蓋瓊輝，王春林

(隴東學(xué)院，甘肅慶陽 745000)

深色果蔬維生素C檢測方法的優(yōu)化與比較

蓋瓊輝，王春林

(隴東學(xué)院，甘肅慶陽 745000)

目的：優(yōu)化2，6-二氯靛酚鈉滴定法和高效液相色譜法檢測維生素C含量操作規(guī)范性及適用性。方法：對檢測條件的設(shè)置、試劑及樣液的保存時間、提取劑及濃度的選擇、提取過程、脫色劑用量及2種檢測方法的精密度、重復(fù)性和加標(biāo)回收率等關(guān)鍵影響因素進(jìn)行比較。結(jié)果：高效液相色譜法檢測設(shè)置C18(5μm，4.6×250mm)色譜柱，0.1%草酸為流動相，流速1mL/min，柱溫30℃，檢測波長254nm，所得圖譜保留時間適宜，峰形良好，維生素C標(biāo)準(zhǔn)液濃度在0.025～0.3mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為：y=46 116x+173.26，R2為0.999 2；維生素C標(biāo)準(zhǔn)液在4～6℃保存下48h內(nèi)可用、2，6-二氯靛酚鈉溶液在4～6℃保存下應(yīng)在12d內(nèi)使用，待測液制備完成后應(yīng)立即測定，若無法立即測定，可于4～6℃冰箱中保存1.5h；2%草酸為提取劑效果最佳，樣品加提取液勻漿后迅速定容、過濾和檢測，不可久置；使用2，6-二氯靛酚鈉滴定法時需添加0.4g/30mL的活性炭進(jìn)行脫色；精密度、重復(fù)性及加標(biāo)回收率均符合測定要求。結(jié)論：2種檢測方法都適用于深色果蔬維生素C含量檢測，各有特點，可根據(jù)測定要求及實際條件選擇適宜的方法。

深色果蔬；草莓；維生素C；高效液相色譜；2，6-二氯靛酚鈉

維生素C是維持人體正常生命過程所必需的一類有機物[1]，主要有提高免疫力、保護(hù)牙齒和牙齦、預(yù)防癌癥、心臟病、中風(fēng)等作用。維生素C主要以還原型形態(tài)存在于新鮮蔬果中，也有以氧化型及少量結(jié)合態(tài)存在，其含量是評定果蔬營養(yǎng)價值的重要指標(biāo)。草莓為薔薇科多年生草本植物[2]，其果實顏色紅艷，營養(yǎng)價值高，含有豐富的維生素C及色素，可作為深色果蔬的典型代表。

維生素C的測定方法有很多種，包括滴定法、分光光度法、熒光法、電極法、薄層色譜法及高效液相色譜法等，這些方法各有其特點和不足[3-4]。目前常用的檢測方法主要為2，6-二氯靛酚鈉滴定法和高效液相色譜法兩種，但各種文獻(xiàn)報道中[5-10]這兩種檢測方法所使用的提取劑、提取過程、脫色劑、試劑及待測液的保存溫度和時間等具體操作條件并不一致，對檢測結(jié)果可能造成影響。本文以深色果蔬草莓為材料對維生素C測定過程中涉及到的檢測條件的設(shè)置、試劑及樣液的保存時間、提取劑及濃度的選擇、提取過程、脫色劑用量及兩種檢測方法的精密度、重復(fù)性和加標(biāo)回收率等關(guān)鍵影響因素進(jìn)行了比較研究，為2，6-二氯靛酚鈉滴定法和高效液相色譜法檢測維生素C含量的操作規(guī)范性及適用性提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和主要儀器

供試材料：2016年4月1日—5月1日期間市售草莓。

試劑：抗壞血酸(標(biāo)準(zhǔn)品)、2，6-二氯靛酚鈉鹽(分析純)、碳酸氫鈉(分析純)、草酸(分析純)、偏磷酸(分析純)、醋酸(分析純)、活性炭、甲醇(色譜純)、超純水等。

主要儀器：HZK-FA210型電子分析天平，成都欣宇實驗設(shè)備有限公司；JJ-2型組織搗碎機，上海書俊儀器設(shè)備有限公司；JPS-30A型超聲波清洗儀，鄭州渤銳超聲波設(shè)備有限公司；BILON-HL-205型恒溫水浴鍋，上海比朗儀器制造有限公司；JD-7200K型高速離心機，武漢晟睿明科學(xué)儀器有限公司；S-300型溶劑過濾裝置，天津市領(lǐng)航實驗設(shè)備有限公司；Ajilent 1100型高效液相色譜儀(配紫外檢測器)，美國安捷倫公司。

