張磊，葉大檸，朱焱，柴海云，朱慶義，陳茶，屈平華(.廣州金域醫(yī)學檢驗中心有限公司微生物室，廣州 500；.新豐縣人民醫(yī)院，廣東新豐 500；.福建醫(yī)科大學附屬泉州第一醫(yī)院檢驗科，福建泉州 6000；.廣東省中醫(yī)院/廣州中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院檢驗醫(yī)學部，廣州 50006)

·臨床實驗研究·

10株蜃樓弗朗西斯菌的鑒定與特征分析*

張磊1，葉大檸2，朱焱3，柴海云1，朱慶義1，陳茶4，屈平華4
(1.廣州金域醫(yī)學檢驗中心有限公司微生物室，廣州 510330；2.新豐縣人民醫(yī)院，廣東新豐 511100；3.福建醫(yī)科大學附屬泉州第一醫(yī)院檢驗科，福建泉州 362000；4.廣東省中醫(yī)院/廣州中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院檢驗醫(yī)學部，廣州 510006)

目的 對10株蜃樓弗朗西斯菌樣細菌進行菌種鑒定和特征分析。方法 對環(huán)境水源及臨床患者樣本中分離的10株實驗菌株，進行菌體形態(tài)和生長特征觀察、生化表型鑒定、基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF MS)鑒定和16S rRNA測序分析。E-test方法檢測菌株對各種藥物的最低抑菌濃度(MIC)。結果 該10株菌均為著色較淡的革蘭陰性小球桿菌；尿素酶陰性、硝酸鹽還原試驗陰性、V因子和X因子需求試驗陰性，氧化酶和觸酶試驗陽性；在M-H平板和麥康凱平板上不生長，血平板、巧克力平板和BCYE平板上生長迅速，可形成白色不透明型、無色透明型和灰色光滑型，直徑約2 mm大小的菌落。16S rRNA基因測序顯示，該10株菌與蜃樓弗朗西斯菌ATCC 25015同源性在99.6%以上，系統發(fā)育分析亦位于同一個分枝上。MALDI-TOF MS分析顯示，該10株均含有6 153 m/z、5 180 m/z、7 757 m/z和9 392 m/z等特征峰，與蜃樓弗朗西斯菌ATCC 25015類似。采用Vitek 2 GN卡及NH卡、API 20NE及NH試條則可能錯誤鑒定為少動鞘氨醇單胞菌、灰色奈瑟菌、氣味黃桿菌和嗜血桿菌等。藥敏試驗顯示，對氯霉素、多西環(huán)素、慶大霉素、四環(huán)素、氧氟沙星和環(huán)丙沙星等均敏感。結論 該10株菌可鑒定為蜃樓弗朗西斯菌，其生化反應不活潑，常規(guī)方法鑒定會發(fā)生錯誤，應予以重視。

蜃樓弗朗西斯菌; 鑒定; 基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜

蜃樓弗朗西斯菌(Francisellaphilomiragia)是一種革蘭陰性球桿菌，主要存在于近海淺海和鹽堿地區(qū)的咸水源中，可在免疫力低下和免疫屏障受破壞的患者中引起慢性肉芽腫病、骨髓增生性疾病、溺水性肺炎、腹膜炎、膿毒血癥和傷口感染等[1-2]。目前，全球范圍內僅有40多例蜃樓弗朗西斯菌的臨床感染報道[2]，且我國暫未有該菌的分離和菌種鑒定信息。近年來，本課題組通過改良的弗朗西斯菌分離培養(yǎng)方法，先后在我國的環(huán)境水樣中發(fā)現和命名了一個新的另弗朗西斯菌屬(Allofrancisella)和3個新菌種[3]。本研究對前期分離保存的8株蜃樓弗朗西斯菌樣環(huán)境菌分離株和2株臨床分離株，以及蜃樓弗朗西斯菌標準菌株ATCC 25015，進行常規(guī)生化表型鑒定、基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF-MS)分析、16S rRNA基因序列分析，最終將該10株菌確定為蜃樓弗朗西斯菌，報道如下。

