李楠，王強，矯政洧，靳小石，程樹杰

（河北大學(xué)附屬醫(yī)院基本外科，河北保定071000）

結(jié)直腸癌與溶質(zhì)載體家族第5家族8基因甲基化相關(guān)性研究

李楠，王強，矯政洧，靳小石，程樹杰

（河北大學(xué)附屬醫(yī)院基本外科，河北保定071000）

目的研究結(jié)直腸癌組織中溶質(zhì)載體家族第5家族8（SLC5A8）基因甲基化現(xiàn)象。方法采集結(jié)直腸癌患者標本中的癌組織、癌旁組織和正常組織，應(yīng)用甲基化特異性聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）法檢測SLC5A8基因甲基化水平。結(jié)果結(jié)直腸癌組織、癌旁組織及正常組織中SLC5A8基因甲基化率，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），其中結(jié)直腸癌組織中SLC5A8基因甲基化陽性率與癌旁組織及正常組織之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。SLC5A8的表達與其甲基化狀態(tài)成負相關(guān)（r=-0.682）。結(jié)論SLC5A8基因的甲基化是結(jié)直腸癌發(fā)生過程中的重要事件，與其發(fā)生、發(fā)展可能存在密切關(guān)聯(lián)。

結(jié)直腸癌；溶質(zhì)載體家族第5家族8；基因甲基化

結(jié)直腸癌（carcinoma of large intestine）是目前發(fā)病率死亡率均居高不下的一種消化道惡性腫瘤，其發(fā)生過程有多因素、多基因和多步驟共同參與。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)在腫瘤的發(fā)生過程中存在許多抑癌基因的甲基化，從而抑制抑癌基因的表達，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。溶質(zhì)載體家族第5家族8基因（solute carrier 5A8，SLC5A8）是新近發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，由于該基因在正常結(jié)腸組織中大量表達，因而本研究擬對結(jié)直腸癌組織中SLC5A8進行研究，期待發(fā)現(xiàn)新的線索。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年6月-2016年12月在河北大學(xué)附屬醫(yī)院普外科住院手術(shù)結(jié)直腸癌患者40例。其中，直腸癌患者為21例，結(jié)腸癌患者為19例；男22例，女18例；年齡52～80歲，平均60.5歲。采集其結(jié)直腸癌組織、癌旁組織（距離腫瘤邊緣0.5 cm）及正常組織（距離腫瘤邊緣≥5 cm），液氮中貯存?zhèn)溆谩Ｋ谢颊咝g(shù)前均未行任何放化療治療及免疫治療。

1.2 試劑和儀器

1.3 引物的設(shè)計和合成

SLC5A8基因引物應(yīng)用引物設(shè)計軟件Primer 5，參照Gene Bank自行設(shè)計，所有引物均由上海英濰捷貿(mào)易有限公司合成。引物序列（見表1）。

表1 引物序列與擴增片段

1.4 實驗方法

將提取出來的DNA按Epi Tect Fast DNA Kit（德國Epi Tect公司）試劑盒說明書將脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）進行亞硫酸氫鹽修飾，用Epi TectMSP（德國EpiTect公司）試劑盒進行甲基化特異性PCR。擴增完成后，取擴增產(chǎn)物進行電泳。將瓊脂糖凝膠板放入全自動凝膠成像儀中，在紫外光下顯影，拍照保存，并記錄實驗結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料以百分率（%）表示，采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌組織中SLC5A8基因甲基化與臨床特征的關(guān)系

結(jié)果顯示，SLC5A8基因的甲基化與結(jié)直腸癌患者的性別、年齡、部位及臨床分期無相關(guān)性（見表2）。

表2 結(jié)直腸癌不同臨床特征SLC5A8基因甲基化率的比較

2.2 SLC5A8基因甲基化陽性率情況

SLC5A8基因甲基化PCR結(jié)果顯示，癌組織標本有72.5%（29/40）顯示出甲基化擴增產(chǎn)物條帶；癌旁組織中為10%（4/40）；正常結(jié)直腸組織中為5%（2/ 40）。三者差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=34.680，P＜0.05），見附圖。

2.3 結(jié)直腸癌組織中SLC5A8基因甲基化與SLC5A8基因表達率的關(guān)系

附圖SLC5A8基因甲基化PC R擴增產(chǎn)物電泳圖

在40例結(jié)直腸癌組織中有29例發(fā)生SLC5A8基因甲基化，在29例陽性標本中有28例（96.55%）未檢測到SLC5A8表達。11例SLC5A8甲基化陰性的標本中檢測到10例（90.91%）有表達，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=26.368，P=0.000）。SLC5A8的表達與其甲基化狀態(tài)呈負相關(guān)（r=-0.682，P=0.000）。

