謝鈺珍　覃鴻妮　張宇

摘要[目的]獲得高質(zhì)量、高產(chǎn)量并能滿足轉(zhuǎn)錄組測序要求的大豆根總RNA。[方法]比較分析了Trizol法、CTAB-LiCl法和試劑盒法的提取效果。[結(jié)果]3種方法均能從大豆根中提取出總RNA。但與Trizol法、CTAB法相比，試劑盒法提取的大豆根總RNA純度高、完整性好，平均濃度達413.9 ng/μL，A260/A280≈2.14，A260/A230≈2.10，方法可重復(fù)性好。[結(jié)論]試劑盒法提取的RNA滿足轉(zhuǎn)錄組測序的質(zhì)量要求，可進行后續(xù)的轉(zhuǎn)錄組測序和其他分子生物學(xué)相關(guān)研究工作。

關(guān)鍵詞大豆；根；總RNA；轉(zhuǎn)錄組測序；提取方法

中圖分類號S188文獻標識碼

A文章編號0517-6611（2017）36-0137-03

Abstract[Objective] To obtain total RNA from soybean roots with high quality，high yield and to meet the transcription group sequencing requirements.[Method]Three extracting effects were compared，including Trizol reagent，CTABLiCl method and Kit method.[Result] All three methods can extract total RNA from soybean.However，the extraction kit was the best with high purity and integrity RNA.The average concentration was 413.9 ng/μL，A260/A280 was approximately 2.14，A260/A230 was 2.10 by using extraction kit，which was repeatable.[Conclusion]The RNA extracted by Kit method meets the quality requirements for transcriptome sequencing and can be used for subsequent RNAseq and other molecular biologyrelated studies.

Key wordsSoybean；Root；Total RNA；RNAseq；Extraction method

從植物組織中提取質(zhì)量高、純度高、完整性好的RNA是植物分子生物學(xué)研究的基本技術(shù)之一。近年來，高通量測序技術(shù)得到突飛猛進的發(fā)展，在此基礎(chǔ)上，RNA-seq技術(shù)也越來越受到人們的關(guān)注，獲取高質(zhì)量的總RNA成為測序成功的基石[1]。大豆作為常見豆科植物，其多酚、多糖類物質(zhì)含量豐富，RNase活性高，RNA提取難度大，盡管目前關(guān)于大豆總RNA提取的研究較多，但通過這些方法提取的RNA只適用于后期的RT-PCR等試驗，直接用于轉(zhuǎn)錄組測序少見報道[2-6]。該試驗以大豆根為材料，選取3種常用方法提取其總RNA，根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳、紫外分光光度計以及Agilent 2100檢測結(jié)果，比較分析各方法的提取質(zhì)量，以期找到一種能滿足轉(zhuǎn)錄測序要求的大豆根總RNA的提取方法，為轉(zhuǎn)錄組測序及相關(guān)分子生物學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料采集大豆的幼嫩根尖，液氮冷卻后，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2主要試劑及耗材CTAB提取液：2% CTAB，2% PVP，100 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0），25 mmol/L EDTA，2 mol/L NaCl，β-巰基乙醇（使用前加入）；Trizol（美國Life公司）；Aidlab EASYspin Plus多糖多酚/復(fù)雜植物RNA快速提取試劑盒（北京Aidlab公司）；SSTE buffer：1 mol/L NaCl，0.5% SDS，10 mmol/L EDTA，DEPC水；10×DNase assay buffer（美國USB公司）、RNase inhibitor（美國Omega公司）、DNaseⅠ（德國QIAGEN公司）；無水乙醇、氯仿、異丙醇、75%乙醇、4 mol/L LiCl、3 mol/L NaAc、DEPC水；1.5 mL無核酸酶離心管（美國Axygen公司）。

1.3大豆根總RNA的提取

1.3.1CTAB-LiCl法。

65 ℃預(yù)熱15 mL CTAB提取液（加入300 μL β-巰基乙醇）；取100 mg冷凍（-80 ℃）的大豆根組織，迅速放入液氮研磨至粉末狀；

轉(zhuǎn)移粉末至1.5 mL離心管中，加入700 μL預(yù)熱過的CTAB提取液，渦旋混勻，65 ℃溫浴15 min；加入等體積氯仿/異戊醇（24∶1），顛倒混勻，4 ℃、10 000 r/min離心15 min；取上清，重復(fù)抽提1次；轉(zhuǎn)移上清至新的離心管，加入等體積4 mol/L LiCl，使LiCl的終濃度為2 mol/L，混勻后4 ℃過夜沉淀；4 ℃、15 000 r/min離心1 h，棄上清， 75%乙醇清洗沉淀2次；置于超凈工作臺晾干，加入500 μL SSTE溶解沉淀；

