唐赟 敬珊 鄒書珍

摘要[目的]對一株石油烴降解菌TY22的烷烴羥化酶基因alkB克隆測序，并對其外源表達(dá)和功能進(jìn)行研究。[方法]PCR擴(kuò)增獲得alkB基因部分序列，再根據(jù)該序列通過染色體步移技術(shù)，最終獲得完整CDS序列。將alkB基因與pET21b（+）載體構(gòu)建重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)入E.coli BL21（DE3）進(jìn)行表達(dá)。再將alkB基因克隆至pCom8載體中，分別轉(zhuǎn)入E.coli GEc137（pGEc47△B）和Pseudomonas fluorescens KOB2Δ1進(jìn)行基因功能的互補(bǔ)試驗(yàn)。[結(jié)果]染色體步移獲得了1 236 bp的烷烴羥化酶基因完整CDS序列（GenBank Accession： KU867870）。誘導(dǎo)表達(dá)發(fā)現(xiàn)，重組菌在0.1 mmol/L IPTG、30 ℃條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h的表達(dá)效果最佳，得到與預(yù)期相符的46 kDa蛋白。基因功能互補(bǔ)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，重組菌能在以C12～C16為唯一碳源的培養(yǎng)基中生長。[結(jié)論]TY22菌株的烷烴羥化酶基因完整CDS序列全長1 236 bp，能氧化C12～C16的中長鏈烷烴，并能在大腸桿菌中有效表達(dá)。

關(guān)鍵詞石油烴降解菌；烷烴羥化酶；表達(dá)；功能

中圖分類號S188文獻(xiàn)標(biāo)識碼

A文章編號0517-6611（2017）36-0131-04

Abstract[Objective] To clone and sequence the alkane hydroxylase gene alkB of a petroleum hydrocarbon degrading bacteria TY22，then to clone alkB into express vector for expressing and identifying its function.[Method] First，use PCR amplification to get partial sequence of 1236 bp alkB gene，then obtain the complete CDS sequence by chromosome walking techniques.Second，clone alkB gene into pET21b（+） vector，and transform the recombinant plasmid into E.coli BL21（DE3） for expressing.Third，clone alkB gene into pCom8 vector，and transform the recombinant plasmid into E.coli GEc137（pGEc47△B） and Pseudomonas fluorescens KOB2Δ1 respectively for gene function complementation test.[Result]We got the complete CDS sequence of 1 236 bp alkane hydroxylase gene through chromosome walking techniques （GenBank Accession：KU867870）.The expression strain had the most expression with 0.1 mmol/L IPTG，30 ℃ culture for 6 hours，relative molecular mass 46 kDa was also in line with expectation.Gene function complementation test showed that the recombinant strains can grow in the medium with nalkanes C12～C16 as sole carbon source.[Conclusion] Alkane hydroxylase gene alkB complete CDS sequence length of strain TY22 was 1 236 bp.It can oxidize nalkanes with chain length C12～C16，and efficient expression in E.coli BL21（DE3）.

Key wordsPetroleum hydrocarbon degrading bacteria；Alkane hydroxylase；Expression；Function

石油是目前全世界最為重要的能源物質(zhì)，但在石油開發(fā)過程中經(jīng)常會產(chǎn)生事故性泄露，在石油制品的生產(chǎn)和使用過程中，也往往會造成大量石油污染物進(jìn)入土壤、河流和大氣而產(chǎn)生嚴(yán)重的環(huán)境污染[1～4]。據(jù)估計(jì)，全球每年有1×109 t石油污染物泄漏或排放至周圍環(huán)境中，對生態(tài)環(huán)境造成了極大的破壞[5-6]。隨著污染情況日益加劇，高效且不產(chǎn)生二次污染的石油烴微生物修復(fù)技術(shù)現(xiàn)已成為該領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。

烷烴具有高度的還原性，微生物對其進(jìn)行降解時(shí)，通常是由烷烴羥化酶（AlkB，Alkane hydroxylase）啟動整個(gè)反應(yīng)。在烷烴羥化酶的催化下，將氧插入烷烴分子中使其變?yōu)榇蓟蛲缓笾鸩浇到鉃椴煌愋偷闹舅?，最后通過不同途徑將其分解為CO2和H2O[7-9]。所以，烷烴羥化酶作為啟動整個(gè)降解過程的關(guān)鍵酶，也成為了研究的焦點(diǎn)。

