陳曉艷 孟亞雄 賈小霞 張武 劉石 郭玉美 齊恩芳

摘要： 該研究為了培育兼抗4種病毒的馬鈴薯品種，采用RTPCR技術(shù)對(duì)PVX、PVS、PVY和PLRV的外殼蛋白（CP）基因進(jìn)行克隆與分析，獲得了大小分別為670、800、700、600 bp的CP基因序列，將獲得的CP基因序列與NCBI中已報(bào)道的序列進(jìn)行比對(duì)分析，其同源性都在96%以上。根據(jù)所克隆的CP基因?qū)Π袠?biāo)片段進(jìn)行篩選，獲得了大小約300 bp的靶標(biāo)片段PVXrh、PVSrh、PVYrh和PLRVrh，同時(shí)利用 OverlapPCR技術(shù)將4種病毒的靶標(biāo)片段進(jìn)行拼接，得到了長度約為1 200 bp的融合片段XSYVrh，與預(yù)期目標(biāo)片段XSYVyxz的相似性達(dá)100%。利用DNA重組技術(shù)將融合片段XSYVrh克隆到pGMT載體上構(gòu)建成克隆載體pGMTXSYVrh，用SpeⅠ和SacⅠ對(duì)克隆載體pGMTXSYVrh和植物表達(dá)載體pART27進(jìn)行同步雙酶切，用T4 DNA連接酶將XSYVrh片段連接到載體pART27上，成功構(gòu)建了同時(shí)含4種病毒CP基因片段的植物表達(dá)載體pART27XSYVrh。采用直接轉(zhuǎn)化法將植物表達(dá)載體導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404中，并利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對(duì)煙草品種T12試管苗進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化后的煙草植株經(jīng)PCR檢測(cè)，有40株轉(zhuǎn)化植株可擴(kuò)增出目的條帶，表明XSYVrh融合基因已成功轉(zhuǎn)入煙草基因組中。

關(guān)鍵詞： 馬鈴薯病毒， 融合基因， 載體構(gòu)建， 遺傳轉(zhuǎn)化， 轉(zhuǎn)基因煙草

中圖分類號(hào)： S532

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

文章編號(hào)： 10003142（2017）01008709

Abstract： In order to simultaneously foster antifourvirus potato varieties（PVX， PVS， PVY and PLRV）， four different viral coat protein （CP） gene PVXCP （670 bp）， PVSCP（800 bp）， PVYCP（700 bp） and PLRVCP（600 bp） were obtained via RTPCR and sequenced to confirm respectively. And the comparison of the sequences that we obtained and the already reported sequences from NCBI database showed that all four viral CP genessequences were more than 90% homologous； then around 300 bp size conservative gene fragments PVXrh， PVSrh， PVYrh， PLRVrh were selected from their respective viral CP genesand four specific bands which were consistent with the fragment size were obtained via PCR amplification. The fusion sequence XSYVrh which is around 1 200 bp long was created with PVXrh， PVSrh， PVYrh and PLRVrh gene fragments via OverlapPCR technique. With the help of DNA recombination technique， we integrated XSYVrh sequence into pGMT vector and created cloning vector pGMTXSYVrh. The cloning vector pGMTXSYVrh and the plant expression vector pART27 were treated with incision enzyme Spe Ⅰ and Sac Ⅰ； then under the effect of T4 DNA ligase， XSYVrh sequence was integrated with pART27 expression vector； at last pART27XSYVrh plant expression vector was successfully constructed. The pART27XSYVrh plant expression vector was introduced into Agrobacterium tumefaciens LBA4404， and subsequently introduced into tobacco （T12） assisted by the agrobacteriummediated transformation. PCR results showed that there were 40 transgenic plants with targeted gene integrated into their genomes.

