趙彥 李凡 郭琳潔 代江兵 邢淑 王麗華

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基于核定位序列-DNA四面體復(fù)合納米結(jié)構(gòu)的細(xì)胞核成像研究

趙彥1,2李凡1,2郭琳潔1代江兵1,2邢淑1,2王麗華1

1（中國科學(xué)院上海應(yīng)用物理研究所物理生物學(xué)研究室中國科學(xué)院界面物理與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室嘉定園區(qū) 上海 201800） 2（中國科學(xué)院大學(xué) 北京 100049）

基因治療的關(guān)鍵是如何高效轉(zhuǎn)運(yùn)基因進(jìn)入細(xì)胞核并發(fā)揮作用，實(shí)時(shí)觀察脫氧核糖核酸(Deoxyribonucleic acid, DNA)在細(xì)胞核中的分布對(duì)于了解基因治療的效果非常重要。其中，載體的安全性、運(yùn)輸效率等是基因治療的關(guān)鍵影響因素。本工作構(gòu)建了核定位序列(Nuclear Localization Signal, NLS)與DNA四面體的復(fù)合結(jié)構(gòu)，提高了細(xì)胞核攝取DNA四面體的效率。利用“點(diǎn)擊”化學(xué)反應(yīng)將NLS與DNA四面體進(jìn)行共價(jià)連接，解決了簡單混合帶來的穩(wěn)定性差等問題。進(jìn)一步研究了不同長度和等電點(diǎn)的NLS序列在與DNA四面體連接時(shí)的效率，發(fā)現(xiàn)與經(jīng)典的NLS12相比，等電點(diǎn)為4.84的NLS29與DNA的非特異性結(jié)合顯著降低，連接反應(yīng)的效率從37.3%提高到72.3%。經(jīng)高效液相色譜(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)分離純化后的NLS12-DNA和NLS29-DNA均可以靶向細(xì)胞核，說明改變NLS的長度和等電點(diǎn)后仍保持了很好的活性。該研究改善了正電NLS與負(fù)電DNA之間由于非特異性結(jié)合容易形成沉淀的問題，為臨床基因治療奠定了基礎(chǔ)。

細(xì)胞核，核定位序列，DNA四面體，“點(diǎn)擊”化學(xué)

基因治療是癌癥[1?2]和心臟衰竭[3]等多種疾病的重要治療手段之一，如何提高基因藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)效率和體內(nèi)穩(wěn)定性是當(dāng)前藥物研發(fā)的重點(diǎn)?；蛩幬镏械暮怂釒в休^強(qiáng)負(fù)電性，難以自由進(jìn)入細(xì)胞，并且核酸類藥物的靶向位點(diǎn)在細(xì)胞核，從而發(fā)揮干擾基因復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的作用[4]。因此選擇高效率、高安全性的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)載體對(duì)于基因治療至關(guān)重要。非病毒載體如陽離子脂質(zhì)體和聚合物被認(rèn)為比病毒載體具有更高的安全性[5]。其中，陽離子脂質(zhì)體因其毒性和免疫原性低、無組織特異性[6]和較強(qiáng)的滲透和滯留效應(yīng)(Enhanced Permeability and Retention effect, EPR)[7]被認(rèn)為是較好的選擇。然而基因轉(zhuǎn)運(yùn)效率低仍是這類載體的主要缺陷[8]。

脫氧核糖核酸(Deoxyribonucleic acid, DNA)納米結(jié)構(gòu)是一類由外源DNA經(jīng)堿基互補(bǔ)配對(duì)構(gòu)成的立體結(jié)構(gòu)，具有很高的安全性、結(jié)構(gòu)精確可控、較高的化學(xué)反應(yīng)活性、載體容量大、可尋址性等特點(diǎn)[9]，在生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)、信息等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[10]。科學(xué)家已經(jīng)利用DNA納米結(jié)構(gòu)載帶各種藥物進(jìn)入細(xì)胞和活體，例如小分子藥物（阿霉素）[11]、功能核酸(CpG)[12]、siRNA[13]和適配體[14]、蛋白類藥物（疫苗）[15]和轉(zhuǎn)錄活化蛋白[16]等均展現(xiàn)出了很高的轉(zhuǎn)運(yùn)效率。且DNA納米結(jié)構(gòu)產(chǎn)率高易純化[17]，在生理?xiàng)l件下保持較高的穩(wěn)定性，具有極高的生物相容性[18]和較高的荷載效率[19]，因此展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。研究發(fā)現(xiàn)DNA納米結(jié)構(gòu)主要通過內(nèi)吞途徑進(jìn)入細(xì)胞，然而目前尚未有研究表明DNA納米結(jié)構(gòu)可以穿透核孔，不能將藥物轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞核成為制約其發(fā)揮作用的一大因素。

