殷濤

【摘要】 目的 探討缺血預(yù)處理（IP）與維生素C（Vit C）對大鼠肝缺血再灌注損傷的影響。方法 選擇80只健康雄性SD大鼠， 參照盲選法分成假手術(shù)組（S組）、行缺血再灌注組（IR組）、行缺血預(yù)處理組（IP組）、實施維生素C治療組（Vit C組）， 各20只。制作70%肝缺血再灌注模型， 測谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）及天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶（AST）含量；觀察大鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)變化；檢測肝細胞凋亡指數(shù)（AI）。結(jié)果 IR組、Vit C組于各個灌注時間點血清中ALT、AST含量均明顯高于S組， 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。在電子高倍顯微鏡下， 可發(fā)現(xiàn)S組細胞中線粒體按照一定規(guī)律進行排列， 可極為清楚的看見細胞核的雙重核膜結(jié)構(gòu)， 且內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未表現(xiàn)出異常擴張， 以較為規(guī)則的方式進行排布， 在嵴部未發(fā)現(xiàn)明顯腫脹。結(jié)論 IP及Vit C對肝臟缺血再灌注損傷有顯著的保護作用， 相比之下Vit C效果更好。

【關(guān)鍵詞】 再灌注損傷；缺血預(yù)處理；維生素C；大鼠

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.31.126

肝臟缺血再灌注損傷（HIRI）多出現(xiàn)在肝臟移植手術(shù)、常規(guī)肝臟手術(shù)以及其他創(chuàng)傷性較大手術(shù)而引發(fā)的缺血性休克， 同時因該癥狀的影響， 多數(shù)行肝臟類手術(shù)患者， 術(shù)后肝臟功能均會受到不停程度損傷， 嚴重時出現(xiàn)肝功能衰竭[1， 2]。本院主要針對維生素C的抗氧化作用對HIRI保護作用的實際效果進行探索， 望能為臨床對于HIRI的治療與預(yù)防控制方案的完善發(fā)揮作用?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1. 1 材料 選擇健康雄性SD大鼠80只， 由赤峰學(xué)院實驗動物中心提供， 所有大鼠的喂養(yǎng)方式均相同， 體重200～250 g， 平均體重（231.12±10.38）g。實驗中所用維生素C主要由陜西立眾制藥有限公司生產(chǎn)（國藥準字H20046703）。脂質(zhì)氧化（MDA）檢測試劑盒、生化試劑SOD均來自南京生物工程研究院， 細胞凋亡試劑盒（POD）則主要從羅氏公司購置。本次研究中所有試劑均符合衛(wèi)計委檢測標準。依照盲選法， 隨機分成S組、IP組、Vit C組、IR組， 各20只， 每組在1、3、6、12 h時間段同時進行再灌注。

1. 2 方法 運用Pringles法實施肝臟缺血再灌注模型的建立， 對大鼠腹腔注射麻醉劑實施麻醉， 依照慣用方式對皮膚進行消毒處理， 于大鼠劍突下方1 cm左右切開， 將肝臟進行游離， 同時將肝動、靜脈加以分離。隨即使用無創(chuàng)血管夾將主要供血動脈夾住30 min左右， 使得肝臟內(nèi)無血液供應(yīng)。然后采用再灌注的方式恢復(fù)肝臟內(nèi)血流。假手術(shù)組（即S組）單進行麻醉連同肝臟血管分離操作， 不進行血管夾住。行維生素C治療組（Vit C組）， 在使用血管夾夾住血管前5 min左右， 從大鼠尾部注射6 ml/kg維生素C。行缺血預(yù)處理組（IP組）則需要將肝臟左右動脈以及門靜脈和膽總管同時夾住保持肝臟缺血約5 min， 之后保持血管暢通， 放血流大約5 min， 按照此種操作方式共同進行3次， 后續(xù)操作與Vit C組基本相同。行缺血再灌注組（IR組）則在夾住血管前5 min后， 于背部注射生理鹽水6 ml/kg， 其他操作方式與Vit C組處理相同[3]。

1. 3 觀察指標 取各組處理后大鼠使用全自動生化分析儀對血清中ALT、AST含量進行檢測。在電鏡協(xié)助下， 將使用戊二醛固定的肝臟細胞組織取出， 隨即進行脫水、浸透、包埋等處理， 然后進行觀察。針對原位細胞凋亡情況， 則主要使用TUNEL法加以檢測， 在電子顯微鏡下， 若細胞核中部分部位表現(xiàn)為紫黑色， 則為陽性細胞， 觀察組需在200倍視野下依照隨機原則， 選取5塊區(qū)域進行觀察。AI=陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