1 材料和方法

1.1 菌株 10株蜃樓弗朗西斯樣細菌分別分離于環(huán)境水源及臨床患者血液樣本，部分菌株已獲得GenBank登錄號。8株環(huán)境分離株中除1株分離于集中空調冷卻塔水，其余7株均分離自咸水源，樣本的前處理和分離培養(yǎng)步驟見參考文獻[4]。2株臨床分離株則均來自于血培養(yǎng)標本，其中Zhangzhou株分離自一位54歲長期酗酒和多器官功能衰竭男性患者；而Fuzhou株分離自一位62歲糖尿病和骨髓增生的女性患者。弗朗西斯菌ATCC 2015由廣東省微生物菌種保藏中心代購。菌株來源和相關信息見表1。Vitek-MS質譜鑒定的校準菌株大腸埃希菌ATCC 8739為法國生物梅里埃公司贈送。

表1 實驗菌株來源和相關信息

1.2 主要試劑與儀器 Vitek 2 Compact全自動細菌鑒定藥敏分析儀及配套GN卡、NH卡、API 20非腸桿菌科(API 20NE)試條、API奈瑟菌和嗜血桿菌(API NH)試條、Vitek-MS鑒定系統和相關耗材、血平板、巧克平板、頭孢硝噻吩紙片、氧化酶紙片(法國生物梅里埃公司)； HTM平板(廣州迪景公司)；含L-半胱氨酸的BCYE平板和不含L-半胱氨酸的BCYE平板由本室自配，制備方法見參考文獻[5]；ABI Veriti 96孔PCR儀(美國 ABI 公司)；全自動凝膠成像系統(英國Syngene公司)；Taq酶體系、DL 2000 DNA marker(大連TaKaRa公司)；引物合成及測序由上海英捷維基公司完成；E-test試條(溫州康泰生物公司)。

1.3 生長特性和菌落形態(tài)觀察 將10株實驗菌株與蜃樓弗朗西斯菌ATCC 25015分別接種于血平板、巧克力平板、含L-半胱氨酸的BCYE平板和不含L-半胱氨酸的BCYE平板，置于含5% CO2的35 ℃恒溫溫育箱培養(yǎng)，觀察其在不同培養(yǎng)基上的菌落生長形態(tài)。

1.4 生化鑒定 對巧克力平板上培養(yǎng)48 h菌落進行革蘭染色、氧化酶和觸酶試驗，按常規(guī)生化鑒定流程，分別采用Vitek 2 Compact GN卡、Vitek 2 Compact NH卡、API 20NE條和API NH條進行鑒定，具體操作參照說明書。采用頭孢硝噻吩紙片顯色法檢測菌株是否產β-內酰胺酶，按試劑說明書進行。

1.5 MALDI-TOF MS分析 取巧克力平板上培養(yǎng)48 h的單個菌落涂布在靶板點位上，加 1 μL Vitek MS-CHCA基質覆蓋，提取細菌全細胞蛋白質。靶板每組中心點位涂布大腸埃希菌ATCC 8739，用于該組所有菌株質譜數據的校正。RUO數據庫分析得到各株的蛋白質質量指紋圖譜，參考弗朗西斯菌蛋白質質譜分析的相關文獻[5]進行圖譜比較。

1.6 16S rRNA基因擴增及測序鑒定 采用煮沸法提取細菌DNA，即挑取單個菌落置于無菌去離子水中105 ℃ 15 min，13 000×g離心1 min，取上清液作模板。16S rRNA基因基因擴增參考文獻[6]進行。PCR擴增產物送上海英捷維基公司進行雙向測序。測得的序列以DNA軟件進行序列拼接，GenBank數據庫中進行NCBI BLAST(http://blast.ncbi.nhn.nih.gov/Blast.cgi)分析，并下載相關16S rRNA基因參考序列，用Mega 7軟件構建系統發(fā)育樹。