利用核定位序列(Nuclear Localization Signal, NLS)來引導(dǎo)外源材料進(jìn)入細(xì)胞核是常用的手段，它通過與核孔復(fù)合體作用來引導(dǎo)進(jìn)核。NLS的核心序列是一段長度為7個(gè)氨基酸、來源于病毒SV-40大T抗原的堿性多肽——PKKKR KV[20]，它能介導(dǎo)親核蛋白與輸入蛋白α/β形成三元復(fù)合物，在GTP酶Ran的輔助下穿過核孔。目前常用的序列是CGYGP KKKRK VGG[4]、CGGGP KKKRK VGG[21]、PKKKR KVEDP YC[22]。前期研究發(fā)現(xiàn)NLS可以載帶單鏈DNA進(jìn)入細(xì)胞核[22]。然而在大多數(shù)利用NLS引導(dǎo)的基因治療中，主要是帶正電荷的NLS與帶負(fù)電荷的DNA簡單混合后形成復(fù)合體，直接應(yīng)用于細(xì)胞和活體，存在著穩(wěn)定性不夠、DNA容易脫離NLS而難以順利到達(dá)細(xì)胞核的情況，影響了基因治療的效果。

本工作擬采用共價(jià)連接方式，將DNA四面體結(jié)構(gòu)與NLS通過“點(diǎn)擊化學(xué)”反應(yīng)連接在一起，提高穩(wěn)定性。同時(shí)選擇不同長度和不同等電點(diǎn)的NLS序列，包括長度為12個(gè)氨基酸、等電點(diǎn)為10.48以及長度為29個(gè)氨基酸、等電點(diǎn)為4.84的序列，探索降低非特異性結(jié)合和提高連接產(chǎn)率的方法。進(jìn)一步驗(yàn)證不同NLS-DNA四面體的結(jié)合活性，并用于細(xì)胞核的靶向成像。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

本實(shí)驗(yàn)所用NLS和DNA四面體序列分別見表1和2，其中未修飾DNA序列和NLS序列均購自生工生物（中國）；疊氮化及Alexa-488熒光修飾DNA序列購自Takara（中國）；硫酸銅、抗壞血酸、二甲基亞砜、三乙基碳酸氫銨緩沖液購自Sigma- Aldrich公司（美國）；Hela細(xì)胞購自上海生命科學(xué)研究所；DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium)培養(yǎng)基購自英濰捷基（中國）；其他試劑購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司（中國）；C18色譜柱購自Waters公司（美國），型號(hào)為XBridgeTMC18 4.6×150 mm。實(shí)驗(yàn)用水為Milli Q水，18 MΩ?cm。

紫外-可見分光光度計(jì)（Hitachi U-3010，日本）；PCR儀（Applied Biosystems Veriti 96 well Thermo Cycler，美國）；聚丙烯酰胺(Polyacrylamide Gel Electrophoresis, PAGE)凝膠電泳儀（DYY-6C型，中國）；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Syngene G:Box Chemi-XL，英國）；高效液相色譜(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)系統(tǒng)：Waters 1525泵（美國）、Waters 2998光電二極管陣列檢測(cè)器（美國）；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Syngene G:Box Chemi-XL，英國）；激光共聚焦顯微鏡（Leica SP8，德國）。

表1 不同NLS序列

表2 DNA四面體序列及修飾

1.2 實(shí)驗(yàn)過程

1.2.1 單鏈DNA與NLS的共價(jià)連接

將疊氮化修飾的DNA單鏈S3-N3 (200 μmol?L?1，10 μL)與炔基修飾的NLS (200 μmol?L?1，20 μL)混合，隨后加入10 μL二甲基亞砜，硫酸銅溶液(10mmol?L?1，10 μL)和抗壞血酸(10 mmol?L?1，10 μL)，充分混勻后室溫靜置過夜。產(chǎn)物用12%的PAGE凝膠電泳表征，電壓100 V，電泳時(shí)間2 h。計(jì)算連接產(chǎn)率。

產(chǎn)物S3-NLS經(jīng)反相HPLC進(jìn)行純化，流動(dòng)相A為0.1 mol?L?1三乙基碳酸氫銨緩沖液，流動(dòng)相B為乙腈，梯度洗脫方法見表3。260 nm和280 nm波長分別監(jiān)測(cè)DNA和NLS，并收集S3-NLS。