筆者以從南充煉油廠周圍被石油污染的土壤中篩選出的一株高效石油烴降解菌TY22為研究對象。經(jīng)鑒定，該菌歸屬于拜氏不動桿菌（Acinetobacter beijerinckii），革蘭氏染色呈陰性，其最適生長溫度和pH分別為30 ℃、7.0，能以鏈長為12～32的正構(gòu)烷烴為唯一碳源和能源生長[10-11]。由于該菌是一株能降解中長鏈烷烴的不動桿菌新種，且其對正構(gòu)烷烴的降解范圍較寬，所以對其解烴基因的克隆和鑒定有著重要的意義。該研究以期為后續(xù)石油烴污染修復(fù)工程提供優(yōu)良的遺傳資源，同時(shí)對其應(yīng)用到石油烴污染的生物修復(fù)具有重要的實(shí)踐意義。

1材料與方法

1.1菌株與載體

石油烴降解菌TY22，由西華師范大學(xué)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存；宿主菌E.coli GEc137（pGEc47△B）（抗四環(huán)素Tetr）和宿主菌Pseudomonas fluorescens KOB2△1，由瑞士Zürich大學(xué)van Beilen教授贈送，西華師范大學(xué)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存；E.coli DH5α和E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，購自北京TIANGEN有限公司；pCom8質(zhì)粒（抗慶大霉素Gmr），由瑞士Zürich大學(xué)van Beilen教授贈送，西華師范大學(xué)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存；pET21b（+） express vector（抗氨芐青霉素Ampr），西華師范大學(xué)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存；pMD19-T Vector（抗氨芐青霉素Ampr），購自大連TaKaRa有限公司。

1.2主要試劑與酶

PrimeSTAR Max Premix（2×）、QuickCut Nde I、QuickCut Xho I、QuickCut Sal I、T4 DNA Ligase等購自大連TaKaRa有限公司；2×Taq PCR MasterMix、DNA Marker、雙色預(yù)染蛋白質(zhì)Marker、細(xì)菌基因組DNA離心柱型提取試劑盒、通用型DNA離心柱型純化回收試劑盒、質(zhì)粒離心柱型小提試劑盒等購自北京TIANGEN有限公司。

1.3引物該研究所用引物見表1，引物均合成于上海英濰捷基有限公司，PAGE純化。

1.4 烷烴羥化酶基因的克隆、測序

以TY22菌株基因組DNA為模板，利用引物alkBwf/alkBwr和2×Taq PCR MasterMix進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，48 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃后延伸10 min。將獲得的PCR產(chǎn)物純化回收后，克隆到pMD19-T Vector中，并轉(zhuǎn)入E.coli DH5α，篩選陽性克隆后測序。最后將TY22菌株送往上海生物工程有限公司，根據(jù)上一步獲得的烷烴羥化酶基因alkB部分序列，利用染色體步移技術(shù)得到alkB基因的完整CDS序列。

1.5烷烴羥化酶基因序列及氨基酸序列分析

將TY22菌株的烷烴羥化酶基因alkB完整CDS序列在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行Nucleotide BLAST比對；將其對應(yīng)蛋白質(zhì)氨基酸序列在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行Protein BLAST比對；利用EXPASY網(wǎng)站ProtParam工具，在線分析氨基酸數(shù)目、蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量、理論等電點(diǎn)pI等；將氨基酸序列提交NPS@ ：SOPMA secondary structure prediction網(wǎng)站預(yù)測蛋白二級結(jié)構(gòu)；利用SWISS-MODEL網(wǎng)站，將氨基酸序列提交后進(jìn)行三維同源建模分析，在線預(yù)測蛋白的三級結(jié)構(gòu)。

1.6烷烴羥化酶基因在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)