Key words： potato virus， fusion gene， vector construction， genetic transformation， transgenic tobacco

馬鈴薯（Solanum tuberosum）為茄科（Solanceae）茄屬（Solanum）一年生草本塊莖植物，起源于秘魯、哥倫比亞及玻利維亞安第斯山區(qū)，在哥倫布發(fā)現(xiàn)新大陸后從原產(chǎn)地迅速向世界各地傳播種植，目前馬鈴薯種植已遍布全球（李婷婷，2014）。馬鈴薯作為僅次于小麥、水稻和玉米的第四大糧食作物，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中有著其他作物不可替代的作用（張麗等， 2015）。近年來，隨著馬鈴薯產(chǎn)業(yè)迅速發(fā)展，對(duì)其品質(zhì)和產(chǎn)量等要求也不斷提高，但馬鈴薯病毒病也日趨嚴(yán)重，且已成為馬鈴薯退化和減產(chǎn)的重要原因（樸福萬，2010；吳興泉等，2011）。馬鈴薯病毒病分布于世界各馬鈴薯種植區(qū)，目前已報(bào)道侵染馬鈴薯的病毒有40余種（Grammatikaki et al，2007），其中危害較重的主要有馬鈴薯卷葉病毒（Potato leaf roll virus，PLRV）、馬鈴薯Y病毒（Potato virus Y，PVY）、馬鈴薯X病毒（Potato virus X，PVX）、馬鈴薯S病毒（Potato virus S，PVS）、馬鈴薯M病毒（Potato virus M，PVM）、馬鈴薯A病毒（Potato virus A，PVA）和馬鈴薯紡錘塊莖類病毒（Potato spindle tuber viroid，PSTV）等（馬雪青等，2010）。單獨(dú)一種馬鈴薯病毒一般可導(dǎo)致馬鈴薯減產(chǎn)10%～30%，嚴(yán)重者在80%以上（Salazar et al， 1978）。如PLRV在我國北方地區(qū)造成的馬鈴薯產(chǎn)量的損失為30%～40%，嚴(yán)重時(shí)候?yàn)?0%～90%（霍曉輝等，2013）；PVY嚴(yán)重時(shí)減產(chǎn)在80%以上（Glais et al，2002；Nolte et al，2004；Whitworth et al，2006；常飛等，2015）；PVS可減產(chǎn)10%～20%，該病毒不易覺察，主要靠接觸傳毒，通過熱處理及莖尖脫毒技術(shù)都較難脫除干凈，分布于世界各馬鈴薯種植區(qū)（吳興泉等，2015）；PVX單一侵染癥狀輕微或潛隱，一般減產(chǎn)10%左右，有時(shí)可達(dá)50%（姚東校等，2013）；馬鈴薯感染PVA后可造成40%的減產(chǎn)（張維，2013）。而2種甚至幾種病毒混合侵染帶來的損失遠(yuǎn)大于各病毒單獨(dú)侵染（崔曉江等，1994），如PVY和PVX或PVY和PLRV混合侵染帶來的的損失遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于各病毒單獨(dú)侵染（崔曉江等，1994）。因此，培育抗病毒馬鈴薯品種是防治病毒病的有效方法。

馬鈴薯是同源四倍體作物，用常規(guī)育種方法改良品種，天然抗性基因資源嚴(yán)重不足，且存在育種周期長、抗性基因遺傳不穩(wěn)定以及遠(yuǎn)緣雜交種間障礙等問題，而隨著細(xì)胞工程和現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，轉(zhuǎn)基因技術(shù)可將外源的一個(gè)或多個(gè)基因轉(zhuǎn)入植物的基因組中，實(shí)現(xiàn)植物遺傳性狀的定向改變，為作物新品種的培育提供了新途徑。自20世紀(jì)80年代由農(nóng)桿菌介導(dǎo)的第一例轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株問世以來，轉(zhuǎn)基因技術(shù)在馬鈴薯育種上已取得了較大進(jìn)展（明鎮(zhèn)寰和Ooms，1991）。目前已獲得抗PVX，PVY，PLRV等轉(zhuǎn)外殼蛋白（CP）基因的抗性植株（龔磊，2013）。隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，利用OverlapPCR等基因融合技術(shù)培育出了能抗2種或3種病毒的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯（宋艷茹等，1994）。因此，利用基因工程技術(shù)向植物體內(nèi)導(dǎo)入外源基因是抗病毒病的一種有效途徑。本研究首先用RTPCR法克隆了PVX、PVS、PVY和PLRV的CP基因全序列，同源比對(duì)分析CP基因的保守區(qū)域后，擴(kuò)增出4種病毒CP基因300 bp左右較保守的基因片段，然后利用 OverlapPCR技術(shù)將4種病毒的CP基因片段進(jìn)行拼接，構(gòu)建了pART27XSYVrh植物表達(dá)載體，進(jìn)一步轉(zhuǎn)化煙草，以期培育兼抗4種病毒的植物新材料。

