邵莉萍　張繼瑜　馬志永

摘要[目的]研究抗菌藥物恩諾沙星、環(huán)丙沙星、加替沙星對27株副豬嗜血桿菌臨床分離株體外抗菌活性，從而觀察副豬嗜血桿菌對喹諾酮類抗菌藥物的敏感性。[方法]采用微量肉湯稀釋法測定MIC，參考標準為美國臨床和實驗室標準協(xié)會（CLSI）。[結(jié)果]恩諾沙星（MIC50，MIC90，0.25 μg/mL，2 μg/mL）、環(huán)丙沙星（MIC50，MIC90，0.125 μg/mL，2 μg/mL）、加替沙星（MIC50，MIC90，0.125 μg/mL，1 μg/mL）均表現(xiàn)出一定的抑菌活性，且加替沙星的抑菌活性最明顯。在耐藥性方面，副豬嗜血桿菌對恩諾沙星的耐藥性最強（222%），環(huán)丙沙星（3.8%）和加替沙星（7.4%）具有輕微的耐藥性。[結(jié)論]抗菌藥物恩諾沙星、加替沙星以及環(huán)丙沙星對副豬嗜血桿菌臨床分離株具有一定的抗菌活性，在耐藥性方面，HPS已經(jīng)對恩諾沙星表現(xiàn)出一定的耐藥性，因此，今后在臨床上遇到副豬嗜血桿菌引起的相關(guān)疾病，可以采用合理的給藥方案進行疾病的治療，對于預(yù)防耐藥菌株產(chǎn)生至關(guān)重要。

關(guān)鍵詞恩諾沙星；加替沙星；環(huán)丙沙星；副豬嗜血桿菌；MIC

中圖分類號S858.8文獻標識碼

A文章編號0517-6611（2017）33-0113-02

Research of Antibacterial Activity of Clinical Commonly Used Drugs against HPS

SHAO Liping1， ZHANG Jiyu1*， MA Zhiyong2

（Lanzhou Institute of Husbandry and Pharmaceutical Sciences ，Chinese Academy of Agricultural Sciences ， Lanzhou ，Gansu 730050；2.Shanghai Veterinary Research Institute，Shanghai 200241）

Abstract[Objective ]The purpose of the research is to evaluate the activity of the enrofloxacin，ciprofloxacin，gatifloxacin against heamophilus parasuis（27 isolates） ， and we can estimate the ability of the quinolone compounds and oxazolidinone antibacterial against heamophilus parasuis（HPS）.[Method] Broth microdilution method was used to determine MIC， following the Clinical and Laboratory Standards Institute （CLSI） recommendations.[Result] Enrofloxacin（MIC50，MIC90，0.25ug/mL，2ug/mL），ciprofloxacin（MIC50，MIC90，0.125ug/mL，2ug/mL） ， gatifloxacin（MIC50，MIC90，0.125ug/mL，1ug/mL）exhibited activity against HPS，gatifloxacin was the best one of compounds in aspect of inhibition HPS.In repect of resistance ， HPS was most resistant for enrofloxacin（22.2%）， and showed a little resistance for ciprofloxacin（3.8%） and gatifloxacin（7.4%） .[Conclusion] The compounds of quinolone revealed better antibacterial activity than the oxazolidinone antibacterial-linezolid， and linezolid dosent show the function to restrain HPS.As respect of resistance ， HPS reveals severe resistance for enrofloxacin .So ， it is important for us to adopt the right ways to choose relevant drugs ， when we encounter the diseases caused by HPS.

Key wordsEnrofloxacin； Gatifloxacin； Ciprofloxacin；HPS； MIC

副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis，HPS）是豬呼吸道一種常在菌，起初該病原菌被稱為豬嗜血桿菌，后來證明其生長時不需要X因子（血紅素和其他卟啉類物質(zhì)），需要煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD或V因子），因此將其命名為HPS[1]。形態(tài)學(xué)上，HPS革蘭氏染色成紅色，屬于革蘭氏陰性菌，在光學(xué)顯微鏡下觀察，HPS菌體呈多形性，從單個的球桿菌到細長的絲狀菌體均可見。該菌在體外培養(yǎng)時非常脆弱，存活時間短，容易自行死亡，在TSA固體培養(yǎng)基上長出光滑、透明的灰白色針尖大菌落，HPS感染引起豬多發(fā)性漿膜炎和關(guān)節(jié)炎以及脊髓炎，被稱之為格拉斯氏病[2-3]。該病常呈繼發(fā)感染，在機體遭受應(yīng)激或者病毒感染時，常常會侵入動物體內(nèi)，引起動物發(fā)病，屬于典型的機會致病菌。易感豬群為2～8周齡的斷奶前后仔豬，以及1～4月齡的保育階段豬，發(fā)病率為10%～15%，死亡率可達50%，降低了豬出欄率，給生豬養(yǎng)殖行業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。臨床常用疫苗來對未發(fā)病的豬群進行免疫，但是，由于受血清性的多樣性和非特異性致病菌的分離數(shù)量增加等因素影響，使得交叉保護疫苗的開發(fā)應(yīng)用尤為困難。