1.6.1目的基因的PCR擴(kuò)增。以TY22菌株基因組DNA為模板，利用上游引物P1/下游引物P3和PrimeSTAR Max Premix（2×）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲取帶有Nde I和Xho I 這2個(gè)酶切位點(diǎn)及其保護(hù)堿基的alkB基因的完整CDS序列。反應(yīng)條件為98 ℃預(yù)變性3 min；98 ℃變性10 s，58 ℃退火15 s，72 ℃延伸2 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃后延伸10 min。PCR結(jié)束后將產(chǎn)物純化回收。

1.6.2構(gòu)建pET21b（+）-alkB重組質(zhì)粒。將上一步獲得的PCR純化回收產(chǎn)物和pET21b（+） express vector分別進(jìn)行Nde I、Xho I雙酶切，各自回收酶切產(chǎn)物后利用T4 DNA Ligase 16 ℃連接過夜，最后轉(zhuǎn)入E.coli BL21（DE3）并篩選陽性重組菌。

1.6.3重組菌誘導(dǎo)表達(dá)電泳。將過夜培養(yǎng)的重組菌按1%接種量接入含相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD600≈0.6。然后按：①終濃度分別為0.1、0.2、0.5、1.0 mmol/L的IPTG；②25、30、37 ℃的培養(yǎng)溫度；③2、4、6 h的培養(yǎng)時(shí)間這3種條件分別誘導(dǎo)培養(yǎng)重組菌，然后用8%分離膠SDS-PAGE電泳檢測表達(dá)結(jié)果，探究IPTG濃度、溫度和時(shí)間對其誘導(dǎo)表達(dá)的影響。

1.7烷烴羥化酶基因缺失與互補(bǔ)功能驗(yàn)證

1.7.1目的基因的PCR擴(kuò)增。以TY22菌株基因組DNA為模板，利用上游引物P1/下游引物P2和PrimeSTAR Max Premix（2×）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲取帶有Nde I和Sal I 這2個(gè)酶切位點(diǎn)及其保護(hù)堿基的alkB基因的完整CDS序列。反應(yīng)條件為98 ℃預(yù)變性3 min；98 ℃變性10 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸2 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃后延伸10 min。PCR結(jié)束后將產(chǎn)物純化回收。

1.7.2構(gòu)建pCom8alkB重組質(zhì)粒。將上一步獲得的PCR純化回收產(chǎn)物和pCom8質(zhì)粒分別進(jìn)行Nde I、Sal I雙酶切，各自回收酶切產(chǎn)物后利用T4 DNA Ligase 16 ℃連接過夜，最后轉(zhuǎn)入E.coli GEc137（pGEc47△B）和Pseudomonas fluorescens KOB2△1中篩選陽性重組菌。

1.7.3重組菌的功能互補(bǔ)試驗(yàn)。將過夜培養(yǎng)的E.coli GEc137（pGEc47△B）陽性重組菌，按1%接種量分別接入含有1% C8、C10、C12正構(gòu)烷烴為唯一碳源的E2無機(jī)鹽培養(yǎng)基中37 ℃、180 r/min培養(yǎng)，觀察其生長情況；將過夜培養(yǎng)的Pseudomonas fluorescens KOB2△1陽性重組菌，按1%接種量分別接入含有1% C12、C14、C16正構(gòu)烷烴為唯一碳源的E2無機(jī)鹽培養(yǎng)基中37 ℃、180 r/min培養(yǎng)，觀察其生長情況。

2結(jié)果與分析

2.1烷烴羥化酶基因的克隆及測序

根據(jù)參考文獻(xiàn)可知，引物alkBwf/alkBwr的目的產(chǎn)物約為550 bp。以TY22菌株基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖1。由圖1可知，目的片段大小與預(yù)期相符，對其回收后TA克隆測序。

測序比對后發(fā)現(xiàn)該序列與alkane hydroxylase（烷烴羥化酶AlkB）基因序列存在很高的同源性，由此推測其為TY22菌株烷烴羥化酶基因alkB的部分序列。將菌株送至上海生物工程有限公司，根據(jù)此序列利用染色體步移技術(shù)得到全長1 236 bp的alkB基因完整CDS序列，GenBank登錄號為KU867870，其對應(yīng)氨基酸序列登錄號為AMO65651。