1材料與方法

1.1 材料

植物材料：PVX、PVS、PVY和PLRV帶毒馬鈴薯試管苗葉片。菌株：pGMT vector和大腸桿菌菌株DH5a購自TaKaRa公司。其余菌株由本實(shí)驗(yàn)室保存。

試劑：Taq酶、各種限制性內(nèi)切酶、氨卞青霉素（Amp）、卡那霉素（Kan）、IPTG、Xgal等均購自TaKaRa公司；T4 DNA連接酶、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、植物RNA提取試劑盒購自TIANGEN公司；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；測(cè)序由賽百盛公司完成。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)參考NCBI中已報(bào)道的PVX（Z34261.1）、PVS（GU319954.1）、PVY（X54611.1）和PLRV（AY307123.1）CP基因全長序列，利用Premier5.0設(shè)計(jì)克隆4種病毒CP基因長度分別為PVX（670 bp）、PVS（811 bp）、PVY（701 bp）、PLRV（584 bp）的引物（表1），用oligo6.0軟件評(píng)估。根據(jù)已克隆的4種CP 基因的 cDNA 序列，選擇各序列中約300 bp無終止突變，且拼接后也無終止突變的基因片段（將拼接的目的片段命名為XSYVyxz），利用Oligo6.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，考慮到后續(xù)片段融合需要，在設(shè)計(jì)引物時(shí)加入Spe I和Sac I酶切位點(diǎn)，最終設(shè)計(jì)各片段的重疊引物（表2）。

1.2.2 CP基因的克隆RNA的提取與cDNA的合成：參照RNA提取試劑盒說明，提取感染病毒的馬鈴薯葉片總RNA。利用RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。

PCR擴(kuò)增：以cDNA為模板，分別以FX/RX、FS/RS、FY/RY、FV/RV4對(duì)引物對(duì)4種CP基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系25 μL：5×Primes STAR Buffer（Mg2+plus）5.0 μL，dNTP Mixture（2.5 mmol·L1）2.0 μL，上下游引物（10 mmol·L1）各0.5 μL，下游引物R（10 mmol·L1）0.5 μL，模板（cDNA）0.5 μL，Prime STAR HsDNA Polymerase 0.25 μL，用ddH2O補(bǔ)至25 μL。反應(yīng)程序：98 ℃ 10 s，55 ℃ 5 s，72 ℃ 60 s，循環(huán)30次；循環(huán)結(jié)束后，按暫停按鈕，每個(gè)PCR管各加0.5 μL Taq DNA polymerase，最后72 ℃保溫10 min。

擴(kuò)增產(chǎn)物的回收、測(cè)序與序列比對(duì)：擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%（w/v）瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，用普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收純化，純化產(chǎn)物與PGMT載體連接轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞。利用藍(lán)白斑篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR及EcoR I酶切鑒定，最后進(jìn)行基因測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用DNAMAN5.0軟件分別與4個(gè)CP基因全長序列進(jìn)行比對(duì)。

1.2.3 靶標(biāo)基因片段PVXrh、PVSrh、PVYrh和PLRVrh的擴(kuò)增以提取的質(zhì)粒為模板，分別用四對(duì)引物（PVX1/PVX2、PVS1/PVS2、PVY1/PVY2和PLRV1/PLRV2）對(duì)4種靶標(biāo)基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。方法同1.2.2。

