李杰，羅建成，李慧星，王瑩

（南陽理工學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，河南南陽473004）

響應(yīng)面分析法優(yōu)化西瓜番茄紅素提取工藝條件

李杰，羅建成，李慧星，王瑩

（南陽理工學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，河南南陽473004）

為確定西瓜番茄紅素最佳提取工藝條件，綜合運(yùn)用單因素試驗(yàn)、析因試驗(yàn)、最陡爬坡試驗(yàn)及響應(yīng)面分析試驗(yàn)對(duì)西瓜番茄紅素提取工藝條件進(jìn)行了深入研究。結(jié)果表明，提取溫度和料液比是影響西瓜番茄紅素得率的顯著性因子，西瓜番茄紅素最佳提取工藝條件為：提取溫度45℃，料液比1∶18（g/mL），提取時(shí)間75 min，提取次數(shù)3次。此條件下，西瓜番茄紅素得率可達(dá)2.7409mg/g。

西瓜番茄紅素；提取工藝；響應(yīng)面

番茄紅素（lycopene）是一種脂溶性的類胡蘿卜素，主要存在于番茄、西瓜、紅色葡萄柚、南瓜、木瓜和粉紅色番石榴等常見的水果及蔬菜中[1]。番茄紅素有較強(qiáng)的抗氧化性，具有防治肺癌、子宮癌、乳腺癌、前列腺癌等作用，還具有提高免疫力、預(yù)防心腦血管疾病、延緩衰老等功效，因此番茄紅素也被稱為“植物黃金”[2-4]；另一方面番茄紅素也是集營養(yǎng)與著色雙重作用于一身的工業(yè)添加劑，廣泛應(yīng)用于食品添加劑、醫(yī)藥和化妝品等領(lǐng)域[5]。響應(yīng)面法（RSM）是以數(shù)學(xué)模型為工具，描述響應(yīng)值與考察因素之間相互關(guān)系的一種數(shù)據(jù)分析處理方法。由于采用科學(xué)合理的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，響應(yīng)面分析法能夠以最經(jīng)濟(jì)的方式對(duì)考察因素進(jìn)行全面分析和研究，并快速有效地確定多因素系統(tǒng)的最佳條件，廣泛應(yīng)用于生物化工等過程的優(yōu)化[6-8]。本文在單因素試驗(yàn)、析因試驗(yàn)、最陡爬坡試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，結(jié)合響應(yīng)面分析法對(duì)西瓜番茄紅素提取工藝條件進(jìn)行了深入研究，以期為西瓜中番茄紅素的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 原料

西瓜：購自萬德隆超市，去除瓜皮后取瓤、除籽，將除籽后的瓤切成小塊，分別置于研缽中研磨，研磨均勻后抽濾除汁，抽濾后的果肉置于潔凈的燒杯中，加入適量甲醇避光靜置2 h后，進(jìn)行抽濾脫水，將抽濾脫水后的果肉攤平，置于40℃條件下，烘干備用。

1.2 試劑

乙酸乙酯：無錫市亞太聯(lián)合化工有限公司；石油醚：南京化學(xué)試劑股份有限公司；丙酮、正己烷：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氯仿：科密歐化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇：天津市北辰方正試劑廠，所用試劑均為分析純。

1.3 主要儀器及設(shè)備

DHG-9070A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；YP10KN電子天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司；UV7502PC紫外可見分光光度計(jì)：上海欣茂儀器有限公司；SHZ-82水浴恒溫振蕩器：常州國華電器有限公司；TGL-16C高速臺(tái)式離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；SHB-III型循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長城科工貿(mào)有限公司。

2 方法

2.1 西瓜番茄紅素提取工藝路線

西瓜果肉粉→丙酮浸提→離心→上清液→過濾→濾液低溫干燥→西瓜番茄紅素

2.2 最大吸收波長的確定

用電子天平稱取2.0 g經(jīng)預(yù)處理的西瓜果肉粉，加入30 mL丙酮，置于45℃恒溫水浴鍋中震蕩浸提60 min，離心機(jī)離心，取上清液過濾即得浸提液，將浸提液適當(dāng)稀釋，用分光光度計(jì)測(cè)定浸提液在不同波長下的吸光度。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