抗菌藥是臨床實際應(yīng)用于治療該疾病的主要選擇?？咕幾鳛榭咕挠行Щ衔?，已經(jīng)是全世界養(yǎng)殖戶用于抵抗細菌感染最常用的臨床藥物。但是長期濫用抗生素使細菌極易產(chǎn)生耐藥性，甚至出現(xiàn)超級細菌，例如，耐甲氧西林金葡菌、耐甲氧西林表皮葡萄球菌、耐青霉素肺炎鏈球菌、多重耐藥性結(jié)核桿菌以及耐萬古霉素腸球菌。這些耐藥菌的出現(xiàn)，給臨床細菌病的治療造成困難，嚴重影響疫病的治療效果，使得一些細菌病難以得到有效的控制。據(jù)國內(nèi)外研究報道，臨床分離的HPS當(dāng)中，存在三甲氧芐氨嘧啶+磺胺甲噁唑耐藥菌株，也有部分對新霉素耐藥，此外西班牙學(xué)者發(fā)現(xiàn)臨床分離的HPS對青霉素、氨芐青霉素、土霉素、紅霉素以及替米考星等常見藥物存在耐藥現(xiàn)象。后來，中國的研究學(xué)者發(fā)現(xiàn)，臨床分離的HPS對喹諾酮類、頭孢類以及慶大霉素出現(xiàn)了耐藥現(xiàn)象[4-5]。

抗菌藥物對HPS的敏感性檢測的試驗對于格拉斯氏疾病的治療是尤為重要的，目前，國內(nèi)外很少有關(guān)于抗菌藥物對副豬嗜血桿菌敏感性試驗的研究報告。為此，研究27株HPS臨床分離菌對喹諾酮類藥物恩諾沙星（enrofloxacin）、加替沙星（gatifloxacin）、環(huán)丙沙星（ciprofloxacin）的敏感性（圖1），從而為臨床用藥提供給藥方案指導(dǎo)。喹諾酮類化合物是一類人工合成的含4-喹諾酮基本結(jié)構(gòu)的抗菌藥，對革蘭氏陰性菌具有良好的抗菌活性和較強的藥代學(xué)特性，自20世紀60年代問世以來，已經(jīng)經(jīng)歷4代的結(jié)構(gòu)改造與修飾，目前獸醫(yī)臨床常用的為第3代的環(huán)丙沙星和恩諾沙星，以及第4代的加替沙星，其中恩諾沙星獸醫(yī)臨床應(yīng)用最為廣泛[6-7]。但是，自2000年以來，臨床常見致病菌對喹諾酮類藥物的耐藥性在臨床疾病的治療中越發(fā)普遍，特別是腸道菌的耐藥性。因此，觀察喹諾酮類藥物對HPS的抑菌活性，對于預(yù)防耐藥菌產(chǎn)生具有重要的指導(dǎo)意義[7]。

圖1恩諾沙星（enrofloxacin）、環(huán)丙沙星（ciprofloxacin）、加替沙星（gatifloxacin）化學(xué)結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)

Fig.1The chemical structures of enrofloxacin，ciprofloxacin and gatifloxacin

1材料與方法

1.1藥品

恩諾沙星，純度98%，由北京索萊寶科技有限公司提供；環(huán)丙沙星，純度98%，由上海麥克林生化科技有限公司提供；加替沙星，純度98%，由上海麥克林生化科技有限公司提供。

1.2菌株

HPS臨床分離株27株，由上海獸醫(yī)研究所馬志永研究員饋贈。

1.3質(zhì)控菌株流感嗜血桿菌ATCC49247，購自北納生物。

1.4主要試劑

大豆胰蛋白胨瓊脂（tryptone soya agar，TSA）和大豆胰蛋白胨肉湯（tryptone soya broth，TSB）培養(yǎng)基購自青島海博生物技術(shù)有限公司，新生牛血清購自浙江天杭生物科技有限公司，輔酶Ⅰ（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，NAD）購自biosharp。

1.5培養(yǎng)基配置

將液體培養(yǎng)基TSB按照產(chǎn)品要求配置一

定體積的培養(yǎng)液，高壓滅菌之后，冷卻至45 ℃左右，無菌加

入過濾除菌的10%NAD及5%新生牛血清，放置在4 ℃條件下備用。

1.6抗菌藥液與菌液的制備

抗菌藥液制備：試驗前精密稱取恩諾沙星、環(huán)丙沙星、加替沙星，無菌操作配制成2048 μg/mL的藥液，放置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫R用前用相應(yīng)的細菌培養(yǎng)液稀釋至試驗需要的濃度。恩諾沙星、加替沙星用DD水作溶劑，振蕩30 min；環(huán)丙沙星用甲醇做溶劑，振蕩30 min。