1.2 方法

1.2.1 2，6-二氯靛酚鈉(2，6-DCIP)溶液的制備、標(biāo)定及樣品測定[11]稱取52mg NaHCO3溶解于200mL沸水中，加入50mg 2，6-二氯靛酚，冷卻后過濾、定容于250mL棕色容量瓶中，冰箱中冷藏保存，每次滴定前用1mg/mL維生素C標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行標(biāo)定。即取1mL維生素C標(biāo)準(zhǔn)液，加入9mL 2%草酸，搖勻，用2，6-DCIP溶液滴定，以生成為紅色持續(xù)15s不退為終點，記錄2，6-DCIP溶液的消耗體積，計算每mL 2，6-DCIP溶液相當(dāng)于維生素C的mg數(shù)，記為T值。樣品測定時取待測樣液10 mL，搖勻，用2，6-DCIP溶液滴定，以生成為紅色持續(xù)15s不退為終點，記錄2，6-DCIP溶液的消耗體積，另取10 mL 2%草酸作空白對照滴定，平行操作2次。樣品中維生素C含量測定如式(1)：

(1)

式(1)中：VA為樣品滴定消耗2，6-DCIP溶液體積平均值(mL)；VB為空白滴定消耗2，6-DCIP溶液體積平均值(mL)；C為樣品提取液定容體積(mL)；T為每mL 2，6-DCIP溶液相當(dāng)于維生素C的mg數(shù)(mg/mL)；D為滴定時樣液的體積(mL)；W為被測樣品的質(zhì)量(g)。

1.2.2 高效液相色譜法(HPLC)檢測條件及標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 HPLC檢測條件[12]：C18(5μm，4.6×250mm)色譜柱、0.1%草酸為流動相、流速1mL/min、柱溫30℃、檢測波長254nm。用濃度為1mg/mL的維生素C標(biāo)準(zhǔn)液稀釋成濃度分別為0.025、0.05、0.1、0.15、0.2、0.3mg/mL的維生素C標(biāo)準(zhǔn)使用液，用HPLC法進(jìn)行檢測，每次進(jìn)樣20μL，對所測得圖譜的峰面積數(shù)據(jù)進(jìn)行記錄和分析，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計算出回歸方程。

1.2.3 試劑存放時間試驗 將維生素C標(biāo)準(zhǔn)液置于 4～6℃冰箱中，分別于0、3、6、24、48、72、96、118、142h時用HPLC法檢測維生素C標(biāo)準(zhǔn)液中維生素C含量的變化，每處理重復(fù)3次；將2，6-DCIP溶液存放于4～6℃冰箱中，分別于0、2、4、6、8、10、12、14、16d時用維生素C標(biāo)準(zhǔn)液標(biāo)定2，6-DCIP溶液，檢測t值的變化。

1.2.4 待測液存放條件試驗 將待測液避光分別存放于室溫和4～6℃冰箱中，于0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、8、16、24h時分別采用2，6-DCIP法和HPLC法檢測維生素C含量。

1.2.5 提取劑選擇試驗 分別用1%、2%、3%的草酸溶液、偏磷酸溶液、醋酸溶液作為提取劑在同一條件下進(jìn)行提取，對提取液分別用2，6-DCIP法和HPLC法檢測維生素C含量。

1.2.6 提取方法優(yōu)化試驗 以2%草酸為提取劑與樣品混合打成勻漿，取等量勻漿于7個100mL容量瓶中，用2%草酸定容，分別置于室溫下震蕩0、5、10、15min，及在超聲波清洗儀中超聲[13]5、10、15min，處理后立即過濾，濾液分別用2，6-DCIP法和HPLC法檢測維生素C含量。

1.2.7 活性炭用量試驗 以質(zhì)量比1∶1稱取草莓樣品與2%草酸混合，迅速搗碎成漿，轉(zhuǎn)移到250mL容量瓶中定容，搖勻后各取30mL置于7個離心管中，分別加入活性炭0、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、3.0g，搖勻后于10 000r/min離心機中低溫離心15min，取上清液分別用2，6-DCIP法和HPLC法檢測維生素C含量。

③點E與點C運動的路線有什么關(guān)系？(平行且相等)由此你發(fā)現(xiàn)了什么？(如圖3，四邊形AEE′C′是平行四邊形)

1.2.8 精密度試驗 HPLC法的精密度[14]試驗用1mg/mL的維生素C標(biāo)準(zhǔn)液，重復(fù)檢測6次(每次進(jìn)樣15μL)，檢測維生素C色譜峰保留時間和峰面積，計算RSD值。2，6-DCIP法[15]的精密度試驗用2，6-DCIP溶液滴定0.02mg/mL的維生素C標(biāo)準(zhǔn)液，重復(fù)滴定6次(每次10mL)，記錄消耗2，6-DCIP溶液的體積并算出T值，計算RSD值。

