王發(fā)明　李潔維　葉開玉　龔弘娟　莫權(quán)輝　蔣橋生　劉平平

摘要： 對收集于廣西桂林的17份野生毛葡萄種質(zhì)和24份栽培葡萄種質(zhì)，分別使用12條ISSR和12條SCoT引物進(jìn)行了遺傳多樣性和親緣關(guān)系檢測。結(jié)果表明：兩種分子標(biāo)記均能產(chǎn)生較豐富的多態(tài)性片段，可有效應(yīng)用于葡萄的遺傳多樣性檢測，但在聚類分析結(jié)果上表現(xiàn)出一定的差異性，SCoT分子標(biāo)記能更好地區(qū)分野生種質(zhì)和栽培品種，說明SCoT分子標(biāo)記在葡萄遺傳多樣性檢測和系統(tǒng)進(jìn)化研究上可能更有優(yōu)勢。從SCoT聚類結(jié)果上看，廣西植物研究所收集的3個(gè)野生毛葡萄種質(zhì)zws1、zws2和zws3相對其它野生種質(zhì)而言，更偏向于與栽培種質(zhì)聚為一類，說明這一類野生毛葡萄可能是這些栽培品種的原始親本來源之一。不同的野生種質(zhì)聚為多個(gè)類群，并表現(xiàn)出明顯的地域特性，但遺傳距離相對較遠(yuǎn)，說明桂林野生毛葡萄資源具有豐富的遺傳變異。栽培品種沒有明顯的聚類特點(diǎn)，可能因?yàn)樗x用的栽培品種的地域代表性并不是很強(qiáng)，也可能是因?yàn)樵耘嗥贩N在不斷的人工雜交選育過程中，遺傳背景趨向一致，遺傳多樣性降低。該研究證明SCoT分子標(biāo)記在葡萄遺傳多樣性研究上具有一定的優(yōu)勢。該研究結(jié)果為桂林毛葡萄資源的保護(hù)、利用和品種選育提供了理論依據(jù)，也為葡萄的系統(tǒng)進(jìn)化研究提供了參考。

關(guān)鍵詞： 葡萄， 毛葡萄， 遺傳多樣性， ISSR， SCoT

中圖分類號(hào)： Q943

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

文章編號(hào)： 10003142（2017）01000108

Abstract： Seventeen wild germplasm resources of Vitis heyneana collected from Guilin City of Guangxi Zhuang Autonomous Region and 24 grape cultivars were used to study their genetic diversity and relationship using twelve ISSR and twelve SCoT markers. The results showed that both the two types of molecular markers produced rich polymorphic fragments， and could be used on the genetic diversity study of Vitis. However， the results of cluster analysis showed the difference between ISSR and SCoT， and the SCoT markers rather than ISSR markers were much better at distinguishing the wild and the cultivars of Vitis， therefore， the SCoT markers might have more advantages on the study of genetic diversity and phylogenetic analysis of Vitis. The clustering results of SCoT showed that the three wild V. heynean “zws1”， ”zws2” and “zws3” collected from Guangxi Institute of Botany grouped together with cultivars rather than the other wild ones， which showed that maybe one of the ancestral parents of these cultivars was derived from this category of wild V. heyneana. All the seventeen wild germplasms clustered into different groups and showed distinct regional character， nonetheless， the genetic distance was long between different groups， which showed that the wild V. heyneana had abundant genetic diversity in Guilin. The cultivars did not show obvious clustering characteristics due to the fact that most of them had no regional representativeness or their genetic background were nearly equal due to constantly interbreeding， resulting in low genetic diversity. The findings proved that the SCoT molecular markers had more advantages in the genetic diversity study of Vitis. The findings provides the information for the conservation and utilization and variety breeding of wild V. heyneana in Guilin.