1.7 藥敏試驗 采用E-test方法，以HTM平板檢測慶大霉素、四環(huán)素、強力霉素、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、氯霉素等抗菌藥物的最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration, MIC)，藥敏結果判讀參照美國臨床和實驗室標準化協會(CLSI)M45-A2文件中土拉弗朗西斯菌(F.tularensis)的判讀折點。

2 結果

2.1 生長特性 10株細菌中除10HL1958在血平板上生長緩慢，在培養(yǎng)48 h始見明顯菌落、72～96 h 始形成直徑約1～2 mm大小菌落外，其余9株實驗菌株在血平板培養(yǎng)48 h即可以形成直徑約2 mm大小、突起、邊緣整齊、不溶血菌落。巧克力平板和BCYE平板的菌落形態(tài)與血平板上菌落形態(tài)基本一致。按照菌落表型，可分為包括白色不透明、無色半透明型和灰色光滑型等3種主要菌落表型。見圖1。10株菌株除10HL1958在含L-半胱氨酸的BCYE平板生長狀態(tài)明顯優(yōu)于不含L-半胱氨酸的BCYE平板，即具有L-半氨胱酸生長依賴性外，其余9株菌株和蜃樓弗朗西斯菌ATCC 25015在以上2種培養(yǎng)基上的生長狀態(tài)無明顯區(qū)別。所有實驗菌株在M-H平板和麥康凱平板上均不生長，與蜃樓弗朗西斯菌ATCC 25015和文獻描述一致[7]。

注：A，灰色光滑型;B,白色不透明型；C，無色透明型。

圖1 實驗菌株在嗜血巧克力平板培養(yǎng)96 h的3種菌落表型

2.2 生化表型與鑒定 該10株菌為著色較淡的革蘭陰性桿菌和小球桿菌。見圖2。觸酶弱陽性，氧化酶陽性，硝酸鹽還原試驗陰性，尿酶陰性，與蜃樓弗朗西斯菌ATCC 25015類似。V因子和X因子需求試驗陰性，β-內酰胺酶試驗陽性。Vitek 2 Compact GN卡和NH卡、API 20 NE條和NH條的鑒定結果見表2。

圖2 蜃樓弗朗西斯菌初步傳代革蘭染色形態(tài)(×1 000)

2.3 MALDI-TOF MS鑒定和分析 10株實驗菌株采用Vitek-MS均不能鑒定。經RUO數據庫分析和質譜峰圖比較發(fā)現，10株菌蛋白質質譜指紋與蜃樓弗朗西斯菌ATCC 25015類似，其主要蛋白質質譜峰在0～12 000 m/z范圍內，且含5 180、6 153、7 757和9 392 m/z等高強度特征峰。見圖3。

2.4 16S rRNA基因測序鑒定和序列分析 10株菌和蜃樓弗朗西斯菌ATCC 25015均擴增得到長度約1 500 bp產物。經測序與BLAST分析，該10株臨床和環(huán)境分離株與蜃樓弗朗西斯菌ATCC 25015的16S rRNA基因序列相似度在99.6%以上。而基于16S rRNA基因序列構建的系統發(fā)育樹亦顯示，該10株臨床和環(huán)境分離株與蜃樓弗朗西斯菌位于同一個分枝。見圖4。

表2 實驗菌株常規(guī)生化鑒定結果

注：a，28 ℃溫育48 h的實驗結果；b，少動鞘氨醇單胞菌(51%可能性)，熒光假單胞菌(49%可能性)；c，灰色奈瑟菌，腦膜炎奈瑟菌；d，芳香黃桿菌(鑒定值38.5%)，有毒威克斯菌(鑒定值28.3%)，短黃桿菌(鑒定值19.2%)。