2.2烷烴羥化酶基因序列及氨基酸序列分析

2.2.1BLAST比對分析。將所得烷烴羥化酶基因alkB完整CDS序列在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行Nucleotide BLAST比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該序列與Acinetobacter beijerinckii的烷烴羥化酶基因序列存在很高的同源性，其中與Acinetobacter sp.M-1（GenBank登錄號AB049410.1）的alkB基因的同源性達(dá)88%。利用NCBIORF Finder預(yù)測ORF并將其對應(yīng)氨基酸序列在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行Protein BLAST比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與多株Acinetobacter beijerinckii的烷烴羥化酶氨基酸序列存在極高的同源性，最高可達(dá)99%。由此可以推斷，所得序列即為TY22菌株的烷烴羥化酶基因alkB序列。

2.2.2蛋白理化性質(zhì)分析。利用EXPASY網(wǎng)站ProtParam工具，在線分析氨基酸數(shù)目、蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量、理論等電點(diǎn)pI等，結(jié)果如下：氨基酸數(shù)目411，相對分子質(zhì)量46.7 kDa，

理論等電點(diǎn)pI 9.22，Asp+Glu 41，Arg+Lys 50，分子式C2137H3297N571O588S11，

不穩(wěn)定指數(shù)43.90，脂溶性指數(shù)86.67，總平均親水性GRAVY-0.331。

2.2.3蛋白二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測。 將氨基酸序列提交NPS@ ：SOPMA secondary structure prediction網(wǎng)站預(yù)測蛋白二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該蛋白二級結(jié)構(gòu)主要由α螺旋（h）、β轉(zhuǎn)角（t）、無規(guī)則卷曲（c）和延伸鏈（e）4種組成。其中α螺旋占37.47%，包含154個(gè)氨基酸；β轉(zhuǎn)角占10.71%，包含44個(gè)氨基酸；無規(guī)則卷曲占35.28%，包含145個(gè)氨基酸；延伸鏈占16.55%，包含68個(gè)氨基酸。利用SWISS-MODEL網(wǎng)站進(jìn)行三維同源建模分析，預(yù)測蛋白三級結(jié)構(gòu)，結(jié)果見圖2。

由二、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果可知，該蛋白有5～6個(gè)α螺旋，推測其結(jié)構(gòu)與P.putida Gpo1菌株的烷烴羥化酶AlkB結(jié)構(gòu)類似，幾個(gè)α螺旋構(gòu)成一個(gè)袋狀結(jié)構(gòu)域。當(dāng)烷烴進(jìn)入后，其中1個(gè)α螺旋的疏水性側(cè)鏈伸入袋中形成底物結(jié)合中心，烷烴末端的甲基靠近“袋口”形成催化中心，由此開始對烷烴的末端進(jìn)行氧化。

2.3烷烴羥化酶基因在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)

2.3.1PCR擴(kuò)增與構(gòu)建重組質(zhì)粒。以TY22菌株基因組DNA為模板，利用引物P1/P3擴(kuò)增得到一條大小相符的片段，純化回收后與pET21b（+）載體分別進(jìn)行Nde I、Xho I雙酶切，并利用T4 DNA Ligase 16 ℃連接過夜，最后轉(zhuǎn)入E.coli BL21（DE3）篩選陽性重組菌，結(jié)果見圖3。

2.3.2重組菌誘導(dǎo)表達(dá)電泳。將重組菌在LB培養(yǎng)基中37 ℃、180 r/min培養(yǎng)至OD600≈0.6時(shí)，分別加入IPTG至終濃度為0.1、0.2、0.5、1.0 mmol/L，30 ℃、180 r/min誘導(dǎo)6 h，然后用8%分離膠SDS-PAGE電泳檢測，結(jié)果見圖4。由圖4可知，重組菌在0.1 mmol/L IPTG、30 ℃條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h的表達(dá)效果最佳，所得的46 kDa蛋白與預(yù)期理論值相符。