Key words： Vitis， V. heyneana， genetic diversity， ISSR， SCoT

葡萄在世界上具有悠久的栽培歷史，葡萄屬植物在北半球廣泛分布，我國處于葡萄屬植物的東亞分布中心，是重要的原產(chǎn)地之一。全世界葡萄共有70多個(gè)種，其中40個(gè)種（包括1個(gè)亞種）及13個(gè)變種起源于中國，種質(zhì)資源極其豐富（劉崇懷等，2006）。毛葡萄（Vitis heyneana）原產(chǎn)于我國，在我國葡萄屬植物中屬于較原始的種類（劉三軍等，1995）。在廣西，特殊的亞熱帶氣候和喀斯特地貌特征造就了毛葡萄適宜的自然生長環(huán)境，特別是在桂中、桂北、桂西等地廣泛分布（彭宏祥等，1999），桂林地處廣西北部，是野生毛葡萄種質(zhì)資源的重要分布地區(qū)之一，具有豐富的遺傳多樣性。野生毛葡萄具有較高的營養(yǎng)和保健價(jià)值，其果實(shí)富含多種維生素、氨基酸、各種礦物質(zhì)和微量元素等，具有抗氧化、抗衰老和防癌等功效。在廣西，使用毛葡萄為原料釀造野生葡萄酒具有較悠久的歷史，因其果實(shí)含糖量低、單寧含量較高、富含花青素和多種營養(yǎng)元素等，具備良好的釀造加工特性，野生毛葡萄酒因具有獨(dú)特的香味和口感而深受消費(fèi)者喜愛。但野生毛葡萄資源的收集、保護(hù)和種質(zhì)評(píng)價(jià)等多年來一直沒有受到足夠的重視（鄒瑜，2008）。葡萄屬植物具有豐富的遺傳變異，使得通過常規(guī)的形態(tài)解剖、生理生化檢測等方法進(jìn)行分類鑒定非常困難（賀普超等，1999）。因此，從分子生物學(xué)角度，通過分子標(biāo)記等方法研究葡萄種質(zhì)資源的親緣關(guān)系及遺傳多樣性，對于了解葡萄的物種起源和系統(tǒng)進(jìn)化及遺傳育種、種質(zhì)資源管理和保護(hù)等都具有積極意義。

ISSR （ InterSimple Sequence Repeat ）是由加拿大的Zietkiewcz & Rafalskia （1994）提出的一種分子標(biāo)記方法，其結(jié)合了RAPD和SSR的優(yōu)點(diǎn)，具有穩(wěn)定性好、多態(tài)性豐富、共顯性、模板用量少、操作簡單等特點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于植物的品種鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建和基因定位、遺傳多樣性和系統(tǒng)進(jìn)化分析等研究中。而SCoT標(biāo)記是首先應(yīng)用于水稻上的一種基于翻譯起始位點(diǎn)（根據(jù)基因ATG翻譯起始位點(diǎn)側(cè)翼保守序列設(shè)計(jì)引物），使用單引物擴(kuò)增目標(biāo)基因的功能性分子標(biāo)記 （Collard & Mackill，2009；熊發(fā)前等，2009）。目前，SCoT分子標(biāo)記方法已在水稻 （Collard & Mackill，2009）、龍眼（陳虎等，2010）、鐵皮石斛（趙瑞強(qiáng)，2012）、桃兒七（Chen et al，2013）、柿（鄧立寶等，2012）、白靈菇（趙夢然等，2012）、麻風(fēng)樹（Mulpuri et al，2013）、芒果（Luo et al， 2010， 2011）等植物上得到應(yīng)用。