由于番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品價(jià)格昂貴，且見光易分解，而蘇丹紅I與番茄紅素有類似的特征吸收峰，故用蘇丹紅I代替番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[9]。精密稱取蘇丹紅I 1.000 0 g（因純的番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品極不穩(wěn)定，同時(shí)其最大吸收波長接近于蘇丹紅I，且蘇丹紅I比較穩(wěn)定，因此可用它來代替番茄紅素制作標(biāo)準(zhǔn)曲線），用無水乙醇溶解后，定溶至1 000 mL。用移液管移取不同量的蘇丹紅I色素溶液，分別配置成濃度為1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。在501 nm下測(cè)定其吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.4 單因素試驗(yàn)

對(duì)西瓜番茄紅素得率有影響的因素有提取劑種類、提取溫度、料液比、提取時(shí)間、提取次數(shù)等，分別進(jìn)行單因素試驗(yàn)以考察其對(duì)西瓜番茄紅素得率的影響。

2.5 析因試驗(yàn)設(shè)計(jì)[10]

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選用N＝16的析因試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)提取溫度χ1、料液比χ2、提取時(shí)間χ3和提取次數(shù)χ4進(jìn)行考察，每個(gè)因素取-1和1兩個(gè)水平，以西瓜番茄紅素得率Y測(cè)為試驗(yàn)指標(biāo)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1 析因試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 The factorial experiment design

2.6 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)[11]

選取對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)影響顯著的因素χ1和χ2進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)，因素χ1和χ2對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)有正效應(yīng)，需增大；因素χ3和χ4對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)雖有正效應(yīng)，但影響不顯著，可將χ3和χ4固定在1水平，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表2。

表2 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 2 The steepest ascent experiment design

2.7 響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果，采用Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[12]，對(duì)提取溫度和料液比進(jìn)行中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，因子編碼值分別為X1、X2（其中X1=（χ1-46）/3，X2=（χ2-19）/3），響應(yīng)值為西瓜番茄紅素得率Y測(cè)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表3。

表3 響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 3 The response surface experimental design

2.8 西瓜番茄紅素得率計(jì)算公式

式中：Y測(cè)為西瓜番茄紅素的得率，mg/g；V為西瓜番茄紅素浸提液的體積，mL；C為西瓜番茄紅素浸提液稀釋后的濃度，μg/mL；N為稀釋倍數(shù)；M為浸提所用西瓜果肉原料質(zhì)量，g。

3 結(jié)果與討論

3.1 最大吸收波長的確定

不同波長下西瓜番茄紅素浸提液的吸光值見圖1。

圖1 不同波長下西瓜番茄紅素浸提液的吸光值Fig.1 The absorbance of watermelon lycopene leach liquor on different wavelength

由圖1可知，西瓜番茄紅素浸提液在442、472、501nm各有一個(gè)吸收峰，但由于在442nm及472nm時(shí)，浸提液中番茄紅素的類似物β-胡蘿卜素也有較強(qiáng)吸收峰，對(duì)測(cè)定結(jié)果干擾較大，而在501 nm時(shí)β-胡蘿卜素的吸收很小，可消除對(duì)番茄紅素測(cè)定結(jié)果的干擾[13]，故選擇501 nm作為西瓜番茄紅素提取的檢測(cè)波長。

3.2 西瓜番茄紅素對(duì)照品蘇丹紅I標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

對(duì)照品蘇丹紅I標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。

圖2 對(duì)照品蘇丹紅I標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of tony red I reference substance

圖2為對(duì)西瓜番茄紅素對(duì)照品蘇丹紅I標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程為Y=0.083 7X-0.005 4，R=0.999 7。

3.3 單因素試驗(yàn)結(jié)果

3.3.1 不同提取劑對(duì)西瓜番茄紅素得率的影響

不同提取劑對(duì)西瓜番茄紅素得率的影響見圖3。

圖3 不同提取劑對(duì)西瓜番茄紅素得率的影響Fig.3 The effect of different extracting solvent on the yield of watermelon lycopene

由圖3可知，使用乙酸乙酯、石油醚、正己烷作為提取劑時(shí)，西瓜番茄紅素提取效果較好，其次是丙酮、氯仿，用無水乙醇作為提取劑時(shí)，提取效果較差。由于使用乙酸乙酯、石油醚、正己烷作為提取劑，在浸提過程中有不同程度的結(jié)團(tuán)現(xiàn)象，使用丙酮作為提取劑未出現(xiàn)結(jié)團(tuán)現(xiàn)象，故選擇丙酮作為提取劑。

3.3.2 提取溫度對(duì)西瓜番茄紅素得率的影響

提取溫度對(duì)西瓜番茄紅素得率的影響見圖4。

圖4 提取溫度對(duì)西瓜番茄紅素得率的影響Fig.4 The effect of extracting temperature on the yield of watermelon lycopene