1.2.4 目標(biāo)基因片段XSYVrh的融合反應(yīng)體系25 μL，包含5×Primes STAR Buffer（Mg2+plus）5.0 μL，dNTP Mixture（2.5 mmol·L1）2.0 μL，Template1（純化DNA）0.5 μL，Template2（純化DNA）0.5 μL，Prime STAR HsDNA Polymerase 0.25 μL，ddH2O 16.75 μL， PCR擴(kuò)增條件為98 ℃ 10 s， 55 ℃ 5 s， 72 ℃ 60 s，循環(huán)5次；5個(gè)循環(huán)結(jié)束后，按暫停，加入上游引物PVX1（10 mmol·L1）和下游引物PVS2（10 mmol·L1）各0.5 μL，再按98 ℃ 10 s，55 ℃ 5 s，72 ℃ 60 s，循環(huán)30次，按暫停，給每個(gè)PCR管各加0.5 μL Taq DNA polymerase，最后72 ℃ 10 min，擴(kuò)增出融合基因XSrh，回收產(chǎn)物-20 ℃保存。同樣的方法擴(kuò)增出融合基因XSYrh和XSYVrh。

1.2.5 融合片段的克隆、檢測(cè)、測(cè)序與分析將融合片段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%（w/v）瓊脂糖凝膠進(jìn)行切膠回收，將回收產(chǎn)物與pGMT載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞。在含有100 mg·L1 Amp的LB平板上利用藍(lán)白斑篩選陽性單菌落進(jìn)行接種培養(yǎng)后，堿裂解法提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR及酶切鑒定后，取一只甘油管送賽百盛公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用DNAMAN5.0軟件與目標(biāo)基因片段XSYVyxz進(jìn)行比對(duì)。

1.2.6 植物表達(dá)載體pART27XSYVrh的構(gòu)建及鑒定分別提取含目的基因XSYVrh和載體pART27的質(zhì)粒，用Spe I和Sac I對(duì)提取的質(zhì)粒進(jìn)行同步雙酶切，用40 μL酶切體系：包含1 μL Spe I，1 μL Sac I，4 μL 10×M Buffer，20 μL質(zhì)粒，ddH2O補(bǔ)足40 μL。反應(yīng)條件為37 ℃過夜，回收酶切產(chǎn)物小片段命名為XSYVrh，大片段命名pART27。用T4 DNA連接酶將XSYVrh片段連接到載體pART27上，用10 μL連接體系： 包含1 μL T4 DNA ligase Buffer， 1 μL T4 DNA ligase，3.5 μL目的片段XSYVrh，1 μL載體pART27，ddH2O補(bǔ)至10 μL。反應(yīng)條件為16 ℃過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，在含有50 mg·L1 Kan的LB平板上挑取陽性單菌落進(jìn)行接種培養(yǎng)后，進(jìn)行菌液PCR檢測(cè)，提取質(zhì)粒后用Spe I和Sac I雙酶切鑒定，1.0%瓊脂糖電泳檢測(cè)片段長度進(jìn)而驗(yàn)證含有目的基因片段的植物表達(dá)載體pART27XSYVrh的正確性。

1.2.7 pART27XSYVrh植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌LBA4404根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備：從-80 ℃冰箱取一支根癌農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)甘油管，冰浴融化，然后在含有20 mg·L1 Rif和50 mg·L1 Str的YEP平板上劃線，倒置平板，28 ℃培養(yǎng)1～2 d；挑取LBA4404單菌落接種于同樣的YEP液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)至OD600值為0.3～0.4；轉(zhuǎn)入無菌的離心管中，置于冰浴中30 min；4 ℃，5 000 r·min1離心5 min后去掉上清液；加入2 mL預(yù)冷的20 mmol·L1 CaCl2重懸菌體；制備好的感受態(tài)按照200 μL分裝于無菌的離心管中，液氮速凍后置于-80 ℃保存?zhèn)溆?，使用時(shí)取出置于冰上融化。

