高祥剛　鮑相渤　高美玲

摘要[目的] 研究中華絨螯蟹經(jīng)過多年的人工養(yǎng)殖、跨流域引種和增殖放流等活動(dòng)可能會(huì)對其遺傳特性造成的影響。[方法] 基于下一代GBS測序技術(shù)，利用SNP標(biāo)記對遼河家系、遼河野生、長江群體、海南群體、黃河群體進(jìn)行遺傳特征分析。[結(jié)果] 經(jīng)過條件為測序深度4×、Miss0.5、次要等位基因頻率（MAF）>0.05 的過濾后，共獲得 652 746個(gè)高質(zhì)量的 SNP 位點(diǎn)用于群體的遺傳分析，各群體平均觀測雜合度（Ho）為0.084 4～0.124 9，平均期望雜合度（He）為0.097 4～0.200 3，群體平均π值（Pi）為0.158 3～0.254 4，群體Fi的平均測量值（Fis）為0.054 2～0.238 43。兩兩群體間遺傳分化指數(shù) Fst值結(jié)合系統(tǒng)發(fā)生樹，可以看出，長江群體與海南群體的遺傳距離較近，分化較小，表示海南的中華絨螯蟹苗種可能來自長江流域。[結(jié)論] 該研究揭示了不同水系中華絨螯蟹的遺傳差異，探討了其遺傳多樣性水平，為中華絨鰲蟹資源的合理開發(fā)利用與保護(hù)提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞中華絨螯蟹； GBS；SNP；遺傳多樣性；種群結(jié)構(gòu)

中圖分類號(hào)S917.4文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A文章編號(hào)0517-6611（2017）36-0080-03

Abstract[Objective] To assess the genetic diversity and population structure of the wild and cultured E.sinensis populations （i.e.）. [Method] Based on GenotypingbySequencing technology，genetic character of Liaohe pondreared population （LC），Liaohe wild population （LW），Changjiang pondreared population （CJ），Hainan pondreared population （HN），Huanghe pondreared population （HH） was analyzed by using SNP marker.[Result] After screening with parameter of dp4，miss0.5 and minor alleles frequency （MAF）>0.05，a total of high quality 652 746 SNP sites were retained to analyze genetic character of population.The mean observed heterozygosity （Ho） was from 0.084 4 to 0.124 9，the mean expected heterozygosity （He） was from 0.097 4 to 0.200 3，the mean nucleotide diversity （Pi） was from 0.158 3 to 0.254 4，the average pairwise inbreeding coefficient Fis ranged from 0.054 2 to 0.238 43.Both the Fstatistic （Fst） among populations and phylogenetic analysis suggested that the CJ population had a very close relationship with HN population.It may indicate that the baby crabs of Hainan Province derived from Changjiang river.[Conclusion] The information may be beneficial for biodiversity conservation and management of E.sinensis.

Key wordsEriocheir sinensis； GBS；SNP； genetic diversity；population structure

中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）俗稱河蟹、毛蟹，在動(dòng)物分類地位上隸屬于節(jié)肢動(dòng)物門甲殼綱十足目爬行亞目方蟹科絨螯蟹屬[1-2] ，屬高等甲殼動(dòng)物。該蟹廣泛分布于遼河、黃河、長江、甌江和閩江等我國沿海各大水系，其肉味鮮美，營養(yǎng)豐富[3]。自 20 世紀(jì) 80 年代以來，中華絨螯蟹養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速，目前已成為水產(chǎn)養(yǎng)殖支柱產(chǎn)業(yè)之一[4]。經(jīng)過多年的人工養(yǎng)殖、跨流域引種和增殖放流等生產(chǎn)活動(dòng)，已造成不同水系種質(zhì)資源嚴(yán)重混雜[5-6]。因此，為深入了解該蟹不同地理群體的種質(zhì)差異和遺傳特征，更有效保護(hù)和管理利用中華絨螯蟹資源，對不同地理群體中華絨螯蟹的遺傳多樣性和群體遺傳結(jié)構(gòu)研究勢在必行。

近年來，隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，基因分型的成本持續(xù)降低，GBS（Genotyping-by-sequencing） 技術(shù)作為第2代深度測序基礎(chǔ)上發(fā)展起來的簡化基因組測序技術(shù)，通過采用酶切加標(biāo)簽的方法，使多樣本高通量平行測序得以實(shí)現(xiàn)。這不僅大大降低了基因測序的成本，也使對大樣本全基因組的基因分型成為可能，對深入了解種質(zhì)資源的遺傳背景和系統(tǒng)演化具有重要意義[7]。同時(shí)， GBS 獲得的短讀序列可通過有參或無參基因組的形式進(jìn)行拼接組裝，進(jìn)而獲得高密度的 SNP 標(biāo)記，利用這些 SNP標(biāo)記可進(jìn)行遺傳圖譜構(gòu)建、加密，基因組的輔助組裝，全基因組關(guān)聯(lián)分析等相關(guān)研究。目前，GBS 技術(shù)作為基因分型的重要手段，已經(jīng)在遺傳多樣性研究、遺傳圖譜構(gòu)建、種質(zhì)鑒定及品種識(shí)別等領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用[7-10]。