2.4烷烴羥化酶基因缺失與互補(bǔ)功能驗(yàn)證

2.4.1PCR擴(kuò)增與構(gòu)建重組質(zhì)粒。以TY22菌株基因組DNA為模板，利用引物P1/P2擴(kuò)增得到1條大小相符的片段，純化回收后與pCom8載體分別進(jìn)行Nde I、Sal I雙酶切，并利用T4 DNA Ligase 16 ℃連接過夜，最后轉(zhuǎn)入E.coli GEc137（pGEc47△B）和Pseudomonas fluorescens KOB2Δ1中篩選陽性重組菌，結(jié)果見圖5。

2.4.2重組菌的功能互補(bǔ)試驗(yàn)。2001年，瑞士van Beilen教授等構(gòu)建出了E.coliPseudomonas穿梭表達(dá)質(zhì)粒pCom8，該質(zhì)粒能在E.coli或Pseudomonas中復(fù)制和表達(dá)外源基因，并可受烷烴及類似物的誘導(dǎo)，能用于檢測烷烴降解途徑中重要的酶基因[13]。

E.coli GEc137（pGEc47△B）菌株中含有pGEc47△B質(zhì)粒，其上帶有P.putida GPo1菌株除烷烴羥化酶基因alkB以外的完整烷烴降解基因簇，因此該菌不能以C6～C12的正構(gòu)烷烴作為唯一碳源生長。如果將合適的alkB基因構(gòu)建到pCom8載體中組成重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)入E.coli GEc137（pGEc47△B）中表達(dá)，便能使烷烴羥化酶基因的功能互補(bǔ)，從而其重組菌就可以C6～C12的正構(gòu)烷烴作為唯一碳源生長。

P.fluorescens KOB2Δ1是P.fluorescens CHA0的alkB1基因缺失菌株，因此它不能以C12～C16的正構(gòu)烷烴作為唯一碳源生長，如果將能氧化C12～C16烷烴的烷烴羥化酶基因構(gòu)建到pCom8 載體中組成重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)入P.fluorescens KOB2Δ1中表達(dá)，便能使alkB基因的功能互補(bǔ)，其重組菌就可以C12～C16的正構(gòu)烷烴作為唯一碳源生長。

將TY22菌株的烷烴羥化酶基因alkB構(gòu)建到pCom8質(zhì)粒中，得到重組質(zhì)粒pCom8-alkB，將其分別轉(zhuǎn)入上述2株alkB基因缺失宿主菌中，并置于含相應(yīng)正構(gòu)烷烴為唯一碳源的E2無機(jī)鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)，觀察其生長情況，結(jié)果見表2。由表2可知，TY22菌株的烷烴羥化酶能氧化C12～C16的中長鏈烷烴。

3結(jié)論

（1）以TY22基因組DNA為模板，利用引物alkBwf/alkBwr PCR擴(kuò)增得到TY22菌株的烷烴羥化酶基因的部分序列。再根據(jù)所得序列通過染色體步移技術(shù)，最終獲得TY22菌株烷烴羥化酶基因alkB的完整CDS序列，該序列全長1 236 bp，GenBank登錄號為KU867870。經(jīng)分析，該基因編碼一段411 aa的蛋白質(zhì)，其相對分子量為46.7 kDa，等電點(diǎn)9.22。預(yù)測其二級結(jié)構(gòu)，α螺旋占37.47%，β轉(zhuǎn)角占10.71%，無規(guī)則卷曲占35.28%，延伸鏈占16.55%。

（2）選擇pET21b（+）作為表達(dá)載體，將其與TY22菌株的烷烴羥化酶基因alkB構(gòu)建得到pET21b（+）-alkB重組質(zhì)粒，再將其轉(zhuǎn)入E.coli BL21（DE3）中進(jìn)行表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，重組菌在0.1 mmol/L IPTG、30 ℃條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h的表達(dá)效果最佳，所得的46 kDa蛋白也與預(yù)期理論值相符。

（3）將TY22菌株烷烴羥化酶基因alkB與pCom8質(zhì)粒構(gòu)建得到pCom8-alkB重組質(zhì)粒，再將重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入E.coli GEc137（pGEc47△B）和Pseudomonas fluorescens KOB2Δ1中進(jìn)行基因的功能互補(bǔ)試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TY22菌株的烷烴羥化酶能氧化C12～C16的中長鏈烷烴。

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