植物表達(dá)載體pART27XSYVrh轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞LBA4404：取2 μg（5～10 μL）質(zhì)粒DNA，加入200 μL感受態(tài)細(xì)胞中，輕彈管壁混勻；置于冰上30 min，轉(zhuǎn)入液氮中5 min，迅速置于37 ℃水浴中5 min；加入800 μL YEP液體培養(yǎng)基，28 ℃下250 r·min1預(yù)表達(dá)4～5 h；取100～200 μL菌液涂布于含有20 mg·L1 Rif、50 mg·L1 Str和50 mg·L1 Kan的YEP固體平板上靜置5～10 min后，倒置平板，28 ℃下暗培養(yǎng)2 d。

農(nóng)桿菌LBA4404pART27XSYVrh鑒定：挑取陽性單克隆，重新擴(kuò)繁菌液，進(jìn)行菌落PCR鑒定。

1.3 含XSYVrh融合基因煙草植株的獲得及初步篩選

1.3.1 煙草無菌苗的培養(yǎng)70%乙醇消毒T12煙草種子30 s后，用無菌水清洗2～3次，再用0.1%的HgCl2消毒8min，用無菌水清洗6～10次；將消毒后的種子置于MS固體培養(yǎng)基中，于25～26 ℃，14 h光照/10 h黑暗條件下萌發(fā)。14 d后將萌發(fā)出的T12煙草幼苗轉(zhuǎn)移至含有MS培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，相同條件下培養(yǎng)4～6周，其生長正常細(xì)嫩葉片可用于遺傳轉(zhuǎn)化。

1.3.2 農(nóng)桿菌工程菌菌液的準(zhǔn)備將農(nóng)桿菌工程菌LBA4404pART27XSYVrh接種在含20 mg·L1 Rif、50 mg·L1 Str和50 mg·L1 Kan的YEP固體培養(yǎng)基，于28 ℃條件下避光培養(yǎng)2 d后挑單菌落接種到同樣的YEP液體培養(yǎng)基中，于28 ℃、260 r·min1條件下避光振蕩培養(yǎng)24～36 h。將活化好的菌液按1∶50進(jìn)行放大培養(yǎng)，至OD600值為0.5。將達(dá)到對(duì)數(shù)生長期的菌液倒入50 mL無菌的離心管中，5 000 r·min1，離心10 min，棄上清，用MS液體培養(yǎng)基（pH7.0）重懸菌體。

1.3.3 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化煙草的方法煙草葉片不進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，在無菌條件下將煙草試管苗的成熟葉片剪去主脈和葉邊緣，再剪成0.5～1.0 cm2的小塊置于小燒杯中，倒入重懸好的菌液，使葉片與農(nóng)桿菌充分接觸，侵染8～10 min，其間不斷搖動(dòng)小燒杯，保證侵染均勻。時(shí)間到后，將菌液倒掉，用無菌水沖洗3次。先夾出葉片，再用無菌濾紙吸去葉片周圍多余的菌液，以葉片上表面接觸培養(yǎng)基，將葉片接到共培養(yǎng)基（MS + 6BA 1.0 mg·L1）中，每皿8～9片，培養(yǎng)皿用封口膜封口，倒置，28 ℃暗培養(yǎng)72 h左右，當(dāng)看到葉片與培養(yǎng)基接觸邊緣長出一圈白色農(nóng)桿菌時(shí)，先用無菌水清洗3次，之后用MS液體培養(yǎng)基洗滌2次，再用無菌濾紙吸干葉片表面的液體后，最后將葉片轉(zhuǎn)入添加有一定濃度Kan和Cb的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基（MS + 6BA 1.0 mg·L1 + Kan 100 mg·L1 + Cb 500 mg·L1）中，置于溫度（22±1）℃、光照強(qiáng)度3 000 lx，光照時(shí)間14 h·d1條件下培養(yǎng)20 d左右。