加入等體積氯仿/異戊醇（24∶1）再抽提1次；加入1/10體積的NaAc，二倍體積的無水乙醇，-20 ℃沉淀2 h；4 ℃、15 000 r/min離心20 min，棄上清，75%乙醇清洗沉淀2次；于超凈工作臺晾干后，加入65 μL DEPC水溶解RNA；

加入10×DNase assay buffer 7.5 μL、RNase inhibitor 1.0 μL、DNase Ⅰ 1.5 μL，37 ℃水浴20 min；

加入DEPC水調(diào)整樣品體積至250 μL，加入1/10體積3 mol/L NaAc，顛倒混勻；

加入二倍體積冷的無水乙醇，混勻后-20 ℃放置30 min；4 ℃、12 000 r/min離心20 min，棄上清，75%乙醇清洗沉淀2次；于超凈工作臺晾干后，加入50 μL DEPC水完全溶解，-70 ℃保存待用。

1.3.2Trizol法。取100 mg左右大豆根組織，迅速放入液氮研磨至粉末狀；轉(zhuǎn)移粉末至裝有1 mL Trizol裂解液的1.5 mL離心管中，渦旋振蕩，4 ℃、12 000 r/min離心15 min；取上清至新的離心管，加入等體積氯仿，渦旋振蕩，冰上靜置5 min，4 ℃、12 000 r/min離心15 min；小心吸取上清至新的離心管中，加入等體積異丙醇，渦旋混勻，冰上靜置20 min，4 ℃、12 000 r/min離心15 min；棄上清，75%乙醇清洗1～2次，4 ℃、12 000 r/min離心5 min；棄上清，4 ℃、12 000 r/min離心1 min，吸棄殘留液體，冰上放置，于超凈臺內(nèi)晾干；加入70 μL DEPC水溶解沉淀，-70 ℃保存待用。

1.3.3試劑盒法。

采用Aidlab EASYspin Plus多糖多酚/復(fù)雜植物RNA快速提取試劑盒，具體操作步驟參見該產(chǎn)品說明書。

1.4RNA的質(zhì)量檢測

1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的純度和完整性，紫外凝膠成像儀觀察并拍照；NANODROP 2000超微量分光光度計檢測RNA的純度及濃度；Agilent 2100生物分析儀深度檢測RNA質(zhì)量。

2結(jié)果與分析

2.1大豆根總RNA的完整性與純度分析

瓊脂糖凝膠電泳（圖1）表明，3種方法均提取出了總RNA。Trizol法提取的RNA 5S亮度偏高，顯示樣品有降解；CTAB-LiCl法提取的RNA 5S亮度適中，但條帶拖尾且有輕微DNA污染；試劑盒為吸附柱法，無法吸附200 bp以下的片段，所以此法提取的總RNA無5S條帶，但18S和28S條帶完整，無拖尾、彌散現(xiàn)象，亮度明顯高于另外2種方法。28S條帶的亮度約為18S的2倍，說明RNA完整性較好，產(chǎn)率高。

2.2大豆根總RNA的質(zhì)量及濃度分析

紫外分光光度計測定結(jié)果（表1）表明，試劑盒提取的RNA濃度最高，純度最好，平均濃度為413.9 ng/μL，A260/A280≈2.14，A260/A230≈2.10。另外2種方法提取的RNA A260/A280雖然也在1.80～2.10，但A260/A230過低，遠小于2.00，說明RNA里含糖類和酚類雜質(zhì)較多。

應(yīng)用Agilent 2100生物分析儀是RNA樣品質(zhì)量控制的行業(yè)標準，可通過RNA完整值（RIN值）來確定RNA的質(zhì)量。Trizol法中3個樣品的RIN值遠小于10.0，說明RNA降解嚴重，完整性差。CTAB-LiCl法中3個樣品RIN值分別為9.9、9.8和9.8，RIN值接近10.0，樣品完整性高。但18S和28S峰形面積比都在3左右，說明樣品的18S峰左右有堿基信息丟失。試劑盒提取的RNA RIN值均為10.0，18S和28S峰形面積比基本在2左右，峰形完美，無堿基信息丟失，說明樣品完整性高，在質(zhì)量上達到文庫構(gòu)建和轉(zhuǎn)錄組測序的要求。