由圖4可知，溫度低于40℃時(shí)，隨著溫度升高，分子運(yùn)動(dòng)逐漸劇烈，西瓜番茄紅素的擴(kuò)散速率增大，在丙酮中的溶解度增大，西瓜番茄紅素得率逐漸增大，但高于40℃時(shí)，由于西瓜番茄紅素受熱不穩(wěn)定，當(dāng)溫度過高達(dá)到55℃時(shí)，丙酮揮發(fā)很快，損失較大，得率急劇下降。

3.3.3 料液比對(duì)西瓜番茄紅素得率的影響

料液比對(duì)西瓜番茄紅素得率的影響見圖5。

由圖5可知，隨料液比增大，可能經(jīng)預(yù)處理的西瓜粉原料在提取劑中分布更均勻，西瓜番茄紅素得率逐漸增大，但當(dāng)提取劑用量大于30 mL后，提取劑對(duì)溶質(zhì)而言，分布空間已足夠大，故隨提取劑用量增大，對(duì)西瓜番茄紅素得率影響不大。

圖5 料液比對(duì)西瓜番茄紅素得率的影響Fig.5 The effect of solid-liquid ratio on the yield of watermelon lycopene

3.3.4 提取時(shí)間對(duì)西瓜番茄紅素得率的影響

提取時(shí)間對(duì)西瓜番茄紅素得率的影響見圖6。

圖6 提取時(shí)間對(duì)西瓜番茄紅素得率的影響Fig.6 The effect of extracting time on the yield of watermelon lycopene

由圖6可知，隨著提取時(shí)間的延長，西瓜番茄紅素得率逐漸增大，但高于75 min后，可能西瓜番茄紅素提取傳質(zhì)逐漸達(dá)到平衡，也可能由于提取時(shí)間過長，提取劑揮發(fā)，西瓜番茄紅素得率降低。

3.3.5 提取次數(shù)對(duì)西瓜番茄紅素得率的影響

提取次數(shù)對(duì)西瓜番茄紅素得率的影響見圖7。

圖7 提取次數(shù)對(duì)西瓜番茄紅素得率的影響Fig.7 The effect of extracting times on the yield of watermelon lycopene

由圖7可知，隨提取次數(shù)的增加西瓜番茄紅素的得率逐漸升高，提取1次與提取2次的得率相差較大，提取2次與提取3次的得率相差不大。

3.4 析因試驗(yàn)結(jié)果

析因試驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4 析因試驗(yàn)結(jié)果Table 4 The results of factorial experiments

析因試驗(yàn)結(jié)果見表4，析因試驗(yàn)分析結(jié)果見表5。

表5 析因試驗(yàn)結(jié)果分析Table 5 The results of factorial experiment analysis

由表5可知，因素χ1、χ2、χ3、χ4對(duì)西瓜番茄紅素得率均具有正效應(yīng)，其中因素χ1和χ2影響顯著，因素χ3和χ4影響不顯著。由于析因試驗(yàn)只能分析各因素對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)影響的顯著性，不能確定最佳點(diǎn)所在的區(qū)域，利用響應(yīng)面分析法進(jìn)行回歸擬合，只有在最佳點(diǎn)附近才能充分近似真實(shí)情形，因此，需要根據(jù)各因素對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)影響的差異情況，進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)確定最佳點(diǎn)[14]。析因試驗(yàn)結(jié)果分析見表5。

3.5 最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果

最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果見表6。

從表6可知，隨著爬坡試驗(yàn)的進(jìn)行，在3號(hào)試驗(yàn)處達(dá)最高點(diǎn)，該點(diǎn)對(duì)應(yīng)的試驗(yàn)條件為提取溫度46℃，料液比為1∶19（g/mL），提取時(shí)間75 min，提取次數(shù)3次，此時(shí)西瓜番茄紅素的得率接近最佳點(diǎn)，可以選擇這一點(diǎn)作為響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)的中心點(diǎn)。

表6 最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果Table 6 The results of steepest ascent experiments

3.6 響應(yīng)面分析試驗(yàn)結(jié)果

響應(yīng)面分析試驗(yàn)結(jié)果見表7，回歸分析結(jié)果見表8，方差分析結(jié)果見表9。

表7 響應(yīng)面分析試驗(yàn)結(jié)果Table 7 The results of response surface methodology experiments