1.3.4 轉(zhuǎn)基因煙草抗性篩選待長出1～2 cm的誘導(dǎo)芽后，將誘導(dǎo)芽小心轉(zhuǎn)入到Kan減半并加有Cb的生根培養(yǎng)基（1/2MS + Kan 50 mg·L1 + Cb 300 mg·L1）中誘導(dǎo)生根并擴(kuò)繁，直到長成完整植株。

1.3.5 轉(zhuǎn)基因煙草的PCR檢測(cè)利用植物基因組DNA小量提取試劑盒，提取轉(zhuǎn)基因煙草植株的基因組DNA。參照方法1.2.3進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)。

2結(jié)果與分析

2.1 外殼蛋白基因的克隆及酶切鑒定

以PVXCP、PVSCP、PVYCP、PLRVCP的cDNA為模板，F(xiàn)X/RX、FS/RS、FY/RY、FV/RV4對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，觀察到4條大小分別為670、800、700、600 bp左右的片段，條帶大小與預(yù)期的片段大小一致（圖1：A）。進(jìn)一步比對(duì)得出，這4條序列與NCBI中已公布的PVX、PVS、PVY和PLRV四條片段的同源性在96%以上。將擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化后與pGMT載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，斑篩選陽性克隆，提取4種質(zhì)粒后對(duì)4種質(zhì)粒進(jìn)行EcoR I酶切，酶切結(jié)果表明：切出的條帶大小與預(yù)期的片段大小相符，如圖1：B所示。將鑒定正確的質(zhì)粒分別命名為pGMTX、pGMTS、pGMTY、pGMTV。

2.2 目的片段XSYVrh的融合

2.2.1 目標(biāo)基因片段PVXrh、PVSrh、PVYrh、PLRVrh的擴(kuò)增按照1.2.3所述方法中的PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序體系，分別以pGMTX、pGMTS、pGMTY、pGMTV質(zhì)粒為模板，將PVX1/PVX2、PVS1/PVS2、PVY1/PVY2、PLRV1/PLRV24對(duì)引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，觀察到4條300 bp左右大小的條帶，其大小與預(yù)期片段大小符合，如圖2所示。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化回收，分別命名為PVXrh、PVSrh、PVYrh、PLRVrh。

2.2.3 融合基因片段XSYVrh的酶切檢測(cè)將XSYVrh擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化后連接pGMT載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞， 利用藍(lán)白斑篩選5個(gè)陽性克隆， 對(duì)菌液進(jìn)行PCR檢測(cè)， PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)得到1 200 bp左右大小的片段（圖4：A），從圖中挑選一個(gè)條帶最亮最好的用堿裂解法從該條帶所對(duì)應(yīng)菌液中提取質(zhì)粒，命名為XSYVrh。對(duì)該質(zhì)粒XSYVrh進(jìn)行PCR檢測(cè)和Spe I、Sac I雙酶切檢測(cè)，PCR產(chǎn)物和酶切產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，均可分別觀察到1 200 bp左右的條帶（圖4：B，C）；該序列的測(cè)序結(jié)果表明：其大小與理論預(yù)期篩選出的無終止突變的約1 200 bp基因序列大小、順序均一致，相似度達(dá)100%，可以判斷四個(gè)片段已經(jīng)按照預(yù)期融合在一起。

2.3 植物表達(dá)載體pART27XSYVrh的構(gòu)建及其PCR和酶切鑒定

植物表達(dá)載體pART27XSYVrh構(gòu)建過程如圖5所示。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a后，提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR檢測(cè)，擴(kuò)增出1 200 bp左右的目的條帶（圖6：A）。雙酶切后可見約1 200 bp的目的條帶和線性載體（圖6：B），說明pART27XSYVrh植物表達(dá)載體構(gòu)建成功。

2.4 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的LBA4404pART27XSYVrh轉(zhuǎn)化及PCR鑒定

