于群 張惠 安磊 楊浩宇

摘要[目的]研究苦瓜子衣色素蛋白的最佳提取工藝及其抗氧化能力，為天然色素的開發(fā)應(yīng)用提供參考。[方法]采用乙酸乙酯法提取苦瓜子衣色素，雙水相法提取苦瓜子衣色素蛋白，經(jīng)DEAE-52陰離子層析、Sephadex G-100凝膠柱層析得到純化蛋白，參考芬頓法測定其抗氧化能力。[結(jié)果]確定苦瓜子衣色素提取的最佳條件為溫度50 ℃，料液比1〖DK〗∶40（g〖DK〗∶mL），時(shí)間30 min，該條件下提取率最高，為45.54%。雙水相法中硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為35%，聚乙二醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%，提取得到苦瓜子衣色素粗蛋白，經(jīng)過層析得到分子量為74.10 kD的純化蛋白?？寡趸囼?yàn)表明，純化苦瓜子衣色素蛋白具有抗氧化能力，且隨著質(zhì)量濃度的增加抗氧化性增強(qiáng)。[結(jié)論]該試驗(yàn)采用新興的雙水相法提取苦瓜子衣色素蛋白，簡化了提取工藝，減少了蛋白質(zhì)的流失；抗氧化試驗(yàn)為從天然色素中制備高品質(zhì)無污染的抗氧化制劑奠定了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞苦瓜子衣色素蛋白；分離純化；柱層析；抗氧化作用

中圖分類號(hào)S642.5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2017）05-0054-03

Abstract[Objective] To study the best condition for the extraction and antioxidant activity of subskin pigment from Mordica charantia， to provide a reference for the development and application of natural pigment. [Method] Extracted Momordica charantia subskin pigment with ethyl acetate， extracted the protein with aqueous twophase system， purified it by DEAE52 anion chromatography and Sephadex G100 gel column chromatography， determined the antioxidant effects by Fenton method. [Result] The best condition revealed that： temperature 50 ℃， proportion of solid to liquid is 1〖DK〗∶40 （g〖DK〗∶mL）， time 30 min， the extraction rate up to 45.54%. The condition of aqueous twophase system was： 35% ammonium sulfate and polyethylene glycol of 30%， purified the protein with molecular weight 74.10 kD. The antioxidant tests indicated that Momordica charantia subskin pigment protein had antioxidant effects and their eliminate capacity increased with the concentration of solution increased. [Conclusion] This test used a new aqueous twophase system to extract the protein， simplified the extraction process and reduced the loss of protein. The antioxidant test provided a theoretical basis for the preparation of high quality and non polluting antioxidant preparation from natural pigments.

Key wordsMomordica charantia subskin pigment protein；Separation and purification；Column chromatography；Antioxidant

基金項(xiàng)目寧夏職業(yè)技術(shù)學(xué)院（寧夏廣播電視大學(xué)）科研發(fā)展基金項(xiàng)目。

作者簡介于群（1986—），女，山東青島人，助教，碩士，從事生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究。

收稿日期2016-12-13

近年來，隨著人們對(duì)合成色素毒性問題的認(rèn)識(shí)及各國對(duì)使用合成色素種類的限制增多，消費(fèi)者對(duì)天然色素的需求急劇增加，人們的關(guān)注點(diǎn)逐漸轉(zhuǎn)移到天然色素的開發(fā)和應(yīng)用上。天然食用色素不僅可為食品著色，有的品種由于保留了植物體內(nèi)的多種天然活性物質(zhì)，如維生素、氨基酸、核苷酸、小分子活性肽、芳香物質(zhì)及某些必需元素等[1]，還兼有營養(yǎng)保健功能，因此天然色素的開發(fā)具有巨大潛力和研究價(jià)值?？喙希∕onlordica charantia L.）為葫蘆科苦瓜屬一年生蔓性草本植物，營養(yǎng)豐富，含有豐富的蛋白質(zhì)，具有抗氧化、抑菌、抗腫瘤、抗HIV活性、降低血糖、調(diào)節(jié)免疫功能等作用[2]。王先遠(yuǎn)等[3]研究了苦瓜皂苷的抗氧化作用；傅明輝[4]對(duì)苦瓜果肉及籽提取液的抗氧化活性進(jìn)行了探討，發(fā)現(xiàn)苦瓜果肉及籽的提取液均具有較強(qiáng)的抗氧化活性。成熟苦瓜子衣色素作為一種重要的天然植物色素，具有潛在研究價(jià)值。筆者在借鑒國內(nèi)外最新研究成果的基礎(chǔ)上，以苦瓜子衣為研究材料，在確定色素最佳提取條件的基礎(chǔ)上，對(duì)色素的穩(wěn)定性及基本成分進(jìn)行定性分析的同時(shí)，分離純化出與色素形成相關(guān)聯(lián)的色素蛋白并研究其抗氧化作用。