3 討論

SLC5A8作為新的候選抑癌基因，其編碼的蛋白是與鈉離子偶聯(lián)的轉(zhuǎn)運短鏈脂肪酸、乳酸、煙酸和碘化物的細胞膜載體，屬于鈉離子/葡萄糖共轉(zhuǎn)運蛋白家族成員[1]。SLC5A8在多種組織中表達，并在多種腫瘤中表達沉默，例如胃癌、甲狀腺腫瘤、鋸齒狀腺瘤、賁門癌、肺癌、胰腺癌、食管癌和腦膠質(zhì)瘤等[2-9]，其在結(jié)直腸上皮細胞的頂膜上表達。通過SLC5A8轉(zhuǎn)運體有效的轉(zhuǎn)運輔助，短鏈脂肪酸在結(jié)直腸漿膜面的上皮細胞層都可達到很高的濃度。對保護結(jié)直腸上皮細胞免于炎癥及癌癥的侵害作用上至關(guān)重要。研究證實，SLC5A8編碼蛋白轉(zhuǎn)運底物主要是酮體，而該過程是與鈉偶聯(lián)并生電。并推測SLC5A8在該細胞的能量代謝過程中起到至關(guān)重要的作用[10-11]。由此可見，SLC5A8轉(zhuǎn)運體是保證人體細胞正常代謝的必要保證，如果表達缺失，可能導(dǎo)致正常細胞生理功能失常；在致癌微環(huán)境下，可能進一步導(dǎo)致細胞癌變。

SLC5A8基因在人體內(nèi)廣泛表達，并在分子水平上對正常細胞起到保護作用。該基因的沉默，導(dǎo)致細胞在致癌微環(huán)境中喪失一定的自我保護及修復(fù)能力，增加細胞癌變幾率，并在癌細胞增殖過程中對腫瘤細胞起到一定的保護作用，因此在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中SLC5A8基因的沉默起到至關(guān)重要的作用。腫瘤細胞選擇性的沉默該基因是維持其持續(xù)的增殖狀態(tài)，并逃避凋亡最終結(jié)局的重要機制。既往研究證實，SLC5A8基因在多種腫瘤組織中被沉默，其機制主要是其外顯子1中的GpG島廣泛的甲基化[12]。所以SLC5A8基因的檢測手段可作為早期診斷及預(yù)后評估的重要檢測指標。

結(jié)果顯示，癌組織有72.5%（29/40）甲基化陽性，高于癌旁及正常組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2= 34.680，P＜0.05）。而且SLC5A8基因的甲基化與腫瘤患者的年齡、性別、位置及臨床分期無關(guān)，這與PARK JY等人的研究結(jié)果相一致[5]。表明SLC5A8基因的甲基化與結(jié)直腸癌的發(fā)生相關(guān)，SLC5A8基因的甲基化可能是結(jié)直腸癌發(fā)生的重要影響因素，并可能是該基因表達沉默的主要機制。然而SLC5A8基因在腫瘤組織中并不是100%出現(xiàn)甲基化，這說明SLC5A8基因的甲基化并不只通過表觀遺傳學(xué)的甲基化被抑制表達，可能也存在經(jīng)典遺傳學(xué)途徑抑制SLC5A8基因的表達；另外也說明SLC5A8及基因的甲基化只是在結(jié)直腸癌的發(fā)生過程中的原因之一，在這個過程中同時存在經(jīng)典遺傳學(xué)、表觀遺傳學(xué)以及環(huán)境等多方面的因素。

在40例結(jié)直腸癌組織中有29例發(fā)生SLC5A8基因甲基化，在這29例陽性標本中有28例（96.55%）未檢測到SLC5A8表達，11例SLC5A8甲基化陰性的標本中檢測到10例（90.91%）有表達，結(jié)直腸癌組織中SLC5A8基因甲基化陽性的表達率低于甲基化陰性的結(jié)直腸癌組織（χ2=26.130，P＜0.05）。SLC5A8的表達與其甲基化狀態(tài)成負相關(guān)（r= -0.682），這說明SLC5A8基因的甲基化是該基因表達沉默的主要機制。該現(xiàn)象表明，SLC5A8基因的甲基化是結(jié)直腸癌發(fā)生過程中的早期事件，可能貫穿于結(jié)直腸癌發(fā)生過程的始末，并可能是結(jié)直腸癌標志性的基因改變。這使得進一步研究SLC5A8基因甲基化的轉(zhuǎn)復(fù)能否抑制結(jié)直腸癌細胞生長及SLC5A8基因甲基化與結(jié)直腸癌患者預(yù)后的研究奠定了基礎(chǔ)。使今后臨床檢測SLC5A8基因的甲基化狀態(tài)對腫瘤的早期診斷、治療及預(yù)后成為可能。

[1]JEMAL A,BRAY F,CENTER MM,et al.Global cancer statwasticsstatistics[J].Ca A Cancer Journal for Clinicians,2011,61(2)：69-90.