2.3高通量測序結(jié)果

綜合上述結(jié)果，試劑盒提取的RNA在質(zhì)量上達到文庫構(gòu)建和轉(zhuǎn)錄組測序的要求，遂寄交公司進一步檢測后建庫開展測序。

根據(jù)高通量測序結(jié)果數(shù)據(jù)質(zhì)量統(tǒng)計，送檢的RNA混合樣品Q20（Phred數(shù)值大于20的堿基占總體堿基的百分比，即錯誤率<1.0%）

和Q30（Phred數(shù)值大于30的堿基占總體堿基的百分比，即錯誤率<0.1%）的比例分別達92.17%和84.29%，說明測序過程中數(shù)據(jù)錯誤率較低。GC堿基含量達51.29%，十分接近50.00%，說明RNA樣品的堿基對平衡，數(shù)據(jù)完整性高。另外，此測序過程中無法確定的堿基信息低于每百萬1.83的比例，說明測序中很少或沒有無法確定堿基信息的reads。綜上所述，試劑盒提取的RNA高通量測序的結(jié)果準確率高，適合后續(xù)的生物信息學(xué)分析。

3結(jié)論與討論

高通量測序就是運用基因組DNA或RNA經(jīng)過修飾，建立文庫，之后上機測序。核酸的質(zhì)量決定了建庫的成果和測序數(shù)據(jù)的準確性。轉(zhuǎn)錄組測序就是利用高通量測序平臺對物種的轉(zhuǎn)錄組水平進行深度測序，轉(zhuǎn)錄組研究是從整體水平研究基因功能以及基因結(jié)構(gòu)。

RNA-seq技術(shù)對RNA質(zhì)量要求較高：植物樣本RNA濃度≥50 ng/μL、總量≥2 μg、A260/A280≥2.0、A260/A230>1.8、28S/18S≥1、RIN值≥6.5。大豆作為常見的豆科植物，組織中富含多糖、多酚類物質(zhì)。細胞破碎后多酚類化合物極易被氧化成紅褐色物質(zhì)，并與核酸不可逆結(jié)合；多糖的理化性質(zhì)與RNA非常相似，提取時很難將二者區(qū)分開來。加之RNA極不穩(wěn)定，易被降解[7]，更增加了從大豆中提取高質(zhì)量RNA的難度。

近年來，關(guān)于大豆根總RNA的提取雖有不少報道，如異硫氰酸胍法[3]、改良Trizol法[2]對其提取效果均不錯，但通過這些方法提取的RNA并不符合轉(zhuǎn)錄組測序的質(zhì)量要求。因此，找到一種能夠滿足轉(zhuǎn)錄組測序質(zhì)量要求的RNA提取方法非常重要。

該試驗以前人研究為基礎(chǔ)，分析比較了Trizol法、CTAB-LiCl法和試劑盒法3種方法提取大豆根總RNA的效果。Trizol法方便省時，通過成分中的苯酚和異硫氰酸胍直接裂解細胞，同時還能一定程度地抑制RNA酶活性，但此法不能有效去除植物的多糖、多酚，所以提取的RNA雜質(zhì)較多且有降解，RNA質(zhì)量差；CTAB法和試劑盒法提取的RNA完整性好，基本無降解。前者價格相對便宜，但步驟繁雜、耗時較長，適合高校的實驗室研究，不適用于正常的公司生產(chǎn)。此外，Agilent 2100檢測結(jié)果顯示，盡管獲得的RNA RIN值接近10.0，樣品完整性高，但3個平行樣的18S和28S峰形面積比都為3左右，提示18S峰左右有堿基信息丟失，所以CTAB法提取的RNA不是進行高通量測序的最優(yōu)選擇。試劑盒的裂解液含植物RNA助提劑——PLANTaid，它可幫助結(jié)合多糖、多酚，并通過離心后去除，最后通過吸附柱特異性吸附核酸。此法提取的RNA產(chǎn)率高、純度高，各方面均能滿足高通量測序技術(shù)對RNA的質(zhì)量要求。但試劑盒也有不足之處：①5S條帶大概150 bp，吸附柱無法吸附200 bp以下的片段，所以該法提取的RNA凝膠電泳時無5S條帶，此類RNA無法構(gòu)建特殊的smallRNA 文庫；②試劑盒法成本相對較高，實際應(yīng)用時應(yīng)酌情選擇。綜合各種因素，試劑盒法提取的RNA滿足轉(zhuǎn)錄組測序的質(zhì)量要求，可進行后續(xù)的轉(zhuǎn)錄組測序和其他分子生物學(xué)相關(guān)研究工作。

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