1材料與方法

1.1材料

供試原料為新鮮老齡苦瓜。

1.2方法

1.2.1原材料的預(yù)處理。

將老齡苦瓜剖開，取出里面紅色的子衣，用組織搗碎機(jī)打成勻漿，放入冰箱保藏備用。

1.2.2最佳提取工藝條件的篩選。

選擇對(duì)有機(jī)溶劑萃取苦瓜子衣色素效果影響較大的3個(gè)因素：萃取時(shí)間（A）、萃取溫度（B）、料液比（C），并以乙酸乙酯為萃取劑，以苦瓜子衣色素提取率為指標(biāo)，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)。

1.2.3雙水相體系的制備。

固定聚乙二醇4000質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%，不添加無機(jī)鹽，以不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的硫酸銨（25%、30%、35%、40%、45%）組成雙水相體系，加入6 g苦瓜子衣，pH調(diào)至7.0，4 ℃萃取4 h，測定蛋白質(zhì)的分配系數(shù)及相比和萃取率。

固定硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為35%，不添加無機(jī)鹽，以不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的聚乙二醇4000（25%、30%、35%、40%、45%）組成雙水相體系，加入6 g苦瓜子衣，pH調(diào)至7.0，4 ℃萃取4 h，測定蛋白質(zhì)的分配系數(shù)及相比和萃取率。

1.2.4苦瓜子衣蛋白提取。

分別量取100 mL 30%聚乙二醇4000溶液和100 mL 35%硫酸銨溶液于錐形瓶中，加入6 g苦瓜子衣，混勻后，調(diào)節(jié)溶液pH為7.0，4 ℃攪拌提取4 h，10 000 r/min離心20 min，得苦瓜子衣色素蛋白粗提液。用聚乙二醇6000包埋透析袋進(jìn)行濃縮至1.5 mL，裝入離心管中冷凍備用。

1.2.5苦瓜子衣色素蛋白的純化。

1.2.5.1DEAE纖維素柱（10 mm×300 mm）層析純化苦瓜子衣色素蛋白。

將苦瓜子衣色素粗蛋白樣品用PBS緩沖液（pH 8.0，0.05 mol/L）溶解，使其濃度為1 mg/mL，4 ℃、10 000 r/min離心20 min，去除不溶物，并將上清液加載于DEAE纖維素柱上，用0.02 mol/L磷酸緩沖液（pH 8.0）洗柱，進(jìn)行0～0.6 mol/L NaCl的梯度洗脫，以1 mL/min的流速洗滌，經(jīng)紫外儀檢測，收集洗脫液，4 ℃濃縮。

1.2.5.2

Sephadex G-100柱（10 mm×300 mm）層析純化苦瓜子衣色素蛋白。

將DEAE-52柱層析中收集的蛋白洗脫液上Sephadex G-100柱，用PBS緩沖液（pH 8.0，0.05 mol/L）平衡洗脫，分管收集，流速控制在1 mL/min，每管收集1 mL，在波長280 nm處檢測吸光度。

1.2.6

苦瓜子衣色素純化蛋白的SDS-PAGE電泳。

聚丙烯酰胺凝膠濃度：分離膠12.5%，濃縮膠2.5%。加樣量35 μL/槽。室溫，恒流25 mA，電泳6～7 h?？捡R斯亮藍(lán)（CBB-R250）染色，透射照相記錄。

1.2.7

苦瓜子衣色素純化蛋白的抗氧化試驗(yàn)（參考Fenton法）[6-7]。

在試管中加入0.1 mL 0.6 mmol/L的H2O2、0.1 mL 0.6 mmol/L的水楊酸溶液、0.1 mL 0.6 mmol/L FeSO4溶液，加入后立即混勻。再向其中分別加入0.1 mL苦瓜子衣色素純化蛋白和粗蛋白溶液（濃度分別為0.5、1.0、15、2.0、30、4.0 mg/mL）混勻。以蒸餾水為參比，與試劑空白液比較。在波長510 nm處測2種蛋白不同濃度的吸光度，計(jì)算被測物對(duì)羥自由基的清除率。