1.2.9 重復(fù)性試驗 采用同批次樣品相同處理方法，分別用2，6-DCIP法和HPLC法檢測維生素C含量，重復(fù)5次。

1.2.10 加標(biāo)回收試驗[16]在樣品勻漿中，分別加入0.2mg/mL的維生素C標(biāo)準(zhǔn)液0、0.5、1mL，然后提取、脫色后分別用2，6-DCIP法和HPLC法進(jìn)行檢測，計算維生素C測定值和加標(biāo)回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC檢測條件及標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖1可見，維生素C含量檢測所得圖譜保留時間適宜，峰形良好，說明檢測條件設(shè)置得當(dāng)。圖2表明，維生素C標(biāo)準(zhǔn)液濃度在0.025～0.3mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為：y=46 116x+173.26，R2為0.999 2。

圖1 不同濃度維生素C標(biāo)準(zhǔn)液HPLC檢測圖譜

圖2 HPLC法測定維生素C標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 試劑存放時間對含量的影響

由圖3、圖4可見，存放于4～6℃冰箱中的維生素C標(biāo)準(zhǔn)液及2，6-DCIP溶液均隨存放時間的增長含量降低。其中，維生素C標(biāo)準(zhǔn)液在0～48h之內(nèi)變化不大，超過48h后維生素C含量急劇降低；2，6-DCIP溶液在0～12d內(nèi)t值降低較小，超過12d后t值急劇下降。說明配制的維生素C標(biāo)準(zhǔn)液在4～6℃下可保存48h，超過48h不可作為標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行試驗，配制的2，6-DCIP溶液在4～6℃保存下應(yīng)在12d內(nèi)使用。

圖3 不同存放時間對維生素C標(biāo)準(zhǔn)液含量的影響

圖4 不同存放時間對2，6-DCIP溶液的影響

2.3 待測液樣存放條件對檢測結(jié)果的影響

表1表明，待測液室溫和低溫存放，都隨存放時間增長，維生素C含量降低，室溫存放比低溫存放降低幅度大。經(jīng)多重比較得知，在室溫下存放0.5h，待測液中維生素C含量即顯著降低，低溫存放1.5h內(nèi)待測液中維生素C含量差異不顯著。HPLC法檢測所得維生素C含量均高于2，6-DCIP法檢測結(jié)果。說明待測液制備完成后應(yīng)立即測定，若無法立即測定，應(yīng)置于低溫保存，時間不超過1.5h。

圖5顯示，草酸及醋酸的濃度對維生素C的提取影響較大，2種酸均以2%提取效果最佳，偏磷酸的濃度對維生素C的提取影響較小。3%的草酸及醋酸使得2種檢測方法的結(jié)果均出現(xiàn)較大差異，說明酸濃度過高不利于檢測，2%草酸提取效果最佳。

2.5 提取方法優(yōu)化

常溫振蕩提取和超聲波提取都會隨著提取時間的延長而使測定值下降(圖6)，其中超聲波提取5min內(nèi)，維生素C含量降低幅度較小，兩種檢測方法檢測結(jié)果差異不大。說明樣品加提取液勻漿后應(yīng)迅速定容、過濾和檢測。

表1 不同存放條件下樣品待測液維生素C含量 單位：mg/100g

注：表中字母是多重比較的字母標(biāo)記法，采用最小顯著性差異法(LSD)計算，顯著性水平0.05。

圖5 不同提取劑對測定結(jié)果的影響

圖6 不同提取方法對維生素含量的影響

2.6 活性炭用量對檢測結(jié)果的影響

由圖7可見，樣品中不添加活性炭時，2，6-DCIP法無法測出樣品中維生素C含量，隨著活性炭添加量的增加，測得的維生素C含量逐漸降低，添加量低于0.4g/30mL時對檢測結(jié)果幾乎無影響，超過則使檢測結(jié)果大幅度降低，兩種檢測方法檢測結(jié)果無顯著差異。說明使用2，6-DCIP法檢測樣品中維生素C含量時必須使用低于0.4g/30mL的活性炭對樣本進(jìn)行脫色，使用HPLC法檢測樣品中維生素C含量時可不進(jìn)行脫色處理。