表3 反相HPLC梯度洗脫方案

1.2.2 NLS-DNA四面體復(fù)合物的制備

純化后的S3-NLS經(jīng)重新定量后與S1、S2、S4在TM緩沖液(0.01 mol?L?1Tris，5 mmol?L?1MgCl2，pH 8.0)中等摩爾混勻，各鏈終濃度均為1×10?6mol?L?1。95 °C加熱10 min后迅速降溫至4 °C并維持30 min。合成的四面體用8% PAGE表征，電壓80 V，冰浴電泳2 h。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)及NLS-四面體的細(xì)胞攝取

Hela細(xì)胞37 °C培養(yǎng)在含10%滅活FBS的DMEM培養(yǎng)基中。用于熒光成像的Hela細(xì)胞以每孔8萬孵育在有載玻片的24孔板中。轉(zhuǎn)染前30 min，將原培養(yǎng)基換為無血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)孵育。

設(shè)計(jì)兩組，分別為NLS12-DNA四面體組和NLS29-DNA四面體組。首先，每組各取50 μL opti-MEM和5 μL lipofect AMINE混合，37 °C孵育5 min。然后分別加入兩組連接物，使四面體終濃度為100 nmol?L?1，孵育20 min。將兩組與無血清培養(yǎng)基混合后加入24孔板中。轉(zhuǎn)染4 h后固定，用Hochest33258染核并貼片。

1.2.4 共聚焦顯微鏡成像

利用激光共聚焦顯微鏡觀察NLS-DNA四面體的復(fù)合結(jié)構(gòu)進(jìn)入細(xì)胞并靶向細(xì)胞核的情況。Alexa-488標(biāo)記的DNA四面體由488 nm Ar-Kr激光器激發(fā)，Hochest33258染色的細(xì)胞核由405 nm二極管激光器激發(fā)，成像通道分別設(shè)置為500?550 nm和450?500 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 序列的選擇

第一個(gè)NLS是在SV40病毒大T抗原中發(fā)現(xiàn)的PKKKR KV活性序列[23]。目前研究中常用的NLS12序列為保留原活性序列的12個(gè)氨基酸的堿性多肽：GPKKK RKVED PY，等電點(diǎn)(pI)為10.48。NLS12在pH 7.4的溶液環(huán)境中呈正電性(pI>pH)，由于正負(fù)電荷相互作用，極易與帶負(fù)電的DNA發(fā)生非特異性結(jié)合而沉淀，影響進(jìn)一步的共價(jià)連接反應(yīng)。因此設(shè)計(jì)具有活性，且等電點(diǎn)較低的NLS序列對(duì)于改善這一反應(yīng)具有重要意義?？紤]到盡量保持原序列靶向細(xì)胞核的能力，我們選擇從原SV40病毒大T抗原中截取相應(yīng)片段，本著控制等電點(diǎn)小于7且不影響水溶性的原則，保留中間原10個(gè)氨基酸序列，分別在上游延伸13個(gè)、下游延伸6個(gè)，共29個(gè)氨基酸來替代原NLS12序列。經(jīng)測(cè)試該NLS29序列(DDEAT ADSQH STPPK KKRKV EDPKD FPSE)的等電點(diǎn)為4.84，在pH 7.4的緩沖體系中帶負(fù)電荷，可以顯著降低與負(fù)電DNA的非特異性結(jié)合。

2.2 單鏈ssDNA S3-N3與NLS的連接

單鏈ssDNA與NLS的連接是通過“點(diǎn)擊”化學(xué)[24?25]實(shí)現(xiàn)的，反應(yīng)原理見圖1?！包c(diǎn)擊”化學(xué)具有極高反應(yīng)效率和穩(wěn)定性，在制藥、生命科學(xué)中得到廣泛應(yīng)用。ssDNA上的疊氮基與NLS修飾的炔丙基甘氨酸在Cu(I)催化下發(fā)生環(huán)加成反應(yīng)形成咪唑，實(shí)現(xiàn)DNA與NLS的連接。