菌液配置：

挑取單菌落接種至已制備好的TSB液體培養(yǎng)基當(dāng)中，置37 ℃振蕩培養(yǎng)20 h后，用TSB培養(yǎng)基稀釋菌液，直至菌液濃度為0.5麥氏單位。

1.7最小抑菌濃度（MIC）測定

采用微量肉湯稀釋法分別測定待測藥物對每株菌株的MIC，試驗參考標準美國臨床和實驗室標準協(xié)會（CLSI）[8-9]。將一定濃度的待測藥物倍比稀釋到96孔板各試驗孔中，稀釋梯度為15個梯度，濃度范圍為256～0.015625 μg/mL。然后用相應(yīng)的細菌培養(yǎng)液稀釋已調(diào)節(jié)至0.5麥氏單位濃度的菌液，稀釋后的菌液在15 min內(nèi)完成接種，保證每孔細菌的終濃度為5×105CFU/mL，每孔對應(yīng)的藥物濃度分別為相應(yīng)的15個梯度所對應(yīng)的濃度。陰性對照組為接種細菌的細菌培養(yǎng)液。當(dāng)陰性對照組長出細菌時，試驗結(jié)果方可采納。

2結(jié)果與分析

藥物對27株HPS的MIC結(jié)果見表1，可以看出，恩諾沙星（MIC50，MIC90，0.25.0 μg/mL，2 μg/mL）、環(huán)丙沙星（MIC50，MIC90，0.125 μg/mL，2 μg/mL）、加替沙星（MIC50，MIC90，0.125 μg/mL，1 μg/mL）均表現(xiàn)出良好的抑菌活性，喹諾酮類藥物當(dāng)中，HPS對恩諾沙星的耐性最強（22.2%），而對加替沙星的敏感性最強（93.0%），環(huán)丙沙星介于恩諾沙星和加替沙星之間。由此可見，喹諾酮類藥物恩諾沙星對HPS已經(jīng)產(chǎn)生一定的耐藥性，對環(huán)丙沙星和加替沙星的耐藥性還不是特別強烈，其中對于加替沙星的敏感性最好（表2）。

3結(jié)論與討論

HPS是豬呼吸道常在菌。在一定的條件下，就會侵入豬體內(nèi)，例如豬藍耳病、豬丹毒、豬肺疫以及仔豬腹瀉等疾病致使豬抵抗力低下，此時HPS突破機體黏膜屏障，侵入體內(nèi)，引起豬發(fā)病。病理變化為豬心臟呈絨毛心，肝臟表面出現(xiàn)白色被膜[10]。近幾年來，隨著抗菌藥物的大范圍使用，細菌的耐藥性問題也越來越嚴重，目前，HPS對喹諾酮類藥物的耐藥性正在逐漸增強，臨床上，HPS菌株耐藥性在逐漸增強，尤其對大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類、β-內(nèi)酰胺類、喹諾酮類以及磺胺類藥物的耐藥性，而這些藥物是格拉斯氏病臨床治療常用的有效藥物。喹諾酮類化合物恩諾沙星、環(huán)丙沙星以及加替沙星曾因抗菌譜廣泛抗菌活性突出，特別是對于多重耐藥菌，在世界范圍內(nèi)廣泛應(yīng)用。在2009—2010年，宋德平等[11]、方泉明等[12]對江西的HPS臨床分離株做了藥敏試驗，結(jié)果表明HPS對豬場大量使用的鏈霉素、青霉素等抗生素具有一定的耐藥性，但是對頭孢類抗菌藥物則比較敏感。后來，在2015年，魏光河[13]對重慶地區(qū)的HPS進行藥敏試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該地區(qū)菌對第3代頭孢和多黏菌素類藥品極度敏感，敏感率高達100%，而對于四環(huán)素類、喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類以及青霉素類均表現(xiàn)出33.3%～100%的耐藥性。

該研究發(fā)現(xiàn)，喹諾酮類藥物對革蘭氏陰性菌的抗菌效果顯著，比如腸道、呼吸道或者全身性的革蘭氏陰性菌，然而，由于在臨床上的濫用，使得其耐藥范圍越來越廣，耐藥機理也是千變?nèi)f化。該試驗研究的HPS臨床分離菌，恩諾沙星的耐藥性最強，達到22.2%，其次是加替沙星（7.4%）和環(huán)丙沙星（3.8%），而加替沙星的敏感率最高，為93.0%。恩諾沙星的耐藥率大約是環(huán)丙沙星的7倍，加替沙星的3倍。因此，當(dāng)臨床格拉斯氏疾病發(fā)生時，可以采用加替沙星或環(huán)丙沙星作為治療藥物進行給藥，切記勿濫用藥物，以防止更多的耐藥菌的產(chǎn)生。

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