謝慧 俞菲 李玲瓏 竇豆 文東萍 曹劉

·實驗研究·

臨床鼻-鼻竇表皮葡萄球菌菌株體外細(xì)菌生物膜培養(yǎng)觀察

謝慧 俞菲 李玲瓏 竇豆 文東萍 曹劉

目的 統(tǒng)計優(yōu)勢菌種為表皮葡萄球菌的例數(shù)分別在慢性鼻-鼻竇炎(CRS)患者、健康人中所占比率，對比兩組表皮葡萄球菌體外培養(yǎng)后細(xì)菌生物膜產(chǎn)膜率以及產(chǎn)膜強弱。方法 分組采集在臨床確診為慢性鼻-鼻竇炎患者、健康人中鼻道分泌物，對分泌物送檢進行優(yōu)勢菌種鑒定，將優(yōu)勢菌種為表皮葡萄球菌的菌株分別進行分離、保種；通過剛果紅平板法篩選生物膜陽性菌株和結(jié)晶紫染色法半定量檢測生物膜產(chǎn)膜強弱程度。結(jié)果 共收集39例中鼻道分泌物，其中CRS 20例，健康人19例；剛果紅平板法生物膜陽性菌株有11株，其中CRS 9株，健康人2株；結(jié)晶紫染色法半定量所得結(jié)果與剛果紅所測結(jié)果相同。結(jié)論 表皮葡萄球菌在CRS需氧菌種中所占比率最大，CRS患者表皮葡萄球菌菌株體外培養(yǎng)成膜率明顯高于健康人,CRS患者表皮葡萄球菌臨床菌株體外培養(yǎng)生物膜產(chǎn)膜能力強于健康人。

表皮葡萄球菌; 體外培養(yǎng); 細(xì)菌生物膜; 慢性鼻-鼻竇炎

慢性鼻-鼻竇炎(CRS)是耳鼻喉科最常見慢性疾病之一，2012年美國成人健康數(shù)據(jù)統(tǒng)計報告:全國健康訪問調(diào)查顯示在過去一年中回顧性訪問調(diào)查中顯示患有鼻竇炎的成年患者約占12%[1]。本病的發(fā)病機制尚未完全明確，一般觀點認(rèn)為細(xì)菌感染被認(rèn)為是其中重要的因素之一。CRS的診斷要點之一是病程超過3月，而近些年發(fā)現(xiàn)細(xì)菌生物膜形態(tài)下細(xì)菌的耐抗生素能力是普通細(xì)菌的10到100倍，并逐漸認(rèn)識到細(xì)菌生物膜成為一些疾病遷延成為慢性疾病的主導(dǎo)因素[3-6]。葡萄球菌是造成高發(fā)病率院內(nèi)感染的主要原因之一，而表皮葡萄球菌菌株引起院內(nèi)抗生素耐藥感染[1-2]表皮葡萄球菌在CRS患者鼻腔分泌物細(xì)菌分離鑒定中占13.2%～50.2%，比例均是最高[7-8]。但對于表皮葡萄球菌在CRS患者中細(xì)菌生物膜表達(dá)的研究還相對較少，因此本研究將觀察各類樣本中優(yōu)勢菌種及鼻腔臨床分離株的表皮葡萄球菌產(chǎn)膜率。

1 材料與方法

1.1 材料

治療組：選取成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院門診經(jīng)確證為CRS的患者20例。對照組：成都中醫(yī)藥大學(xué)及附屬醫(yī)院的健康者19例。以無菌棉簽在內(nèi)窺鏡引導(dǎo)下在CRS患者中鼻道處旋轉(zhuǎn)棉簽3周左右沾取分泌物放入裝有無菌轉(zhuǎn)運液的EP管中。(采樣時間：2015年12月1日至2016年11月30日)

1.1.2 菌株

試驗菌株：鼻-鼻竇表皮葡萄球菌臨床分離株，由成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗科微生物室按照常規(guī)方法進行需氧菌培養(yǎng)、分離，通過法國生物梅里埃全自動微生物鑒定系統(tǒng)(型號VITEK?compact)鑒定優(yōu)勢菌并保種，-20℃冰箱保存待用。質(zhì)控菌株：表皮葡萄球菌生物膜表達(dá)陰性株ATCC12228(青島普華科儀商貿(mào)有限公司)。