注：橫坐標，質/荷比(m/z);縱坐標,峰相對強度。

圖3 部分實驗菌株的MALDI-TOF MS峰

注：線段0.002代表0.2/100進化距離單位。

圖4 基于16S rRNA基因序列和鄰近連接法構建的系統發(fā)育樹

2.5 藥敏試驗結果 10株實驗菌株和蜃樓弗朗西斯菌ATCC 25015對慶大霉素MIC為0.5～1 μg/mL，四環(huán)素MIC為2～3 μg/mL，強力霉素MIC為1～3μg/mL，環(huán)丙沙星MIC為0.023～0.064 μg/mL，左氧氟沙星MIC為0.032～0.064 μg/mL，氯霉素MIC為2～8 μg/mL，參照CLSI M45-A2土拉弗朗西斯菌判讀折點，對上述抗菌藥物均敏感。

3 討論

弗朗西斯菌是一種低GC含量的革蘭陰性球桿菌，隸屬于γ-變形菌綱的硫發(fā)菌目(Thiotrichales)。近年來研究發(fā)現，弗朗西斯菌廣泛存在于自然界的水和潮濕的土壤環(huán)境中[8-9]，且能借助生物膜和原蟲宿主的寄生作用，在外環(huán)境中長期存在。例如，在咸水環(huán)境中，蜃樓弗朗西斯菌和土拉弗朗西斯菌新兇手亞種，能以甲殼質酶依賴的方式在蟹殼、蝦、軟體動物、硅藻和浮游動物上形成生物被膜[10]，并通過傷口接觸和溺水等方式引起人的感染。而在淡水環(huán)境中，土拉弗朗西斯菌可以長期存在于庫蚊幼蟲內，并在庫蚊成年后，以叮咬的方式感染人類[11]。此外，在土耳其曾有飲用水源污染引起口咽部土拉菌病暴發(fā)的報道，并得到了包括全基因組測序在內的流行病學數據的支持[12]。然而，我國該類細菌的臨床感染未引起人們的足夠重視。本研究通過傳統的形態(tài)學檢驗、生化反應、MALDI-TOF MS蛋白質指紋特征和16S rRNA基因測序的方法，最終將本課題組分離的10株臨床和環(huán)境分離株鑒定為蜃樓弗朗西斯菌。并且發(fā)現10HL1950與現有的蜃樓弗朗西斯菌的生長特性具有典型的差異，且生境特殊，源于人工水體，不同于其他環(huán)境來源的咸水源菌株，故可能為一新的亞型。

就弗朗西斯菌和相關菌種的生物學特征來看，該類細菌的革蘭染色特征典型，為革蘭陰性球桿菌，且與沙黃的結合能力較弱，故革蘭染色著色較淡(見圖1)。此外，弗朗西斯菌的一些表型特征可與其他一些革蘭陰性球菌和革蘭陰性球桿菌相鑒別。例如，尿酶陰性，可與布魯菌相鑒別[7]，在M-H平板和麥康凱平板不生長，可與不動桿菌相鑒別；V因子和X因子需求試驗陰性，可與流感嗜血桿菌和副流感嗜血桿菌相鑒別。蜃樓弗朗西斯菌對于營養(yǎng)要求不高，如采用Vitek 2 Compact GN卡和NH卡、API 20NE條和NH等鑒定系統，可能被錯誤鑒定為少動鞘氨醇單胞菌、灰色奈瑟菌、氣味黃桿菌、流感嗜血桿菌、副流感嗜血桿菌和嗜沫嗜血桿菌等。其被錯誤鑒定的原因主要在于其臨床報道較為少見，且不在上述細菌鑒定系統的數據庫范圍。另外，弗朗西斯菌的菌落表型可分為白色不透明、無色半透明型和灰色光滑型等類型。Gunn等[13]認為，光滑型菌落可能為野生型細菌，毒力和致病性更強，但由于受培養(yǎng)、傳代及細胞壁脂多糖表達的影響，可能會在同一個平板出現兩種不同的菌落表型，從而增加了對于其典型菌落的辨認難度?？偟膩碚f，對于革蘭染色著色較淡的革蘭陰性球桿菌，如尿酶陰性，在M-H平板和麥康凱平板不生長，V因子和X因子需求試驗陰性，則應該高度懷疑為弗朗西斯菌，但確切的菌種鑒定還需依賴于分子生物學的技術和質譜鑒定的方法。

