袁吉貴　羅杰　劉麗

摘要[目的]對大海馬D-loop和Cyt b序列進行遺傳變異分析。[方法]基于D-loop和Cyt b部分序列對東山島（20尾）和泉州市（20尾）養(yǎng)殖場大海馬進行遺傳變異分析。[結(jié)果]獲得的D-loop和Cyt b序列分別為707～709 bp和404 bp，且2種序列在2個大海馬群體之間極其保守。D-loop和Cyt b序列G+C含量明顯低于A+T含量，C含量也低于G含量，Cyt b序列第3位密碼子G含量最少。東山島和泉州市的大海馬（各20條）D-loop序列的平均核苷酸差異數(shù)分別為0.489和0.958，且分別定義了3種和6種單倍型，東山島和泉州市的大海馬（各20條）Cyt b序列在2個群體之間相似度為100%，只定義了1種單倍型。[結(jié)論]研究表明D-loop和Cyt b序列在2個大海馬群體中變異較小。

關(guān)鍵詞遺傳變異；大海馬；D-loop；Cyt b

中圖分類號S917.4文獻標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2017）36-0140-03

Abstract[Objective]To study the genetic variation of Hippocampus kuda base on Dloop and Cyt b sequences.

[Method]In this paper， the genetic variations of H. kuda between Dongshan island（20 individuals） and Quanzhou City（20 individuals） were analyzed base on part of Dloop and Cyt b sequences. [Result]Dloop and Cyt b sequences were 707-709 bp and 404 bp， respectively， and the two sequences were highly conserved between the two populations. G+C content of Dloop and Cyt b sequences were significantly lower than A+ T， however， the C content was lower than G， and G content of Cyt b sequences were the least in the third codon. The average number of nucleotide differences of 20 Dloop sequences of H. kuda from Dongshan island and Quanzhou City were 0.489 and 0.958， and 3 and 6 kinds of haplotypes were defined respectively， meanwhile， the similarity of Cyt b sequences were 100% with a total of 1 haplotype between the two groups. [Conclusion]All the results showed that the variation of Dloop and Cyt b sequences were relatively little in the two population of H. kuda.

Key wordsGenetic variation；Hippocampus kuda；Dloop；Cyt b

大海馬（Hippocampus kuda Bleeker）隸屬于海龍科（Syngnathidae），是一種小型海洋脊椎動物，因其頭部像馬頭而且與身體形成一個角得名，以撓足類、蔓足類、蝦類等小型無脊椎動物為食，主要分布于溫帶、熱帶及亞熱帶沿岸淺水海域[1-2]。海馬具有抗血栓、抗衰老等多種藥用功能[3-4]，是一種經(jīng)濟價值較高的名貴海產(chǎn)中藥材[5]。南海以其獨特的地理條件和水溫水質(zhì)而成為我國海馬的主要捕撈海域[1]，但野生海馬數(shù)量有限，而且一般是兼捕獲得。我國海馬養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)發(fā)展較慢，養(yǎng)殖技術(shù)需要改善和創(chuàng)新，而且魚類養(yǎng)殖過程中容易出現(xiàn)互相混雜[6]和近交衰退[7]等現(xiàn)象，因此，利用可靠的分子標(biāo)記對大海馬養(yǎng)殖群體進行種質(zhì)評價有重要意義。

分子標(biāo)記技術(shù)可以檢測DNA堿基替換、插入和缺失，獲得豐富的遺傳變異信息，進而分析其遺傳變異和多態(tài)性[8-10]。線粒體控制區(qū)D-loop序列位于線粒體的非編碼區(qū)，具有較高的突變率，受自然選擇壓力極小，能積累的變異較多[11-14]，另外，Cyt b為線粒體功能區(qū)，且序列變異率相對較高，種間差異較大[15-18]，因此，D-loop和Cyt b序列被廣泛應(yīng)用于群體遺傳多樣性、種質(zhì)鑒定和遺傳進化分析，其中涉及的物種包括哺乳類、兩棲類、鳥類、魚類以及無脊椎動物等[19-25]。目前，關(guān)于海馬的研究主要集中在個體生長、繁殖、遺傳進化及保護生物學(xué)等方面[26-30]，為了保護海馬資源，國內(nèi)外研究者在分子遺傳學(xué)方面做了許多研究，例如，Teske等[31]利用D-loop序列對南非海馬（Hippocampus capensis）進行了遺傳分析；Lourie[32]利用Cyt b序列對三斑海馬（Hippocampus trimaculatus）進行了遺傳進化分析；李玉龍等[33]也利用D-loop序列對日本海馬（Hippocampus japonicus）進行了遺傳多樣性研究。該研究擴增了大海馬D-loop和Cyt b部分序列，對其進行了遺傳變異分析，為尋找合適的分子標(biāo)記研究大海馬遺傳多樣性提供參考，同時也為大海馬選育提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