1.2 主要試劑及設(shè)備

主要試劑：剛果紅(Congo Red)、胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA)、結(jié)晶紫、碘化丙啶(PI)溶液。設(shè)備：各規(guī)格移液器：德國Eppendorf公司、隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱:上海躍進醫(yī)用光學(xué)器械廠、電子秤：日本SHIMADZU公司、酶標(biāo)儀：美國Thermo公司、超凈工作臺：蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司、96孔聚苯乙烯微量培養(yǎng)板：美國COSTAR?公司、細(xì)菌濁度儀：北京天安聯(lián)合科技有限公司、激光共聚焦熒光顯微鏡：尼康映像儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 表皮葡萄球菌產(chǎn)膜能力定性試驗[9]

施工組織設(shè)計是招標(biāo)人考核投標(biāo)人施工技術(shù)水平和管理能力的依據(jù)，也是投標(biāo)人合理報價和中標(biāo)后組織施工管理的基礎(chǔ)。當(dāng)前，招標(biāo)人越來越重視施工組織設(shè)計的評審，以選擇報價合理、技術(shù)水平高、施工方法先進的施工隊伍。因此，投標(biāo)企業(yè)要根據(jù)招標(biāo)文件的要求及現(xiàn)場特點，結(jié)合企業(yè)自身的技術(shù)水平、管理水平、施工經(jīng)驗、技術(shù)裝備等實際情況，認(rèn)真優(yōu)化施工組織設(shè)計，尤其施工方案的優(yōu)化比選，如土方開挖是采用人工開挖還是采用機械開挖，運輸工具采用機動翻斗車還是采用自卸汽車。企業(yè)應(yīng)制定相應(yīng)激勵制度，鼓勵技術(shù)人員不斷創(chuàng)新，優(yōu)化施工方案和施工部署，通過技術(shù)創(chuàng)新、管理創(chuàng)新，降低成本。

(1)試驗菌株的復(fù)溫、復(fù)蘇及復(fù)壯：從-20℃冰箱中取出試驗菌株室溫復(fù)溫，在超凈工作臺中用接種環(huán)將其接種于TSA平板上，置37℃恒溫培養(yǎng)箱中24h后取出(復(fù)蘇)。再次用無菌接種環(huán)挑取一個菌落接種于另一個TSA平板，置恒溫培養(yǎng)箱中37℃孵育24h后取出(復(fù)壯)。(2)剛果紅平板定性PIA+菌株：從復(fù)壯后的平板上挑取一個菌落接種于剛果紅平板上，置37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育24h后取出，室溫放置72h后，肉眼觀察結(jié)果。若菌落黑色、干燥、聚集，并出現(xiàn)結(jié)晶為PIA+菌株；菌落紅色、光滑、無聚集則為PIA-菌株。(3)光鏡下檢驗表皮葡萄球菌：從復(fù)壯后的平板上挑取一個菌落至載玻片，經(jīng)革蘭氏染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。(4)標(biāo)記PIA+菌株。(5)每組試驗獨立重復(fù)三次。

1.3.2 表皮葡萄球菌產(chǎn)膜能力定量試驗[9]

(1)將含有接種表皮葡萄球菌的TSB放入恒溫?fù)u晃培養(yǎng)箱中37℃增菌18h，使用細(xì)菌濁度儀用TSB調(diào)整細(xì)菌濁度至0.5麥?zhǔn)蠁挝?McFarland MCF)。(2)取96孔聚苯乙烯微量培養(yǎng)板，每孔加入100μl培養(yǎng)液，接種10μl菌液，每種菌株做9個孔的重復(fù)。每板設(shè)ATCC12228為陰性對照，空白對照及培養(yǎng)基對照，均做9復(fù)孔。(3)將接種好的96孔板在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h(4)吸出后培養(yǎng)液，加入PBS緩沖液沖洗板孔3次。(5)加入甲醇固定15min，吸出培養(yǎng)孔中的甲醇，風(fēng)干。(6)每孔加入結(jié)晶紫溶液，室溫下染色5min。(7)吸出結(jié)晶紫染色液，流水沖凈多余的染料。(8)培養(yǎng)板倒置除去殘余水，37℃烘箱中烘干。(9)加入冰乙酸溶液，在37°C培養(yǎng)箱中作用30min。(10)用酶標(biāo)儀在590nm波長處分別測定其A值。(11)產(chǎn)膜能力結(jié)果判定：每株試驗菌的 A值為其A590平均值減去空白對照孔A590平均值。標(biāo)準(zhǔn)菌株的A值測量同上操作，以標(biāo)準(zhǔn)菌株A值加上3倍標(biāo)準(zhǔn)差為界定值A(chǔ)c，待測菌株A值大于界定值A(chǔ)c即可判斷為其具有產(chǎn)膜能力。具體標(biāo)準(zhǔn)如下：