將構(gòu)建好的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌，挑取陽性克隆，對(duì)菌液進(jìn)行PCR鑒定，特異擴(kuò)增出約1 200 bp的目標(biāo)條帶（圖7）。結(jié)果表明，構(gòu)建的植物表達(dá)載體已成功轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404。

2.5 轉(zhuǎn)基因煙草的獲得及PCR檢測(cè)

陽性單菌落用于煙草轉(zhuǎn)化，其篩選過程中抗性苗的獲得如圖8所示。工程菌浸染后的葉片經(jīng)共培養(yǎng)、選擇培養(yǎng)及生根培養(yǎng)后，得到無菌抗性苗60株。以引物PVX1/PLRV2進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果表明陽性對(duì)照（質(zhì)粒pART27XSYVrh）和40株轉(zhuǎn)化植株擴(kuò)增出約1 200 bp大小的片段，而空白對(duì)照（ddH2O）、陰性對(duì)照（未轉(zhuǎn)化煙草）沒有擴(kuò)增出任何片段（圖9為PCR檢測(cè)的部分結(jié)果），初步證明XSYVrh融合基因已轉(zhuǎn)入煙草中。

3討論與結(jié)論

近年來， 利用病毒來源的基因獲得抗性轉(zhuǎn)基因植物已成為植物抗病毒育種的重要途徑?？茖W(xué)研究表明，表達(dá)病毒CP基因的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯能顯著延緩該病毒病害癥狀的發(fā)展并減輕其危害程度（A Hoekema et al，1989）。自1986年Abel et al （1986）

首先將煙草花葉病毒（TMV）的CP基因?qū)霟煵莴@得抗TMV的轉(zhuǎn)基因煙草以來，利用病毒的CP基因防治植物病毒病的例子已有許多，李奇科等（2009）利用馬鈴薯Y病毒（PVY）的CP基因獲得了穩(wěn)定、高效的抗病效果。美國孟山都公司最先獲得同時(shí)表達(dá)PVX和PVY CP基因的雙價(jià)轉(zhuǎn)基因馬鈴薯（Lawson et al，1990）。宋艷茹等（1994）首次獲得PVY+PLRV的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯株系。崔曉江等（1994）通過構(gòu)建載體獲得了同時(shí)抗PVY、PVX和PLRV的轉(zhuǎn)3基因馬鈴薯。但是，目前還未見轉(zhuǎn)4價(jià)病毒CP基因馬鈴薯的報(bào)道，而多個(gè)基因構(gòu)建在不同載體上轉(zhuǎn)入同一受體會(huì)因?yàn)檩d體間的相互影響而導(dǎo)致效率降低。本研究利用重疊延伸PCR技術(shù)將PVX、PVS、PVY和PLRV外殼蛋白基因通過末端互補(bǔ)、重疊延伸進(jìn)行體外重組連接，得到了融合基因片段XSYVrh，測(cè)序結(jié)果與預(yù)期XSYVyxz序列完全

一致，表明4種病毒外殼蛋白基因融合成功。用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化的煙草中，在獲得的轉(zhuǎn)基因煙草中，PCR檢測(cè)證明XSYVrh基因已整合到煙草基因組中，因而為該載體的進(jìn)一步廣泛應(yīng)用打下了基礎(chǔ)，希望借此獲得同時(shí)抗4種病毒的轉(zhuǎn)基因植物材料。若要從轉(zhuǎn)基因植株的抗性基因的拷貝、調(diào)控表達(dá)與功能等方面進(jìn)行研究，還要做Southern Blot、Northern Blot以及Western Blot，對(duì)轉(zhuǎn)入基因進(jìn)行全面了解，對(duì)其相應(yīng)的蛋白功能做全面研究。目前，實(shí)驗(yàn)室正在對(duì)獲得的抗性煙草植株進(jìn)行GUS瞬時(shí)表達(dá)檢測(cè)，以及蛋白分析與表達(dá)產(chǎn)物的生物活性檢測(cè)試驗(yàn)都仍在進(jìn)行之中。

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