各種分子標(biāo)記方法目前在葡萄種質(zhì)資源遺傳多樣性研究上得到了廣泛應(yīng)用，但是作為一種較新型的分子標(biāo)記，SCoT分子標(biāo)記在葡萄上的應(yīng)用相對較少（Guo et al，2012），而且其在葡萄遺傳多樣性的研究效果上缺少對比和評(píng)價(jià)。本研究通過比較ISSR分子標(biāo)記與SCoT分子標(biāo)記在野生和栽培葡萄品種的遺傳多樣性研究上的應(yīng)用，對SCoT分子標(biāo)記的應(yīng)用效果進(jìn)行評(píng)價(jià)，同時(shí)通過研究野生毛葡萄與栽培葡萄的遺傳多樣性和親緣關(guān)系，為廣西毛葡萄資源的保護(hù)、利用和品種選育提供參考，也為葡萄的系統(tǒng)進(jìn)化研究提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1 材料

17份桂林毛葡萄資源分別收集于資源縣（修睦、莆田、大源、中峰、官洞村等地）、興安縣（茨林口、華江、黃毛灘等地）、臨桂區(qū)（安江坪等地）、雁山區(qū)（廣西植物研究所）等地，24份葡萄品種資源采集于廣西植物研究所鮮食葡萄種質(zhì)資源圃[包括京亞（Jingya）、香玉（Xiangyu）、藤稔（Fujiminori）、黑加侖（Ribes nigrum）、克倫森（Crimson）、紅雙味（Hongshuangwei）、維多利亞（Victoria）、玫瑰香（Muscat）、夏黑（Summer Black）、紅玫瑰（Red Rose）、紅地球（Red Globe）、紅乳（Hongru）、比昂扣（Rosario Bianco）、美夏40（Meixia 40）、巨峰（Kyoho）、美滿（Meiman）、無核白（Thomson Seedless）、圣誕玫瑰（Christmas Rose）、美譽(yù)（Meiyu）和zws雜（zwshybrid）等20個(gè)品種]和桂林市農(nóng)科所（包括NKS2、NKS4、NKS5、NKS6等4個(gè)雜交品種）。取樣材料為幼嫩葉片，硅膠干燥后提取基因組DNA。使用的dNTPs、DNA聚合酶和DNA ladder等試劑購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.2 DNA提取與檢測

參照Ergül et al（2006）的方法，使用改良CTAB法提取葡萄栽培品種和野生毛葡萄的全基因組DNA，使用紫外分光光度法和瓊脂糖電泳法檢測其DNA質(zhì)量，將DNA稀釋到合適濃度用于PCR擴(kuò)增。剩余DNA保存于-20 ℃冰箱備用。

1.3 引物篩選

使用的ISSR引物根據(jù)加拿大哥倫比亞大學(xué)UBC公司公布的100 條引物序列（http：//www.biotech.ubc.ca/services/naps/primers.html.）進(jìn)行合成，SCoT引物根據(jù)Collard & Mackill （2009）公布的36條引物序列和Luo et al（2011）公布的40條引物序列進(jìn)行合成。在BioRad S1000 PCR儀上對所有引物進(jìn)行篩選，最終篩選出擴(kuò)增產(chǎn)物條帶清晰、多態(tài)性好的12條ISSR引物（表1）和12條SCoT引物（表2），用于所有DNA樣品擴(kuò)增。

1.4 PCR反應(yīng)與檢測

ISSR和SCoT的反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序基本一致。20 μL反應(yīng)體系包括2×Taq PCR Mix 10 μL，DNA（50 ng·μL1） 1.0 μL，10 μmol·L1引物0.8 μL，超純水8.2 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 S，復(fù)性40 S（退火溫度隨引物而定），72 ℃延伸1 min，循環(huán)34次；72 ℃延伸10 min。取8 μL擴(kuò)增產(chǎn)物，使用2%的瓊脂糖（預(yù)加EB）電泳分離，電壓為5 V·cm1，電泳緩沖液為1×TAE，電泳結(jié)束后在紫外分析儀上觀察并拍照保存。

1.5 數(shù)據(jù)分析

對所有的ISSR和SCoT分子標(biāo)記圖譜進(jìn)行分析，先根據(jù)相同遷移率下同一位點(diǎn)DNA 擴(kuò)增條帶的有無分別記為1和0，再合并1/0矩陣后使用NTSYSpc2.10e軟件和UPGMA方法對41份樣品進(jìn)行聚類分析。