圖1 “點(diǎn)擊”化學(xué)偶聯(lián)疊氮修飾ssDNA和炔基修飾NLS形成ssDNA-NLS復(fù)合物

NLS12與S3混合后，管底出現(xiàn)沉淀（圖2(a)），而NLS29與S3-N3室溫靜置過夜后溶液清亮，無沉淀產(chǎn)生（圖2(b)）。利用PAGE分別表征兩者的連接效率（圖2(c)），條帶1中NLS12-S3組在上樣孔中有大量的產(chǎn)物聚集，而條帶2的NLS29-S3組則只有非常少的產(chǎn)物滯留在孔內(nèi)。經(jīng)Image J定量分析NLS12-S3的連接效率為37.3%，NLS29-S3的連接效率提高至72.3%。

對(duì)NLS29-S3組進(jìn)行仔細(xì)觀察，分別從反應(yīng)體系的上、中、下三個(gè)位置各取5 μL樣品，用PAGE電泳進(jìn)行表征（圖3(a)）。圖3(a)中M為20個(gè)堿基對(duì)(base pair, bp)的標(biāo)記(marker)；條帶1為S3；條帶2為反應(yīng)體系上部取樣；條帶3為反應(yīng)體系中部取樣；條帶4為反應(yīng)體系下部取樣。其中2、3、4三條泳道條帶亮度基本一致，說明經(jīng)延伸后的NLS29與DNA連接無沉淀現(xiàn)象產(chǎn)生；每泳道都有上下兩條帶，分別為NLS29-S3連接產(chǎn)物（框選出的條帶）和未連接的S3。

圖2 直觀及電泳觀察NLS12和NLS29分別與S3的連接情況 (a) NLS12-S3，(b) NLS29-S3，(c) 12% PAGE表征 NLS-S3的連接效率

利用反相HPLC對(duì)NLS29-S3產(chǎn)物進(jìn)行分離純化。反相色譜法是以非極性載體為固定相，以極性強(qiáng)的溶劑為流動(dòng)相的液相色譜分離模式。反相色譜柱固定相大多是硅膠基團(tuán)鍵合疏水烷基鏈，根據(jù)樣品中不同組分與疏水表面作用強(qiáng)度的不同而分離，因而極性強(qiáng)的組分先出峰。在本實(shí)驗(yàn)中NLS-S3的極性比S3極性強(qiáng)，出峰時(shí)間早（圖3(b)，*標(biāo)記的峰即為產(chǎn)物峰）。

圖3 NLS29-S3的分析與分離 (a) 12% PAGE表征連接結(jié)果，(b) 反相HPLC純化NLS29-S3

2.3 四面體的組裝和穩(wěn)定性分析

純化后的NLS12-S3和NLS29-S3經(jīng)重新定量后，分別與其余三條鏈S1、S2和S4組裝形成NLS12-DNA四面體(Tetrahedron, TH)和NLS29-TH，并用6% PAGE表征（圖4(a)），其中條帶1為未連接NLS的TH，2和3分別代表NLS12-TH和NLS29-TH。結(jié)果表明，四面體均可形成，且產(chǎn)率與未連接NLS的四面體相同，均在50%左右。

對(duì)NLS29-TH在細(xì)胞環(huán)境中的穩(wěn)定性進(jìn)行研究，分別將其與DMEM培養(yǎng)基和Hela細(xì)胞裂解液37 °C孵育0 h、0.5 h、1 h、2 h、6 h、12 h、24 h，6% PAGE表征結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，并用Image J將孵育后的條帶定量分析（圖4(b)）。結(jié)果表明，NLS29-TH在DMEM培養(yǎng)基中6 h后有95.3%的產(chǎn)物穩(wěn)定存在，24 h之內(nèi)有60%左右；在細(xì)胞裂解液中有部分降解，6 h后有75.5%穩(wěn)定存在，24 h后為46.8%。該數(shù)據(jù)說明NLS29-TH可以作為穩(wěn)定的載體用于基因載帶。

圖4 NLS-TH的合成及細(xì)胞環(huán)境穩(wěn)定性表征 (a) 6% PAGE表征NLS-TH的合成，(b) Image J定量NLS29-TH在DMEM培養(yǎng)基和Hela細(xì)胞裂解液的時(shí)間穩(wěn)定性

2.4 NLS-TH在細(xì)胞內(nèi)的分布

研究兩種產(chǎn)物NLS12-TH和NLS29-TH在細(xì)胞內(nèi)的分布情況，其中四面體用Alexa-488標(biāo)記，細(xì)胞核用Hochest進(jìn)行染色，分析二者的共定位情況。共聚焦顯微鏡分別觀察TH、NLS12-TH和NLS29-TH與細(xì)胞孵育之后，進(jìn)入細(xì)胞核的情況。圖5表明單純的TH結(jié)構(gòu)不能進(jìn)入細(xì)胞核，Alexa-488標(biāo)記的TH主要存在于細(xì)胞質(zhì)，無法與細(xì)胞核共定位。而NLS12-TH和NLS29-TH均可以進(jìn)入細(xì)胞核，與Hochest染色的細(xì)胞核能很好的共定位，這說明經(jīng)延伸后的NLS29仍具有很好的靶向細(xì)胞核的能力。