供試大海馬于2016年12月采集于福建省漳州市東山島海馬養(yǎng)殖場（20尾）和泉州市海馬養(yǎng)殖場（20尾），2個群體的大海馬體重和體長比較接近（表1），采集后于無水乙醇中-20 ℃保存。

1.2基因組DNA提取

取大海馬成體尾部組織約0.1 g，利用海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒（TIANGEN）提取海馬基因組，通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3引物設(shè)計及PCR擴增

從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載大海馬線粒體D-loop序列，進而設(shè)計D-loop序列擴增引物F：AAGGAGAATCGAACTCCCACC/R：GGTTACCTGATAATCACGGGG。PCR反應(yīng)體系：10 × Easy Taq Buffer 2.5 μL，dNTP Mixture 2 μL，DNA模板1 μL，F(xiàn)/R引物各1 μL，5 U/μL Taq DNA polymorase 0.2 μL，用雙蒸水補足至25 μL。擴增程序：95 ℃預(yù)變性4 min；95 ℃變性30 s，59 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，40個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。此外，參考高天翔等[21]研究擴增Cyt b序列，PCR擴增產(chǎn)物送至廣州金唯智公司完成測序。

1.4數(shù)據(jù)處理

使用MEGA 5.1軟件對測序結(jié)果進行拼接、校正后，分析2個群體各自的堿基組成；使用DNASP軟件計算2代群體的多態(tài)性位點，變異位點（variable sites），單倍型（haplotypes，h），單倍型多樣性（haplotype diversity，Hd），核苷酸多樣性（nucleotide diversity，Nd），平均核苷酸差異數(shù)（average number nucleotide differences，k）。

2結(jié)果與分析

2.1序列組成

所得D-loop（MF973238～MF973277）和Cyt b（MG018259～MG018298）序列各40條，經(jīng)校正后長度分別為707～709 bp和404 bp，與NCBI數(shù)據(jù)庫比對一致性均>98%，確認為大海馬序列。東山島和泉州市大海馬（各20條）

Cyt b序列T、C、A、G含量一致，分別為30.4%、14.6%、30.4%、24.5%，2個群體Cyt b序列的第3位密碼子G含量最少，第2位密碼子G含量次之（表2）。20條東山島大海馬D-loop序列T、C、A、G含量分別為33.2%、13.9%、32.0%、20.9%，20條泉州市大海馬D-loop序列T、C、A、G含量分別為33.3%、13.9%、31.9%、20.9%。D-loop和Cyt b序列中G+C含量明顯低于A+T含量，C含量均低于G含量。

2.2遺傳變異

由表3可知，20條東山島大海馬D-loop序列存在變異位點4個，共定義了3種單倍型，其中有18個個體屬于同種單倍型，單倍型多樣性為0.195±0.115，核苷酸多樣性為0.000 69，核苷酸差異數(shù)為0.489，20條泉州市大海馬D-loop序列變異位點7個，6種單倍型，有13個個體屬于同種單倍型，單倍型多樣性為0.579±0.124，核苷酸多樣性為0.001 36，核苷酸差異數(shù)為0.958；東山島和泉州市的Cyt b序列相似度為100%，單倍型只有1個，序列變異位點、單倍型多樣性、核苷酸多樣性、核苷酸差異數(shù)均為0。2種序列分析結(jié)果顯示2個養(yǎng)殖場的大海馬群體屬于低單倍型（h<0.5）且低核苷酸多樣性（Nd<0.5%）的群體，與D-loop序列分析結(jié)果相比，基于Cyt b序列分析東山島和泉州市2個養(yǎng)殖場的大海馬群體遺傳變異水平更低。