MALDI-TOF MS是近年來發(fā)展起來的一種新型的軟電離生物質譜，具有快速、簡便、可靠的特點[6]。從本課題組前期研究資料[3]來看，4 424 m/z存在于所有弗朗西斯菌屬和另弗朗西斯屬(Allofrancisella)的全部菌種中，可能是弗朗西斯菌科的“科”特征峰；5 180 m/z存在于已知弗朗西斯菌屬的各個種之間，可能是弗朗西斯菌屬“屬”特征峰；而5 110 m/z可能是另弗朗西斯屬的“屬”特征峰[3]。并且，對于具有臨床意義的生物恐怖菌——土拉弗朗西斯菌，特征峰6 141 m/z可用于其種的鑒定[5]。相信隨著數據庫的不斷補充與應用軟件的完善，MALDI-TOF-MS不僅將在弗朗西斯菌的鑒定中體現其快速、準確、靈敏的特點，還會成為弗朗西斯菌分型和流行病學研究的有力工具。

[1]Relich RF, Humphries RM, Mattison HR,etal.Francisellaphilomiragiabacteremia in a patient with acute respiratory insufficiency and acute-on-chronic kidney disease: a case report and review of the literature[J]. J Clin Microbiol, 2015, 53(12): 3947-3950.

[2]Louis K, Louis T, David L,etal. Disseminated infection caused byFrancisellaphilomiragia, France, 2014[J]. Emerg Infect Dis, 2015, 21(12): 2260-2261.

[3]Qu PH, Li Y, Salam N,etal.Allofrancisellainopinatagen. nov. sp. nov. andAllofrancisellafrigidaquaesp. nov. isolated from water-cooling systems and transfer ofFrancisellaguangzhouensisQuetal. 2013 to the new genus asAllofrancisellaguangzhouensiscomb. nov.[J]. Int J Syst Evol Microbiol, 2016, 66(11): 4832-4838.

[4]屈平華, 鄧小玲, 張健, 等. 一株弗朗西斯菌的鑒定及其微生物學特性研究[J]. 微生物學報, 2009, 49(8): 1003-1010.

[5]胡朝暉, 朱慶義, 劉本榮, 等. 軍團菌選擇性分離培養(yǎng)基及其實用性比較研究[J]. 國際檢驗醫(yī)學雜志, 2006, 27(3): 209-211.

[6]Seibold E, Maier T, Kostrzewa M,etal. Identification ofFrancisellatularensisby whole-cell matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry: fast, reliable, robust, and cost-effective differentiation on species and subspecies levels [J]. J Clin Microbiol, 2010, 48(4): 1061-1069.

[7]Colquhoun DJ, Larsson P, Duodu S,etal. The FamilyFrancisellaceae[M]. Berlin：Springer Berlin Heidelberg， 2014.

[8]Barns SM, Grow CC, Okinaka RT,etal. Detection of diverse newFrancisella-like bacteria in environmental samples[J]. Appl Environ Microbiol, 2005, 71(9): 5494-5500.

[9]Duodu S, Larsson P, Sj?din A,etal. The distribution ofFrancisella-like bacteria associated with coastal waters in Norway[J]. Microb Ecol, 2012, 64(2): 370-377.

[10]Deetz LE, Ringrose RC. The importance of chitin in the marine environment[J]. Mar Biotechnol, 2011, 13(5): 823-830.

