R730.23； R735.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.05.002

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△通訊作者 Tel: 020-87332200-8283; E-mail: zengzhirong@vip.163.com