3結(jié)論與討論

該試驗大海馬D-loop和Cyt b序列存在明顯的堿基偏倚性，與其他魚類的研究結(jié)果相似，如賀亮等[19]研究發(fā)現(xiàn)2 種蝦虎魚A+T含量均高于 C+G 含量，鄧朝陽[34]研究中鯽魚Cyt b 和 D-loop 序列A+T含量也高于 G+C含量，這種偏倚性是大多數(shù)脊椎動物線粒體基因的共同特征，有研究者認為這種偏倚性是由于序列中的堿基置換具有傾向性[35]，編碼基因的變異是由于密碼子的簡并性變異積累而成[36]。該試驗大海馬D-loop和Cyt b序列十分保守，2個群體之間序列差異很小，變異位點數(shù)均為1%以下，與其他物種研究結(jié)果存在很大差異[12，16，18]，同樣，Lourie等[32，37]也發(fā)現(xiàn)華萊士線以西的三斑海馬（Hippocampus trimaculatus）和亞洲東南部的大海馬Cyt b序列變異較小的現(xiàn)象；Sanders等[38]也發(fā)現(xiàn)美國加利福尼亞海馬D-loop和Cyt b序列進化速率都很低，表明海馬D-loop和Cyt b序列與其他物種進化速率不一致。東山島和泉州市2個大海馬群體的D-loop和Cyt b序列保守性與大海馬繁殖方式和生活習(xí)性有關(guān)，大海馬的繁殖方式非常獨特，因為雌海馬把卵產(chǎn)在雄海馬的育兒袋內(nèi)，雄海馬孵化出幼海馬后沒有精力照料和保護幼海馬，造成小海馬的成活率極低，這種低存活率會造成遺傳漂變，進而影響線粒體進化速率。

群體遺傳多樣性的分子標(biāo)記很多，但不同的分子標(biāo)記適用性存在差異。變異位點、核苷酸多樣性等參數(shù)在一定程度上可以判斷一個群體的遺傳多樣性水平[39]。該研究結(jié)合Cyt b和D-loop序列對東山島和泉州市的大海馬群體進行分析發(fā)現(xiàn)單倍型多樣性（Hd<0.5）和核苷酸多樣性（Nd<0.5%）很低，變異位點數(shù)為0～7，說明大海馬群體遺傳變異較小。同樣，在很多其他海馬的研究中也發(fā)現(xiàn)類似的情況，例如太平洋海馬（Hippocampus ingens）[30]、日本海馬（Hippocampus japonicus）[33]、短吻海馬（Hippocampus guttulatus）[40]、南非海馬（Hippocampus capensis）[31] 等其他幾種海馬的遺傳多樣性也處于低水平，但與該試驗結(jié)果相比其遺傳變異較大，而且其高單倍型多樣性且低核苷酸多樣性的遺傳多樣性模式與該試驗?zāi)Ｊ讲灰粯印Ｒ话阏J為，低單倍型多樣性且低核苷酸多樣性的遺傳多樣性模式是因為群體在近期養(yǎng)殖過程中產(chǎn)生了種群瓶頸效應(yīng)或者奠基者效應(yīng)。該試驗大海馬屬于養(yǎng)殖品種，遺傳變異較小可能是受到人工養(yǎng)殖影響[41-42]，要確定遺傳變異較小是否與養(yǎng)殖有關(guān)，必須與養(yǎng)殖前的群體進行比較，此外，不同的物種類別遺傳多樣性必然有差異，海馬的特殊繁殖方式在遺傳變異中有限制進化速率的作用。結(jié)合其他人研究結(jié)果推測，海馬線粒體序列比較保守，D-loop和Cyt b序列檢測到的變異位點有限，檢測其遺傳多樣性需要結(jié)合SNP和微衛(wèi)星等技術(shù)。遺傳物質(zhì)變異積累的遺傳多樣性不僅決定物種的環(huán)境適應(yīng)能力，而且對群體的種質(zhì)變化有決定性意義，遺傳變異越大，一個群體遺傳多樣性越豐富，該群體的生存能力就越強，群體數(shù)量也越多，反之群體數(shù)量越少。因此，基于該試驗獲取的D-loop和Cyt b序列分析顯示福建東山島和泉州市2地的大海馬群體遺傳變異較小，在一定程度上也反映了該地區(qū)海馬種質(zhì)稀缺的現(xiàn)象。在養(yǎng)殖過程中，應(yīng)在優(yōu)質(zhì)的基礎(chǔ)群體條件下，盡可能加大養(yǎng)殖基礎(chǔ)群體和避免近親繁殖才能維持較高的群體遺傳多樣性。