羥自由基清除率=（A1-Ax）/A1×100%

式中，A1為空白對(duì)照液的吸光度；Ax為加入提取液后的吸光度。

2結(jié)果與分析

2.1最佳提取工藝條件的篩選

由表2可知，A1B3C3為最佳組合，即萃取溫度為50 ℃、料液比為1〖DK〗∶40、萃取時(shí)間為30 min時(shí)，苦瓜子衣色素的提取率最高，為45.54%。此條件為苦瓜子衣色素提取的最佳工藝條件。

2.2雙水相體系的制備

表3顯示，當(dāng)聚乙二醇4000的量固定時(shí)，一定范圍內(nèi)隨著硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，蛋白質(zhì)的回收率逐漸上升；當(dāng)硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于35%時(shí)，蛋白質(zhì)回

收率又逐漸下降。硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)過高，不僅會(huì)破壞酶表面的水化層，使蛋白發(fā)生鹽析，蛋白的萃取率下降；而且擾亂雙水相系統(tǒng)，改變各相中成相物質(zhì)的組成和相體積比[8]。綜合考慮，確定硫酸銨的質(zhì)量分?jǐn)?shù) 35%為佳。

表4顯示，當(dāng)硫酸銨的量固定時(shí)，隨著聚乙二醇4000質(zhì)

量分?jǐn)?shù)的增加，蛋白質(zhì)回收率先增大后減小，并且在聚乙二醇4000質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%時(shí)，蛋白質(zhì)的回收率達(dá)到最佳值。從分配理論

上解釋，隨著聚乙二醇4000量增加，黏度增大，阻止相間分子轉(zhuǎn)移的能力增加，相界面張力亦增加。當(dāng)聚乙二醇4000用量較低時(shí)，硫酸銨的鹽析作用起主要作用，使蛋白質(zhì)大部分分布在下相中[9]。

2.3苦瓜子衣色素蛋白的純化

苦瓜子衣色素粗蛋白樣品上DEAE陰離子交換柱，共得到2個(gè)洗脫峰。進(jìn)一步純化目的蛋白，將洗脫液繼續(xù)上Sephadex G-100凝膠柱，共得到1個(gè)吸收峰（圖1）。進(jìn)行SDS-PAGE檢測，如圖2所示，電泳結(jié)果顯示僅為1條帶，說明其已經(jīng)達(dá)到電泳純，分子量為7410 kD。

2.4苦瓜子衣色素純化蛋白的抗氧化作用

由表5可知，苦瓜子衣純化蛋白和粗蛋白均具有抗氧化能力，其清除羥自由基的能力隨著質(zhì)量濃度的增加抗氧化性增強(qiáng)，但苦瓜子衣純化蛋白在同等質(zhì)量濃度下均稍弱于粗蛋白，原因可能是粗蛋白中含多種具抗氧化活性的蛋白共同產(chǎn)生作用。

3結(jié)論與討論

該試驗(yàn)采用傳統(tǒng)的乙酸乙酯法提取苦瓜子衣色素，確定苦瓜子衣色素提取的最佳條件。采用新興的雙水相法提取苦瓜子衣色素蛋白，為苦瓜子衣色素蛋白的提取開創(chuàng)新的途徑。雙水相法分離不同物質(zhì)，系統(tǒng)中的聚乙二醇、硫酸銨的質(zhì)量分?jǐn)?shù)、pH、鹽離子濃度等均不相同[10]，此法減少了蛋白的流失，且特異性強(qiáng)，有機(jī)試劑用量少，不必進(jìn)行脫鹽處理，簡化了試驗(yàn)操作。

該試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，苦瓜子衣色素粗蛋白和純化蛋白具有不同程度的抗氧化能力，苦瓜子衣色素蛋白粗提液中成分復(fù)雜，可能含有多種抗氧化能力的蛋白，因此苦瓜子衣色素粗蛋白的抗氧化活性大于純化蛋白?？喙献右律氐鞍资且环N良好的、無毒害、純天然的抗氧化物質(zhì)，對(duì)其進(jìn)行深入研究將為大規(guī)模生產(chǎn)抗氧化制劑奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

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