[11]Mahajan UV, Gravgaard J, Turnbull M,etal. Larval exposure toFrancisellatularensisLVS affects fitness of the mosquitoCulexquinquefasciatus[J]. FEMS Microbiol Ecol, 2011, 78(3): 520-530.

[12]Karadenizli A, Forsman M,imek H,etal. Genomic analyses ofFrancisellatularensisstrains confirm disease transmission from drinking water sources, Turkey, 2008, 2009 and 2012[J]. Euro Surveill, 2015, 20(21). pii: 21136.

[13]Gunn JS, Ernst RK. The structure and function ofFrancisellalipopolysaccharide[J]. Ann N Y Acad Sci, 2007, 1105(1): 202-218.

(本文編輯：周萬青，劉群)

Identification and characterization of 10Francisellaphilomiragiastrains

ZHANGLei1,YEDa-ning2,ZHUYan3,CHAIHai-yun1,ZHUQing-yi1,CHENCha4,QUPing-hua4
(1.MicrobiologyLaboratory,GuangzhouKingmedCenterforClinicalLaboratoryCompanyLimited,Guangzhou510330,Guangdong; 2.People′sHospitalofXinfengCounty,Xinfeng511100,Guangdong; 3.DepartmentofClinicalLaboratory,QuanzhouMunicipalFirstHospitalAffiliatedtoFujianMedicalUniversity,Quanzhou362000,Fujian; 4.DepartmentofClinicalLaboratory,GuangdongProvincialHospitalofChineseMedicine,theSecondAffiliatedHospitalofGuangzhouUniversityofChineseMedicine,Guangzhou510006,Guangdong,China)

Objectives To identify and characterize 10 strains ofFrancisellaphilomiragia-like organisms isolated from blood samples and environmental water. Methods The 10 clinical and environmental isolates were identified by traditional morphological examination and biochemical characterization, matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight(MALDI-TOF) mass spectrometry(MS) systems and sequencing based on 16S rRNA gene. The minimum inhibitory concentrations were tested by E-test methods. Results All the 10 isolates were gram-negative coccobacilli appearing tiny and faint counterstain of safranin, negative for urease, nitrate reduction and X and/or V factor requirement, but positive for oxidase and catalase. The isolates grew rapidly in sheep blood agar, chocolate agar and BCYE plate forming white opaque, colorless transparent or gray smooth colonies with about 2-mm diameters, but did not grow in M-H agar and MacConkey agar. The sequencing for 16S rRNA gene indicated that the 10 isolates shared more than 99.6% similarity toFrancisellaphilomiragia, and fell into the same clusters ofFrancisellaphilomiragiaon phylogenetic tree. The MALDI-TOF MS analysis also showed the typical peaks with 6 153 m/z, 5 180 m/z, 7 757 m/z and 9 392 m/z which were similar toFrancisellaphilomiragiaATCC 25015. However, they may be misidentified to beSphingomonaspaucimobilisby using Vitek 2 GN cards,Neisseriacinereaby using Vitek 2 NH cards,Myroidesodoratimimusby using API 20NE strips andHaemophilusby using API NH cards. The results of antimicrobial susceptibility showed that they were all sensitive to chloramphenicol, doxycycline, tetracycline, gentamicin, ofloxacin and ciprofloxacin. Conclusion The 10 isolates could be identified asFrancisellaphilomiragia, so we should pay more attention to the infrequent pathogen for its inactive biochemical reaction and the misidentification by commercial detection systems.

Francisellaphilomiragia; identification; MALDI-TOF MS

國家自然科學基金(31300004)。

張磊，1982年生，女，主管技師，主要從事臨床微生物檢驗。

屈平華，副主任技師，碩士研究生導師，E-mail：ququtdr@163.com。

10.13602/j.cnki.jcls.2017.04.09

R446.5

A

2017-02-20)