2結(jié)果與分析

2.1 ISSR與SCoT的多態(tài)性分析

12條ISSR引物在41份葡萄樣本中共擴(kuò)增出121個(gè)DNA位點(diǎn)，其中多態(tài)性位點(diǎn)107個(gè)，多態(tài)率占88.4%；單條引物擴(kuò)增的條帶數(shù)為7～11條，平均約10條。12條SCoT引物共擴(kuò)增出130個(gè)DNA位點(diǎn)，其中多態(tài)位點(diǎn)116個(gè)，多態(tài)率占89.2%；單條引物擴(kuò)增條帶數(shù)為8～14條，平均為11條。兩種引物擴(kuò)增的片段范圍大多集中250～2 000 bp之間，二者擴(kuò)增的DNA位點(diǎn)數(shù)和多態(tài)性位點(diǎn)比率相差無幾，單條引物擴(kuò)增能力也基本一致。部分引物的擴(kuò)增結(jié)果見圖1和圖2。

2.2 ISSR和SCoT聚類分析

根據(jù)兩種分子標(biāo)記的擴(kuò)增結(jié)果，使用UPGMA

方法對41份材料分別進(jìn)行聚類分析。由ISSR聚類分析的結(jié)果（圖3）可見，在遺傳相似系數(shù)0.84處，京亞、香玉、藤稔、美滿、黑加侖、維多利亞、紅雙味、NKS4、巨峰、紅地球、NKS2等11個(gè)品種聚為一類，克倫森、夏黑、紅玫瑰、紅乳、比昂扣、zws雜等6個(gè)品種聚為一類，而其它栽培品種及野生種質(zhì)大多沒有明顯的聚類關(guān)系。而使用SCoT方法（圖4），在遺傳相似系數(shù)0.77處將41份供試材料分為6個(gè)類群，其中第Ⅰ類群包含全部的栽培種質(zhì)和廣西植物研究所內(nèi)收集的3個(gè)野生種質(zhì)zws1、zws2和zws3，第Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ類均只包含野生種質(zhì)，并且野生種質(zhì)之間的聚類趨勢表現(xiàn)出較明顯的地域特性。兩種分子標(biāo)記的聚類結(jié)果均顯示廣西植物研究所內(nèi)收集的3個(gè)野生種質(zhì)zws1，zws2，zws3明顯聚為一類，且與栽培品種的遺傳距離相對較近；而安江坪2號(hào)與所有葡萄種質(zhì)的遺傳距離最遠(yuǎn)?？傮w看來，兩種分子標(biāo)記的聚類結(jié)果有一定差距，但SCoT方法能更好地區(qū)分栽培品種和野生種質(zhì)。