采用GBS測序技術(shù)對中華絨螯蟹5個(gè)群體的遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)展開研究，以揭示不同中華絨螯蟹地理群體的遺傳差異，探討其遺傳多樣性水平，為該蟹種質(zhì)資源的合理開發(fā)利用與有效保護(hù)提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

試驗(yàn)分析的群體為5個(gè)，均為（2齡）發(fā)育成熟個(gè)體，分別是取自盤錦遼河口的野生中華絨螯蟹群體、培育的遼河家系群體、采集自長江南通的養(yǎng)殖群體、采自黃河口附近東營的養(yǎng)殖群體，以及購買自?？诤ｕr市場的海南養(yǎng)殖群體（表1）。解剖出體壁肌肉保存于-40 ℃冰箱備用。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1DNA提取和 GBS文庫構(gòu)建。

對采集的肌肉組織樣品，利用天根生化科技（北京）有限公司的基因組 DNA 提取試劑盒（TIANamp Genomic DNA Kit）提取DNA。使用紫外分光光度計(jì)（Nanodrop，Thermo Scientific），在 260和280 nm 處分別測定 DNA 的吸光值，并通過 1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測 DNA 的質(zhì)量。

提取的樣品 DNA 送上海派森諾生物科技股份有限公司進(jìn)行 DNA 質(zhì)檢、建庫和測序，采用限制性內(nèi)切酶（HindⅢ+Bfal）對全基因組 DNA 進(jìn)行完全酶切，回收插入片段大小在220～450 bp 之間的酶切片段，按照 Double Digest Genotyping-by-Sequencing （dd-GBS） 的方式進(jìn)行建庫，利用第2代測序技術(shù)（Next-Generation Sequencing，NGS），基于 Illumina Hiseq測序平臺(tái)，對文庫進(jìn)行雙末端（Paired-end，PE）150 bp的測序。

1.2.2單核苷酸多態(tài)性（SNP）鑒定，

每條測序數(shù)據(jù)按照條碼劃分到對應(yīng)的樣本中，對每條序列進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)控篩選，去除原始測序序列中的接頭序列和低質(zhì)量的短讀序列，包括單端測序中含有的 N 數(shù)量超過該條序列長度的 10%，或者單端測序中低質(zhì)量（Q≤5）堿基數(shù)超過該條序列長度 50%的序列。SNP 檢測采用 Samtools 軟件進(jìn)行，對齊的匹配文件用 Samtools 軟件轉(zhuǎn)換為 BAM 文件后進(jìn)行變異調(diào)用，Samtools 收集 BAM 文件中的匯總信息，計(jì)算可能基因型的似然值，再利用 Bcftools 應(yīng)用先驗(yàn)值進(jìn)行變異調(diào)用，采用貝葉斯模型檢測群體中的多態(tài)性位點(diǎn)獲得 VCFs 文件。

1.2.3遺傳數(shù)據(jù)分析。對5個(gè)群體的樣本，采用 stacks 程序包中的 populations 命令進(jìn)行群體遺傳多樣性各參數(shù)、Fst值計(jì)算，分析各群體的遺傳多樣性水平、群體間的遺傳分化程度[11-12]。采用 FastTree 軟件中的 ML 算法，利用P-distance 計(jì)算樣品間的遺傳距離，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。建樹完成后，對系統(tǒng)發(fā)育樹分支的可靠性進(jìn)行驗(yàn)證（bootstrap， 1000 replications）。

2結(jié)果與分析

2.1測序質(zhì)量GBS 測序得到的原始圖像數(shù)據(jù)文件經(jīng)堿基識(shí)別分析轉(zhuǎn)化為原始測序序列，24個(gè)中華絨螯蟹樣本的總測序數(shù)據(jù)量為44.7 Gb，去除低質(zhì)量的序列后，產(chǎn)生的高質(zhì)量序列數(shù)據(jù)量為 38.5 Gb，平均每個(gè)樣本數(shù)據(jù)量為 1 604 Mb。測序質(zhì)量較高（Q20≥94.67%，Q30≥85.38%），GC 分布正常，測序的峰值在Q40左右，測序質(zhì)量較高。經(jīng)過條件為測序深度4×、Miss0.5、次要等位基因頻率（MAF）>0.05 的過濾后，最后共獲得 652 746個(gè)高質(zhì)量的 SNP 位點(diǎn)用于群體的遺傳分析。