參考文獻

[1] 韓松霖.中國海馬的分類、資源、利用與保護[D].桂林：廣西師范大學(xué)，2013.

[2] 劉瑞玉.中國海洋生物名錄[M].北京：科學(xué)出版社，2008：887-1066.

[3] 許東暉，梅雪婷，李秉記，等.海馬膠囊提高大鼠性功能的藥理作用[J].中藥材，2003，26（11）：807-808.

[4] 許東暉，許實波.斑海馬提取物抗血栓藥理研究[J].中藥材，1995（11）：573-575.

[5] 溫瓏蓮，李軍德，萬德光，等.海馬市場調(diào)查與基原動物鑒定研究[J].中國中藥雜志，2013，38（7）：969-972.

[6] 唐國盤，曾春芳，齊子鑫，等.福壽魚的生物學(xué)特性及養(yǎng)殖前景[J].水生態(tài)學(xué)雜志，2006，26（6）：70-71，81.

[7] 肖俊，甘西，羅永巨.羅非魚育種研究進展[J].湖南科技大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2014，29（1）：106-112.

[8] 邱芳，伏健民，金德敏，等.遺傳多樣性的分子檢測[J].生物多樣性，1998，6（2）：143-150.

[9] 陳琳琳，孔曉瑜，周立石，等.魁蚶核糖體DNA基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)的序列特征[J].中國水產(chǎn)科學(xué)，2005，12（1）：104-108.

[10] 黃磊，唐光緒，田東，等.新型分子標(biāo)記的開發(fā)和利用[J].安徽農(nóng)學(xué)通報，2010，16（23）：43-45，61.

[11] 張博.黃鯽分子標(biāo)記開發(fā)及遺傳多樣性分析[D].舟山：浙江海洋學(xué)院，2013.

[12] 丁旭，齊鑫，尹紹武.基于線粒體D-loop基因探討花鰻鱺的群體遺傳多樣性及其種群進化歷史[J].海洋科學(xué)，2012，36（5）：117-123.

[13] STONEKING M，HEDGECOCK D，HIGUCHI R G，et al.Population variation of human mtDNA control region sequences detected by enzymatic amplification and sequencespecific oligonucleotide probes[J].American journal of human genetics，1991，48（2）：370-382.

[14] 張靜，白俊杰，葉星，等.用線粒體DNA D-loop區(qū)序列探討盤麗魚屬魚類系統(tǒng)分類[J].上海海洋大學(xué)學(xué)報，2006，15（1）：17-20.

[15] BLAXTER M.Molecular systematics：Counting angels with DNA[J].Nature，2003，421（6919）：122-124.

[16] 趙亮，謝本貴，劉志瑾，等.太湖新銀魚線粒體D-loop和Cyt b片段序列結(jié)構(gòu)與進化速率比較[J].動物學(xué)雜志，2010，45（2）：27-38.

[17] 王瑾瑾.狹義鲌亞科及其相關(guān)類群系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系研究及厚頜魴遺傳多樣性分析[D].重慶：西南大學(xué)，2013.

[18] 頡曉勇，李思發(fā).羅非魚選育群體Cyt b與D-loop序列變異信息對比分析[J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2014，33（5）：982-985.