①強生物被膜形成株(A>2Ac)；

②弱生物被膜形成株(Ac

③無生物被膜形成株(A≤Ac)。

1.3.3 激光共聚焦觀察體外培養(yǎng)細(xì)菌生物膜

取滅菌后帶蓋玻片的培養(yǎng)皿，分2組，加入15ml待試驗的表皮葡萄球菌PIA+株菌液0.5MCF，置37℃恒溫培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)0.5d、1d、3d、7d，每天更換一次菌液。第1組用于觀察不同時間段體外培養(yǎng)的表皮葡萄球菌生物膜形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化。

2 結(jié)果

2.1 分離需氧優(yōu)勢菌種

臨床共收集實驗組20例鼻分泌物、19例鼻分泌物分別經(jīng)分離培養(yǎng)后需氧優(yōu)勢菌種，總結(jié)見下表：

細(xì)菌種類試驗組(共20例)對照組(共19例)表皮葡萄球菌108金黃色葡萄球菌4—金黃色葡萄球菌+表皮葡萄球菌—1嗜麥芽窄食單胞菌2—人葡萄球菌12耳葡萄球菌11類白喉棒狀桿菌22似腸膜明串珠菌—3沃氏葡萄球菌—1玫瑰色克庫菌—1

2.2 表皮葡萄球菌產(chǎn)膜能力定性試驗

2.2.1 觀察結(jié)果

試驗菌株：

18株表皮葡萄球菌臨床株接種于剛果紅平板，37℃恒溫孵育24h后，肉眼觀察可見大部分菌落呈鮮紅色、暗紅色、深酒紅色、部分呈暗褐色，少數(shù)單個菌落呈黑色，菌落表面光滑、濕潤。菌落形態(tài)與在TSA培養(yǎng)基上大小基本一致，菌落周圍培養(yǎng)基未見明顯褪色。室溫狀態(tài)下放置24h后可見鮮紅色菌落減少，深酒紅色居多，一部分菌落表現(xiàn)為中央黑色或暗褐色，邊緣鮮紅整齊，部分呈暗褐色甚至黑色。深色菌落表面相對淺色菌落干燥，邊緣不光滑，未見明顯結(jié)晶樣物。菌落聚集，周圍培養(yǎng)基明顯褪色。(附圖1)

附圖1

質(zhì)控菌株ATCC12228接種于剛果紅平板，37℃恒溫孵育24h后，肉眼觀察可見菌落呈鮮紅色，菌落表面光滑、濕潤。菌落形態(tài)與在TSA培養(yǎng)基上大小基本一致，菌落周圍培養(yǎng)基無明顯褪色。室溫狀態(tài)下放置24h后見大部分菌落仍呈鮮紅色，一部分菌落表現(xiàn)為中央顏色變深，邊緣鮮紅整齊。菌落濕潤，邊緣光滑。菌落無聚集，周圍培養(yǎng)基無明顯褪色。(附圖2)

2.2.2 統(tǒng)計結(jié)果

18株表皮葡萄球菌臨床株中，具有產(chǎn)膜能力的有11株，其中試驗組9株，對照組2株。

表2.2 試驗組與對照組鼻-鼻竇表皮葡萄球菌PIA表達(dá)結(jié)果

附圖2

附圖3

2.3 表皮葡萄球菌產(chǎn)膜能力定量實驗

試驗組9株表皮葡萄球菌有產(chǎn)膜能力，其中強產(chǎn)膜株1株，弱產(chǎn)膜株8株。對照組有2株具有產(chǎn)膜能力，且為弱產(chǎn)膜株。

表3.1 表皮葡萄球菌產(chǎn)膜能力定量測定

3 討論

CRS患者中的菌群分布特點：本研究中CRS患者、健康者竇口鼻道復(fù)合體處分離最多的需氧菌是表皮葡萄球菌，所占菌群比例分別是50%、42.11%，由此可見表皮葡萄球菌為無論在CRS組中還是對照組中均為優(yōu)勢菌種，與與文獻報道結(jié)果相符。[7,10-11]產(chǎn)膜率及產(chǎn)膜強弱：本試驗中PIA+菌株占表皮葡萄球菌總菌株的61.1%，在CRS患者和健康人中均有發(fā)現(xiàn)具有產(chǎn)膜能力的菌株，實驗組與對照組的成膜率分別為90%、25%，對CRS組、對照組進行產(chǎn)膜表達(dá)率進行四格表確切概率法檢驗χ2=7.901、P=0.005(P<0.01)，說明試驗組的產(chǎn)膜率明顯高于對照組。對CRS組、對照組成膜強弱進行秩和檢驗U=2.731、P=0.016(P<0.05)具有統(tǒng)計學(xué)意義，證明試驗組產(chǎn)膜強度大于對照組。在產(chǎn)膜能力結(jié)果判讀上，剛果紅定性試驗和結(jié)晶紫染色法試驗結(jié)果無明顯差異性。由此可見細(xì)菌生物膜在CRS患者中有一定存在比例，并據(jù)此結(jié)果可以推斷細(xì)菌生物膜是導(dǎo)致慢性鼻竇炎耐藥及遷延不愈的一個重要因素。