1. 4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差（ x-±s）表示， 采用t檢驗；計數(shù)資料以率（%）表示， 采用χ2 檢驗。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 肝臟生化酶學(xué)的檢測情況 Vit C組1、3、6、12 h的ALT、AST分別為（287.14±1.45）、（315.54±1.64）、（315.47± 1.64）、（308.15±1.68）IU/L和（624.25±1.67）、（674.15±1.71）、（684.25±1.67）、（698.15±1.26）IU/L， IR組分別為（675.14± 1.44）、（824.11±1.67）、（814.34±1.64）、（810.57±1.57）IU/L和

（958.54±1.34）、（962.14±1.24）、（976.28±1.24）、（1011.47±

1.57）IU/L， S組分別為（79.54±1.94）、（82.74±1.25）、（86.45± 1.64）、（79.55±1.29）IU/L和（241.64±1.64）、（243.25±1.26）、（286.18±1.57）、（284.15±1.24）IU/L， IR組、Vit C組各灌注時間點血清中ALT、AST含量均明顯高于S組， 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

2. 2 電鏡觀察肝細胞超微結(jié)構(gòu)變化 在電子高倍顯微鏡下， 可發(fā)現(xiàn)S組細胞中線粒體按照一定規(guī)律進行排列， 可極為清楚的看見細胞核的雙重核膜結(jié)構(gòu)， 且內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未表現(xiàn)出異常擴張， 以較為規(guī)則的方式進行排布， 在嵴部未發(fā)現(xiàn)明顯腫脹。IR組細胞核膜基本消失， 無法對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的擴張情況進行清楚觀察， 且線粒體表現(xiàn)為嚴重腫脹擴張， 可發(fā)現(xiàn)部分空泡存在明顯變性。

2. 3 肝細胞凋亡情況 S組在各個時間點進行灌注時， 僅少數(shù)細胞出現(xiàn)凋亡， 但其他三組灌注時， 細胞凋亡數(shù)量明顯高于S組（P<0.05）。同時各組AI伴隨灌注時間的增加， 其含量也呈現(xiàn)上升的趨勢。

3 討論

HIRI的發(fā)生機制十分復(fù)雜， 結(jié)合臨床有關(guān)研究可發(fā)現(xiàn)， 細胞凋亡也可歸屬到肝臟缺血且在灌注期間出現(xiàn)細胞死亡的范圍內(nèi)。在本次研究中， 大鼠肝表現(xiàn)為ALT明顯升高， 同時肝細胞內(nèi)的超微結(jié)構(gòu)也都有明顯損傷。

多細胞生物體多采用細胞凋亡的方式來維持自身組織以及細胞之間增殖與死亡的相互平衡， 因此細胞凋亡為自身基因掌控的自主細胞死亡。近幾年， 有關(guān)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)， 體內(nèi)氧自由基含量超過正常水平時， 將增加細胞凋亡。在本次研究中IR組、IP組、Vit C 組， 細胞凋亡數(shù)明顯較S組高， 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）， 同時各組AI伴隨灌注時間的增加， 其含量也呈現(xiàn)上升的趨勢。

維生素C是細胞外液中最有效的水溶性抗氧化劑， 在人體內(nèi)可起到降低脂質(zhì)過氧化反應(yīng)強度的作用。本次實驗發(fā)現(xiàn)， 使用維生素C可有效抑制缺血在灌注過程中氧自由基的產(chǎn)生， 將對肝臟組織的損傷降至最小， 其總體效果優(yōu)于行缺血預(yù)處理。

參考文獻

[1] 王安生， 劉學(xué)剛， 王康武， 等. bFGF、MMP-2在肺血減少型先天性心臟病幼豬動物模型遠端肺血管發(fā)育中的作用. 中華解剖與臨床雜志， 2011， 16（5）：404-408.

[2] 周克斌， 趙留存， 楊勇， 等. 放療對前尿道狹窄模型兔iNOs和MMP-2的影響. 現(xiàn)代泌尿外科雜志， 2012， 17（1）：32-35.

[3] 徐振宇， 高建平， 孫穎浩， 等. 非甾體類抗炎藥對前列腺癌動物模型中RECK基因表達的調(diào)控. 江蘇醫(yī)藥， 2010， 36（22）：2666-2668.

[收稿日期：2016-10-25]