[19] 賀亮，林斌全，劉麗，等.海陵島近岸2種蝦虎魚線粒體COⅠ基因和D-loop區(qū)序列變異及遺傳分析[J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2017，36（1）：81-89.

[20] 彭士明，施兆鴻，侯俊利.基于線粒體D-loop區(qū)與COⅠ基因序列比較分析養(yǎng)殖與野生銀鯧群體遺傳多樣性[J].水產(chǎn)學(xué)報，2010，34（1）：19-25.

[21] 高天翔，畢瀟瀟，趙林林，等.基于線粒體Cyt b基因全序列的松江鱸群體遺傳結(jié)構(gòu)分析[J].水生生物學(xué)報，2013，37（2）：199-207.

[22] 陳士林，姚輝，韓建萍，等.中藥材DNA條形碼分子鑒定指導(dǎo)原則[J].中國中藥雜志，2013，38（2）：141-148.

[23] 王繼英，郭建鳳，趙德云，等.山東省豬種mtDNA Cyt b基因遺傳多樣性及系統(tǒng)進化研究[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，42（5）：1761-1767.

[24] 張際峰，聶劉旺，王洋，等.大頭蛙和脆皮大頭蛙線粒體3個基因的測定及兩棲類親緣關(guān)系研究[J].水生生物學(xué)報，2007，31（6）：822-828.

[25] 楊帆.隼形目13種鳥類12SrRNA、COⅠ和Cyt b基因分析及親緣關(guān)系研究[D].呼和浩特：內(nèi)蒙古大學(xué)，2011.

[26] 戴廣譜.環(huán)境因素對大海馬的繁殖行為及其幼體生長的影響[D].寧波：寧波大學(xué)，2012.

[27] 戴廣譜，徐永健，孫彬.大海馬幼苗人工養(yǎng)殖條件的研究[J].漁業(yè)科學(xué)進展，2011，32（4）：62-66.

[28] LPEZ A，VERA M，OTEROFERRER F，et al.Species identification and genetic structure of threatened seahorses in Gran Canaria Island（Spain）using mitochondrial and microsatellite markers[J].Conservation genetics，2010，11（6）：2431-2436.

[30] SAARMAN N P，LOUIE K D，HAMILTON H.Genetic differentiation across eastern Pacific oceanographic barriers in the threatened seahorse Hippocampus ingens[J].Conservation genetics，2010，11（5）：1989-2000.

[31] TESKE P R，CHERRY M I，MATTHEE C A.Population genetics of the endangered Knysna seahorse，Hippocampus capensis[J].Molecular ecology，2003，12（7）：1703-1715.

[32] LOURIE S A.A marine fish follows Wallace's Line：The phylogeography of the ThreeSpot seahorse（Hippocampus trimaculatus，Syngnathidae，Teleostei）in Southeast Asia[J].Journal of biogeography，2004，31（12）：1975-1985.

[33] 李玉龍，王彬，王愛勇，等.遼寧沿海日本海馬線粒體控制區(qū)序列變異及其在海龍科魚類系統(tǒng)分析中的應(yīng)用[J].水產(chǎn)學(xué)報，2017，41（7）：1073-1082.

[34] 鄧朝陽.鯽4個群體線粒體Cyt b序列和D-loop區(qū)的比較分析[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2015（9）：277-279.

[35] 張文駒，瞿禮嘉，高巍，等.普通小麥基因組最可能的4個供體的 ITS1和ITS2序列及其親緣關(guān)系[J].植物學(xué)報，1998，40（11）：994-1000.

[36] 肖敬平.簡并性還是多態(tài)性？：遺傳密碼子設(shè)定的進化特點的剖析[J].中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報，2002，18（6）：669-673.

[37] LOURIE S A，GREEN D M，VINCENT A C.Dispersal，habitat differences，and comparative phylogeography of Southeast Asian seahorses（Syngnathidae：Hippocampus）[J].Molecular ecology，2005，14（4）：1073-1094.

[38] SANDERS J G，CRIBBS J E，F(xiàn)IENBERG H G，et al.The tip of the tail：Molecular identification of seahorses for sale in apothecary shops and curio stores in California[J].Conservation genetics，2008，9（1）：65-71.