2.2群體遺傳多樣性分析

采用 stacks 程序包獲得各群體的遺傳多樣性結(jié)果，遼河家系、遼河野生、長江群體、海南群體、黃河群體的平均觀測雜合度（Ho）分別為：0.109 6、0.122 2、0.084 4、0.124 9、0.110 5，平均期望雜合度（He）分別為：0.145 0、0.097 4、0.172 5、0.190 7、0.200 3，群體平均π值（Pi）分別為：0.191 1、0.158 3、0.203 8、0.241 3、0.254 4，群體Fi的平均測量值（Fis）分別是：0.125 9、0.054 2、0.234 8、0.193 7、0.238 4（表2）。

2.3群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

兩兩群體間遺傳分化指數(shù) Fst 值顯示，遼河家系與遼河野生群體之間的Fst 值較大，長江群體與海南群體之間的Fst 值較小。各群體間的Fst 值差異不顯著，為0.134 375～0.278 688。由ML 系統(tǒng)發(fā)生樹（圖1）可以看出，遼河家系首先和遼河的野生中華絨螯蟹群體聚在一起，長江群體和海南群體聚在一起，最后這4個(gè)群體再與黃河群體聚在一起。

3結(jié)論與討論

基于GBS技術(shù)的遼河家系、遼河野生、長江群體、海南群體、黃河群體5個(gè)群體的SNP遺傳多樣性，其Ho為0.084 4～0.124 9， He為0.097 4～0.200 3， Pi為0.158 3～0.254 4。而閆龍等[6] 利用線粒體D_Loop控制區(qū)基因?qū)θ∽员P錦、丹東、南京、墾利的野生群體的遺傳多樣性分析，表明其Pi在0.010～0.019，其遺傳多樣性處于較高的水平；劉青等[13]采用微衛(wèi)星標(biāo)記分析取自長江、遼河、黃河的6個(gè)中華絨螯蟹群體遺傳水平，均表現(xiàn)出較高的遺傳雜合度水平（Ho=0.702～0.744）；熊良偉等[14] 利用微衛(wèi)星標(biāo)記分析中華絨螯蟹興化、盤錦、宣城養(yǎng)殖群體的遺傳水平，發(fā)現(xiàn)其Ho為 0.70～0.75； He為 0.87～0.90，該蟹養(yǎng)殖群體也具有較高的遺傳多樣性水平。該研究與閆龍等[6]相比，群體平均π值（Pi）要高一個(gè)數(shù)量級(jí)，與劉青等[13]、熊良偉等[14]的微衛(wèi)星分析結(jié)果相比，則遺傳多樣性水平要低很多，而產(chǎn)生這樣的分析結(jié)果可能是分析方法不同造成的，該研究采用的第2代高通量測序技術(shù)，產(chǎn)生的數(shù)據(jù)能更真實(shí)，誤差更小。

當(dāng)群體內(nèi)觀測雜合度小于期望雜合度，同時(shí) Fis 為正值，則表示群體內(nèi)近交程度較為嚴(yán)重[15]，該研究的 5個(gè)群體的 Fis均為正值，除遼河野生群體的Ho>He，其他群體的Ho群體的遺傳分化值數(shù)（Fst）能揭示種群間的遺傳分化程度，F(xiàn)st 值為0～0.05，群體的遺傳分化較弱；Fst 值為0.05～0.15時(shí)，遺傳分化水平中等；Fst 值大于 0.15 時(shí)，遺傳分化較大[16]。該研究的幾個(gè)群體間，除了長江群體與海南群體、黃河群體的 Fst值分別為：0.134 375、0.139 275，小于0.15，說明長江群體與這2個(gè)群間的遺傳分化較小；其余群體間的Fst 值均大于 0.15，說明各群間的遺傳分化較大。閆龍等[6]基于線粒體控制區(qū)對4個(gè)野生群體的遺傳多樣性分析，兩兩群體間遺傳分化指數(shù) Fst值顯示在0.020 00～0.129 09。熊良偉等[14]對4個(gè)中華絨螯蟹群體在 10 個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)上平

均配對遺傳分化系數(shù)統(tǒng)計(jì)量 Fst介于 0.012 3～0.020 7，處于低等程度分化，該研究與它們相比，遺傳分化較高。結(jié)合圖1的系統(tǒng)發(fā)生樹，可以看出，長江群體與海南群體的遺傳距離較近，分化較小，表明海南的中華絨螯蟹苗種可能來自長江流域。黃河口收集的中華絨螯蟹養(yǎng)殖群體與長江流域的群體遺傳分化也較近，表示其苗種有可能來自南方。Sui等[17] 和Chang等[18]運(yùn)用微衛(wèi)星對中華絨螯蟹群體遺傳學(xué)度研究表明，遼河水系與黃河水系、長江水系中華絨螯蟹群體之間存在較顯著的遺傳差異，而黃河水系與長江水系中華絨螯蟹群體間遺傳差異不明顯，該研究結(jié)果與上述研究結(jié)果相近。

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