圖5 激光共聚焦顯微鏡對(duì)TH、NLS12-TH、NLS29-TH在Hela細(xì)胞內(nèi)的分布成像

3 結(jié)語

本文旨在發(fā)展以DNA四面體作為基因載帶的有效載體。為解決NLS與DNA之間具有較強(qiáng)靜電吸引容易沉淀的問題，選擇了不同的NLS序列進(jìn)行探索。研究結(jié)果表明，在已有NLS12序列的基礎(chǔ)上進(jìn)行進(jìn)一步延長，改變等電點(diǎn)后，可以顯著降低NLS與DNA之間的靜電相互作用。等電點(diǎn)為4.84的NLS29可以與DNA通過“點(diǎn)擊”化學(xué)反應(yīng)進(jìn)行高效連接，反應(yīng)效率比NLS12顯著提高(72.3%. 37.3%)。經(jīng)HPLC純化和重新定量后，可以很好地形成四面體結(jié)構(gòu)。進(jìn)一步的穩(wěn)定性研究顯示，NLS29-TH具有很好的穩(wěn)定性。在對(duì)細(xì)胞核的成像研究中，NLS29-TH具有很好的靶向細(xì)胞核的能力，與細(xì)胞核的共定位結(jié)果與NLS12-TH相似，遠(yuǎn)高于單純的TH結(jié)構(gòu)。該研究為DNA納米結(jié)構(gòu)作為基因轉(zhuǎn)運(yùn)的載體提供了有效途徑，在生命科學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)中具有極高的潛在應(yīng)用價(jià)值。

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The nuclei imaging of nucleus localization signal-DNA tetrahedron composite nanostructures

ZHAO Yan1,2LI Fan1,2GUO Linjie1DAI Jiangbing1,2XING Shu1,2WANG Lihua1

1(Laboratory of Physical Biology, Shanghai Institute of Applied Physics,Chinese Academy of Sciences, Key Laboratory of Interfacial Physics and Technology,Jiading Campus,Shanghai 201800,China) 2(University of Chinese Academy of Sciences,Beijing 100049,China)

Background: Efficient translocation of nucleic acid drugs into nucleus is a key factor in gene therapy. Therefore, real-time observation of the distribution of deoxyribonucleic acid (DNA) in the nucleus is very important to understand the effect of gene therapy. Beforehand, choosing a safe and efficient carrier for translocating DNA into nucleus is critical. Purpose: This work establishes composite structure of nucleus localization signal (NLS) and DNA tetrahedron, which improving the uptake efficiency of DNA tetrahedron into nucleus. Methods: Covalentlyconnection NLS and DNA tetrahedron with “click” chemistry solved the problems of poor stability after simple mixing. And we further studied the connecting efficiency of different length and isoelectric point NLS with ssDNA. Results: Compared with classical NLS12, NLS29(of which isoelectric point is 4.84) had a low nonspecific binding.The binding efficiency of NLS29was improved to 72.3% from 37.3%.After purification, both NLS12-DNA and NLS29-DNA could target to cell nucleus, thus verifying that they all possessed good activity. Conclusion: This research improved nonspecific binding between positively charged NLS and negatively charged DNA, which laid a foundation for clinical gene therapy.

Cell nucleus, NLS, DNA tetrahedron, “Click” chemistry

TL99

10.11889/j.0253-3219.2017.hjs.40.050501

國家自然科學(xué)基金(No.11575278、No.21675167)資助

趙彥，女，1990年出生，2012年畢業(yè)于山東師范大學(xué)，現(xiàn)為博士研究生，研究領(lǐng)域?yàn)镈NA納米結(jié)構(gòu)的生物學(xué)應(yīng)用

王麗華，E-mail: wanglihua@sinap.ac.cn

2017-02-14，

2017-02-27

Supported by National Natural Science Foundation of China (No.11575278, No.21675167)

ZHAO Yan, female, born in1990, graduated from Shandong Normal University in 2012, doctoral student, focusing on the biological applications of DNA nanostructures

WANG Lihua, E-mail: wanglihua@sinap.ac.cn

2017-02-14, accepted date: 2017-02-27