[2]UENO M,TOYOTA M,AKINO K,et al.Aberrant methylation and hwastone deacetylation associated with silencing of SLC5A8 in gastric cancer[J].Tumour Biol.2004,25(3)：134-140.

[3]DONG S M,LEE E J,JEON E S,et al.Progressive methylation during the serrated neoplasia pathway of the colorectum[J].Mod Pathol,2005,18(2)：170-178.

[4]吳達龍,王立東,易會興,等.賁門癌高發(fā)區(qū)賁門癌組織SLC5A8基因甲基化檢測[J].鄭州大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版,2006,41(1)：19-21.

[5]PARK J Y,KIM D,YANG M,et al.Gene silencing of SLC5A8 identified by genome-wide methylation profiling in lung cancer[J]. Lung Cancer,2013,79(3)：198-204.

[6]PORRA V,FERRAROPEYRET C,DURAND C,et al.Silencing of the tumor suppressor gene SLC5A8 was associated with BRAF mutations in classical papillary thyroid carcinomas[J].Journal of Clinical Endocrinology&Metabolism,2005,90(5)：3028-3035.

[7]HELM J,COPPOLA D,GANAPATHY V,et al.SLC5A8 nuclear translocation and loss of expression were associated with poor outcome in pancreatic ductal adenocarcinom[J].Pancreas,2012,41(6)：904-909.

[8]雷霆,黃磊,胡祥.食管癌及Barrett食管組織抑癌基因SLC5A8甲基化狀態(tài)的檢測[J].中華腫瘤防治雜志,2009,16(19)：1448-1451.

[9]葛紅芳,周偉,徐風(fēng)華,等.腦膠質(zhì)瘤組織中SLC5A8基因和TMS1/ ASC基因表達的研究[J].中華腫瘤防治雜志,2007,14(13)：979-982.

[10]MARTIN P M,DUN Y,MYSONA B,et al.Expression of the sodium-coupledmonocarboxylatetransportersSMCT1(SLC5A8) and SMCT2(SLC5A12)in retina[J].Investigative Ophthalmology &Visual Science,2007,48(7)：3356-3363.

[11]MARTIN P M,GOPAL E,ANANTH S,et al.Identity of SMCT1(SLC5A8)as a neuron-specific Na+-coupled transporter for active uptake of L-lactate and ketone bodies in the brain[J]. Journal of Neurochemistry,2006,98(1)：279-288.

[12]LI H,MYEROFF L,SMIRAGLIA D,et al.SLC5A8,a sodium transporter,was a tumor suppressor gene silenced by methylation in human colon aberrant crypt foci and cancers[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2003,100(14)：8412-8417.

Correlation of colorectal cancer andSLC5A8gene methylation

Nan Li,Qiang Wang,Zheng-wei Jiao,Xiao-shi Jin,Shu-jie Cheng
(Department of General Surgery,Affiliated Hospital of Hebei University, Baoding,Hebei 071000,China)

ObjectiveTo study the methylation ofSLC5A8gene in colorectal cancer.MethodsSpecimens adjacent to carcinoma tissue and normal tissue in the patients with colorectal cancer tissue were collected. Methylation specific polymerase chain reaction(PCR)method was used to detectSLC5A8gene methylation level.ResultsDifferences in colorectal cancer tissue,the tissue adjacent to carcinoma and normal tissues of SLC5A8gene methylation rate were statistically significant(P＜0.05).Differences ofSLC5A8gene methylation positive rate in colorectal cancer tissues,cancer adjacent tissues and normal tissues was statistically significant (P＜0.05).TheSLC5A8gene expression and methylation status is negative correlation(r=-0.682).ConclusionsTheSLC5A8gene methylation is important in the process of colorectal cancer occurs,it may have closely relationship of occurrence and development.

colorectal cancer;SLC5A8;gene methylation

R735.35

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.08.009

1005-8982（2017）08-0043-04

2016-09-20

靳小石，E-mail：doctorjinxiaoshi@126.com