[1] Manunga J,Jr,Olak J,Rivera C,Martin M.Prevalence of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in elective surgical patients at a public teaching hospital: an analysis of 1039 patients.Am Surg,2012,78:1096-1099.

[2] Haddadin AS,Fappiano SA,Lipsett PA.Methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in the intensive care unit.Postgrad Med J,2002,78:385-392.

[3] Otto M.Staphylococcal infections: mechanisms of biofilm maturation and detachment as critical determinants of pathogenicity.Annu Rev Med,2013,64:175-188.

[4] Cue D,Lei MG,Lee CY.Genetic regulation of the intercellular adhesion locus in staphylococci.Front Cell Infect Microbiol,2012，2:38.

[5] Mah TF,O’Toole GA.Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents.Trends Microbiol,2001,9:34-39.

[6] Lewis K.Riddle of biofilm resistance.Antimicrob Agents Chemother,2001,45:999-1007.

[7] 左可軍,史劍波,樊韻平,等.慢性鼻竇炎的細(xì)菌學(xué)研究[J].中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志,2005,7,40(7):524-527.

[8] 瞿亞紅，陳麗娜，熊逸群.慢性鼻竇炎患者鼻腔菌群分布及耐藥性分析[J].現(xiàn)代實用醫(yī)學(xué),2013,9,25(9):1049-1050.

[9] 李燕,李冬冬,宋瑱,陶傳敏.4種方法檢測表皮葡萄球菌生物膜形成能力的應(yīng)用價值探討[J].中國實驗診斷學(xué),2011,03:424-427.

[10] 徐瑞龍:慢性鼻-鼻竇炎患者細(xì)菌生物膜形成與細(xì)菌培養(yǎng)的相關(guān)性研究[J].浙江檢驗醫(yī)學(xué),2010,8(3):10-13.

[11] 應(yīng)華永:表皮葡萄球菌在慢性鼻-鼻竇炎患者中生物膜的表達(dá)[J].檢驗醫(yī)學(xué),2011,2,26,(2):118-121.

The bactcriac biofilm observation of clinical nasal sinuses staphy lococcus epidermis strains in ritro culture

XIE Hui,YU Fei,LI Lin-long,DOU Dou,WEN Dong-ping,CAO Liu

(Chengdu University of Traditional Chinese Medicine,Chengdu,Sichuan,610075)

Objective Calculating the proportion of superiority strains for staphylococcus epidermis cases which are respectively in patients with chronic nasal sinusitis (CRS) ,and healthy people.compared the two groups after staphylococcus epidermis aureus in vitro bacterial biofilm production rate and production membrane strength.Comparing the two staphylococcus epidermis groups whose rate of bacterial biofilm production and the strength of biofilm after cultured in vitro.Methods Packeting nasal secretions of chronic nasal sinusitis patients and the healthy people.Identifying superiority strains in secretions.The advantages of strains for staphylococcus epidermis strains will be separated,storaged respectively；By Congo red plate filtering biofilm positive strains and by crystal violet staining semi-quantitative detecting biofilm production strength.Results There ere 39 cases of nasal secretions,among them including 20 CRS，19 healthy people; Congo red plate method measure biofilm positive strains 11 strains,including CRS9 strains,healthy people 2 strains；Compared with Congo red plate the results of crystal violet staining semi-quantitative are the same.Conclusion the staphylococcus epidermis account for aerobic bacteria the largest proportion in CRS.The proportion of CRS staphylococcus epidermis clinical strains cultured in vitro are obviously higher than healthy people.The ability of biofilm production of CRS patients staphylococcus epidermidis clinical strains which are clutured in vitro is stronger than heslthy people.

Staphylococcus epidermidis; Invitro culture; Biofilm; Chronic nasal sinusitis

基金來源：國家自然基金項目(項目編號：81403440)

610075,四川成都，成都中醫(yī)藥大學(xué)

謝慧,E-mail：wangxie-ctu@163.com

10.3969/j.issn.1674-9006.2017.01.005

R765.4