圖7 活性炭用量對檢測結(jié)果的影響

2.7 檢測方法精密度比較

由表2可見，HPLC檢測維生素C標(biāo)準(zhǔn)液的保留時間RSD為0.13%，峰面積RSD為0.43%；2，6-DCIP法滴定維生素C標(biāo)準(zhǔn)液消耗2，6-DCIP溶液體積RSD為1.44%、t值RSD為1.43%，說明2種檢測方法精密度均能夠滿足測定要求，HPLC法精密度高于2，6-DCIP法。

表2 2種檢測方法精密度比較

2.8 檢測方法重復(fù)性比較

由表3可見，采用2，6-DCIP法5次滴定相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.68%、HPLC法5次檢測相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.56%，2種方法測定草莓維生素C含量的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5%，方法重復(fù)性好，說明2種檢測方法均適用于檢測樣品中維生素C含量。

表3 檢測方法重復(fù)性比較

2.9 2種檢測方法的加標(biāo)回收率

表4表明，HPLC法的回收率在99%～104.1%之間、2，6-DCIP法的回收率在95.7%～100.2%之間，說明2種檢測方法測定結(jié)果準(zhǔn)確。

表4 2種檢測方法加標(biāo)回收率

3 結(jié)論與討論

目前最常用的維生素C檢測方法為2，6-二氯靛酚鈉滴定法和高效液相色譜法，本文對這2種檢測方法具體操作過程中涉及到的檢測條件的設(shè)置、試劑及樣液的保存時間、提取劑及濃度的選擇、提取過程、脫色劑用量及2種檢測方法的精密度、重復(fù)性和加標(biāo)回收率等關(guān)鍵影響因素進(jìn)行了比較，得出以下結(jié)論。

(1)HPLC檢測設(shè)置C18(5μm，4.6×250mm)色譜柱，0.1%草酸為流動相，流速1mL/min，柱溫30℃，檢測波長254nm，所得圖譜保留時間適宜，峰形良好，維生素C標(biāo)準(zhǔn)液濃度在0.025～0.3mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為y=46 116x+173.26，R2為0.999 2，說明檢測條件設(shè)置得當(dāng)。(2)配制的維生素C標(biāo)準(zhǔn)液在4～6℃下可保存48h，超過48h不可作為標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行試驗，配制的2，6-DCIP溶液在4～6℃保存下應(yīng)在12d內(nèi)使用。待測液制備完成后應(yīng)立即測定，若無法立即測定，應(yīng)置于低溫保存，時間不超過1.5h。(3)提取劑濃度過高使得樣品中維生素C含量測定值降低，通過比較得出2%草酸提取效果最佳。樣品加提取液勻漿后應(yīng)迅速定容、過濾和檢測，不宜放置或進(jìn)行震蕩、超聲提取。(4)活性炭可對樣品提取液進(jìn)行脫色，使用2，6-DCIP法檢測樣品中維生素C含量時需添加0.4g/30mL的活性炭對樣本進(jìn)行脫色，使用HPLC法檢測樣品中維生素C含量時可不進(jìn)行脫色處理。(5)精密度、重復(fù)性及加標(biāo)回收率試驗均表明2種檢測方法都適用于深色果蔬維生素C含量檢測。其中HPLC法精密度高于2，6-DCIP法；2，6-DCIP法的回收率為95.7%～100.2%，平均回收率為97.95%，RSD為2.68%；HPLC法的回收率為99%～104.1%，平均回收率為101.55%，RSD為2.56%。HPLC法檢測結(jié)果準(zhǔn)確、穩(wěn)定、操作簡便、靈敏度高、重現(xiàn)性及選擇性好，無需脫色，但試驗前期準(zhǔn)備和后期掃尾工作較為繁瑣，如配制流動相、調(diào)試設(shè)備、做標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢測完成后沖洗色譜柱等，較為費時，且對樣品的純度要求比較高，所用儀器昂貴[16]；2，6-DCIP法所需條件簡單，操作簡便、快速、測定結(jié)果準(zhǔn)確，但滴定終點需人為判斷，較為主觀，不同的人檢測可能造成較大的結(jié)果差異，且使用脫色劑吸附色素的同時，也吸附了一定數(shù)量的維生素C，造成樣品中維生素C的損失。在實際操作過程中可根據(jù)測定要求及實際條件選擇適宜的方法?！?/p>

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(責(zé)任編輯 李婷婷)

Optimization and Comparison of Detection Methods of Vitamin C in Dark Fruits and Vegetables

GAI Qiong-hui，WANG Chun-lin

(Longdong University，Qingyang 745000，China)

dark fruit and vegetable；strawberry；vitamin C；HPLC；2，6-DCIP

蓋瓊輝(1978— )，女，碩士，講師，研究方向：農(nóng)作物栽培、設(shè)施農(nóng)業(yè)。