表8 回歸分析結(jié)果Table 8 The results of regression analysis

表9 方差分析結(jié)果Table 9 The results of variance analysis

對(duì)表7的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析，得到以西瓜番茄紅素得率Y為因變量，以X1、X2為自變量的回歸方程如下：

由表9回歸方程的方差分析結(jié)果可知，Pr= 0.000 249＜0.05，所以方程的回歸顯著，失擬不顯著，可利用回歸方程擬合試驗(yàn)數(shù)據(jù)，對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

根據(jù)回歸方程，利用MATLAB軟件繪制X1、X2對(duì)西瓜番茄紅素得率Y的響應(yīng)曲面圖及等高線圖，見圖8。

圖8 響應(yīng)面分析立體圖（X1，X2）和對(duì)應(yīng)等高線圖Fig.8 Response surface and corresponding contour plot（X1，X2）

由表8、圖8可知：提取溫度和料液比與西瓜番茄紅素得率有顯著的相關(guān)性，料液比對(duì)西瓜番茄紅素得率的影響更為顯著，提取溫度和料液比的交互作用對(duì)西瓜番茄紅素得率的影響不顯著。

為了獲得西瓜番茄紅素最佳的提取條件，將回歸方程分別對(duì)自變量X1及X2求一階偏導(dǎo)并令其等0，得二元一次方程組，求解方程組，得出回歸模型的極值點(diǎn)為：X1=－0.225 0，X2=－0.243 6，對(duì)應(yīng)的實(shí)際值為提取溫度45.325℃，料液比為1∶18.269 2，此時(shí)西瓜番茄紅素最大得率為Y=2.713 3 mg/g。

驗(yàn)證試驗(yàn)：結(jié)合實(shí)際操作情況，將西瓜番茄紅素提取最佳條件適當(dāng)修正為：提取溫度45℃，料液比1∶18（g/mL），提取時(shí)間75 min，提取次數(shù)3次；根據(jù)修正的條件進(jìn)行3次提取試驗(yàn)，結(jié)果取平均值，西瓜番茄紅素得率為2.740 9 mg/g，與理論預(yù)測(cè)值相差不大。

4 結(jié)論

通過試驗(yàn)證明，析因試驗(yàn)可確定對(duì)西瓜番茄紅素提取影響顯著的因素，最陡爬坡試驗(yàn)可充分逼近最大響應(yīng)區(qū)域，對(duì)響應(yīng)面分析試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，可建立顯著因素與西瓜番茄紅素得率關(guān)系的回歸方程，通過對(duì)回歸方程進(jìn)行方差分析及顯著性檢驗(yàn)，利用回歸方程可模擬真實(shí)的試驗(yàn)過程，可對(duì)最優(yōu)提取條件進(jìn)行預(yù)測(cè)，通過對(duì)理論預(yù)測(cè)最優(yōu)條件適當(dāng)修正，可確定實(shí)際操作情況下西瓜番茄紅素提取的最佳工藝條件。

通過綜合運(yùn)用單因素試驗(yàn)、析因試驗(yàn)、最陡爬坡試驗(yàn)及響應(yīng)面分析試驗(yàn)，確定利用丙酮提取西瓜番茄紅素最佳工藝條件為：提取溫度45℃，液料比1∶18（g/ mL），提取時(shí)間75 min，提取次數(shù)3次。在此條件下，西瓜番茄紅素得率可達(dá)2.740 9 mg/g，此工藝條件在實(shí)際應(yīng)用中有一定的參考價(jià)值。

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Optimization of the Extraction Process Conditions of Watermelon Lycopene by Response Surface Methodology

LI Jie，LUO Jian-cheng，LI Hui-xing，WANG Ying
（College of Biological and Chemical Engineering of Nanyang Institute of Technology，Nanyang 473004，Henan，China）

The extraction process conditions of watermelon lycopene were deeply studied through single factor experiment，factorial experiment，the steepest ascent experiment and response surface analysis experiment in order to determine the optimum extraction process conditions of watermelon lycopene.The results showed that the extraction temperature and solid-liquid ratio were significant factors which have effect on the yield of watermelon lycopene.The optimum extraction process conditions of watermelon lycopene were：extraction temperature 45℃，solid-liquid ratio 1∶18（g/mL），extraction time 75 minutes，extraction times 3.The yield of watermelon lycopene could reach 2.740 9 mg/g under these conditions.

watermelon lycopene；extraction process；response surface methodology

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.10.012

2016-08-19

李杰（1978—），男（漢），講師，碩士，主要從事植物中天然生物活性成分的分離和應(yīng)用研究。