3討論

3.1 ISSR和SCoT分子標(biāo)記的應(yīng)用效果比較

目前，ISSR分子標(biāo)記在葡萄的遺傳多樣性和系統(tǒng)進(jìn)化研究等方面得到了廣泛應(yīng)用（吳子龍等，2006；張永輝等，2011；賴呈純等，2014），但是SCoT分子標(biāo)記在葡萄遺傳多樣性上的研究相對較少。在引物設(shè)計(jì)上，二者對于不同植物均具有普適性和通用性，可以大大提高引物的利用率，節(jié)約成本；二者均使用單一引物進(jìn)行擴(kuò)增，操作起來更方便；二者均可以使用較高的退火溫度進(jìn)行擴(kuò)增，提高了擴(kuò)增結(jié)果的特異性和穩(wěn)定性。本研究結(jié)果證明ISSR和SCoT分子標(biāo)記都可以產(chǎn)生豐富的遺傳多態(tài)性位點(diǎn)，無論在單條引物的擴(kuò)增條帶數(shù)和多態(tài)性條帶比率上都相差不大，說明二者都可以有效地應(yīng)用于葡萄種質(zhì)遺傳多樣性研究上。但二者的聚類分析結(jié)果具有一定的差異性，41份葡萄種質(zhì)的聚類分析結(jié)果顯示，SCoT標(biāo)記能更好地區(qū)分栽培品種與野生種質(zhì)。前人在其它物種上的研究也表明SCoT分子標(biāo)記相對于ISSR分子標(biāo)記在植物遺傳多樣性研究上更有效和更穩(wěn)定（趙丹等，2014），這可能與其引物的設(shè)計(jì)方法有關(guān)，SCoT分子標(biāo)記是依據(jù)植物基因中的ATG 翻譯起始位點(diǎn)側(cè)翼序列的保守性，設(shè)計(jì)單引物并對基因組進(jìn)行擴(kuò)增，所以可能使其更多的擴(kuò)增位點(diǎn)位于基因組的編碼區(qū)，從而使標(biāo)記的聚類結(jié)果與表型之間更具相關(guān)性。本研究證明SCoT分子標(biāo)記在葡萄種質(zhì)資源遺傳多樣性評(píng)價(jià)和系統(tǒng)進(jìn)化研究上可能更具優(yōu)勢。

3.2 葡萄種質(zhì)資源的遺傳多樣性及其親緣關(guān)系

以SCoT分子標(biāo)記的聚類分析結(jié)果為例，在遺傳相似系數(shù)0.77處可以將全部的栽培品種聚為一類，而這些品種包括了歐亞種、歐美雜種、美國雜種、日本雜種及國內(nèi)雜交培育等較多來源，但是這些品種之間沒有明顯的聚類關(guān)系，可能因?yàn)楸敬芜x用的栽培品種的地域代表性不是很強(qiáng)，也說明栽培品種在不斷的人工定向雜交選育過程中，遺傳背景趨向一致，遺傳多樣性降低。收集于廣西植物所內(nèi)的3份野生種質(zhì)zws1，zws2和zws3相對其它野生種質(zhì)而言與栽培品種的遺傳距離更近，說明這一類野生毛葡萄可能是這些栽培品種的原始親本來源之一。其余類群均為野生種類，并且這些野生種質(zhì)的遺傳距離相對較遠(yuǎn)，說明了廣西野生毛葡萄資源具有豐富的遺傳變異。特別是安江坪2號(hào)種質(zhì)，與其它野生種質(zhì)的遺傳距離最遠(yuǎn)，這也與其較為特殊的表型對應(yīng)，雖然將其判定為毛葡萄種質(zhì)，但是相對于其它毛葡萄種類具有許多的特殊表型，因此有必要將其作為一種特殊的種質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步研究。另外可以看出，雖然同一采樣地點(diǎn)的野生毛葡萄種質(zhì)大多聚為一類，表現(xiàn)出明顯的地域特性，但總體仍表現(xiàn)出豐富的遺傳多樣性。

葡萄栽培品種在優(yōu)異園藝性狀的人為定向篩選過程中，不可避免地丟失部分“低劣”的性狀位點(diǎn)及其與之連鎖的其它基因位點(diǎn)，而這些位點(diǎn)很有可能包含了人們所未知的一些重要功能基因，特別是抗病、抗逆性基因，所以廣泛使用少數(shù)優(yōu)良品種的繼代栽培及以其為父、母本進(jìn)行雜交培育新品種的行為可能導(dǎo)致其品種的退化和加劇其遺傳多態(tài)性的降低。而野生種類在漫長的自然選擇過程中，具備了較強(qiáng)大的適應(yīng)能力和抗病蟲、抗逆特性，并且可能保留一些有益的突變位點(diǎn)，為葡萄品種的培育提供了重要的基因資源。因此對葡萄野生資源進(jìn)行收集、保存和鑒定，并對其優(yōu)異性狀進(jìn)行利用，是葡萄優(yōu)良品種培育的重要基礎(chǔ)和保障，具有重要的應(yīng)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義。

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