蔣素華 張燕 王默霏 王潔瓊 崔波

摘要： 核酮糖1，5二磷酸羧化酶/加氧酶是光合碳同化作用的關(guān)鍵酶，它對(duì)調(diào)節(jié)鐵皮石斛Rubisco活性和光合速率具有直接的作用，對(duì)其進(jìn)行基因等方面的研究，會(huì)對(duì)改變植物光合速率打下良好基礎(chǔ)。該研究以一年生鐵皮石斛葉片為材料，采用 RTPCR和 RACE技術(shù)成功克隆了Rubisco活化酶（RCA）基因，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明：RCA基因全長(zhǎng)1 730 bp，命名為RCA2（GenBank登錄號(hào)KT205842），其中5′UTR 81 bp 、3′UTR 326 bp，開放閱讀框1 323 bp，編碼440個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量為48.53 kDa，等電點(diǎn)為6.19，包含Ploop NTPase 超家族基因結(jié)構(gòu)。氨基酸多重序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)RCA2核苷酸序列與蝴蝶蘭的相似性高達(dá)87%。RCA2編碼蛋白為親水性蛋白；亞細(xì)胞定位于葉綠體基質(zhì)；蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，α螺旋占30.68%，延伸鏈占25.45%，不規(guī)則折疊占43.86%。RCA2編碼蛋白質(zhì)的功能預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，RCA2在中間代謝起到了一個(gè)非常重要的角色。該研究發(fā)現(xiàn)對(duì)鐵皮石斛光合作用關(guān)鍵酶Rubisco 的分析可為其光合作用特性的發(fā)掘提供理論基礎(chǔ)，并為提高溫室大棚栽培效率提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞： 鐵皮石斛， RCA2基因， 克隆， 生物信息學(xué)分析

中圖分類號(hào)： Q949.71

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

文章編號(hào)： 10003142（2017）01008007

Abstract： Ribulose1，5bisphosphosphate carboxylase/oxygenase was a key enzyme of photosynthetic carbon assimilation， it had direct adjustive effects Rubisco activity and photosynthetic rate of in Dendrobium officinale， and laid a good foundation for changing plant photosynthetic rate by studying the gene. RCA gene was cloned from leaf of annual D. officinale using RTPCR and RACE， and was analyzed by bioinformatics. The results showed that the full length cDNA of RCA was 1 730 bp length， the cloned RCA gene was named RCA2（GenBank accession No. KT 205842）. It was contained a 5′untranslated region （5′UTR） （81 bp）， 3′UTR （326 bp），and an opening reading frame （ORF） （1 323 bp）， which could be translated into a 410aminoacid putative peptides with a molecular weight of 48.53 kDa and a theoretical pI of 6.19， with a domain of Ploop_NTPase superfamily. Multiple sequence alignment results showed that the homology of nucleotide sequence between the RCA2 and the reported Phalaenopsis genes was 87%. RCA2 protein was belong to hydrophilic protein，subcellular localization was in the chloroplast. The RCA2 protein secondary structure components showed that ahelix（h）， extended strand（e）， and random coil （c） accounted for 30.68%， 25.45% and 43.86%. RCA2 encoding protein function prediction showed that RCA2 played a very important role in intermediary metabolism. This study of the key enzymephotosynthesis Rubisco in Dendrobium officinale provides the information for the research of the photosynthetic characteristics， and the basis for improving the efficiency of greenhouse cultivation.

Key words： Dendrobium officinale， RCA2 gene， gene cloning， bioinformatics analysis

鐵皮石斛（Dendrobium officinale）屬于蘭科（Orchidaceae）石斛屬（Dendrobium）多年生的草本植物，鐵皮石斛含石斛多糖、石斛堿、雙芐酚類、菲酚類等多種藥效成分，是石斛屬藥用植物中最為珍稀名貴的種，具有滋陰清熱、潤(rùn)肺止咳、益胃生津、明目強(qiáng)身等作用（Zhang et al，2000）。核酮糖1，5二磷酸羧化酶/加氧酶（Ribulose1，5bisphosphate carboxylase /oxygenase，Rubisco）是存在于葉綠體內(nèi)的一個(gè)雙功能酶，同時(shí)催化卡爾文循環(huán)中最初固定CO2的反應(yīng)以及光呼吸作用中的第一步反應(yīng)，該酶處于光合碳還原和碳氧化兩個(gè)方向相反但又相互關(guān)聯(lián)的循環(huán)交叉點(diǎn)上，對(duì)凈光合速率起著決定性的影響，因此提高Rubisco 活力是提高光合作用的重要途徑（潘瑞熾等，2004）。因鐵皮石斛原生地的生境破壞和常年的濫采亂挖，野生資源遭到嚴(yán)重的破壞，瀕臨滅絕，已列入中國(guó)珍稀瀕危保護(hù)植物的名錄。由于石斛不能夠栽培在土壤里，北方地區(qū)必須栽培在樹皮、木塊、鋸末等做的栽培床或者是石頭上，冬天多數(shù)需要蓋溫棚等設(shè)施，投資較大，加上石斛種植的技術(shù)要求高， 目前市場(chǎng)尚未完全打開，發(fā)展速度還不是很快（張明等，2010）。

隨著生物技術(shù)的發(fā)展，許多糧食作物如大麥（Rundle & Zielinski，1991）、水稻（To et al，1999）、大豆（Yin et al，2014）等植物的RCA基因被克隆，但目前報(bào)道的RCA基因很少有涉及藥用觀賞植物，最近有朱明庫(kù)等（2013）對(duì)羽衣甘藍(lán)Rubisco 活化酶基因BoRCA的克隆、生物信息學(xué)及表達(dá)分析的研究；袁秀云等（2016）對(duì)蝴蝶蘭Rubisco活化酶基因PhRCAα的序列特征及在低溫脅迫下的表達(dá)分析的研究；祝欽瀧等（2011）對(duì)彩葉草Rubisco活化酶基因SsRCA進(jìn)行了組織表達(dá)特異性和光誘導(dǎo)表達(dá)特性研究；曾淑華等（2012）已從鐵皮石斛中克隆了光合碳途徑關(guān)鍵酶磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因。因此，開展鐵皮石斛RCA基因研究顯得尤為必要。本研究為了提高石斛的質(zhì)量，提高石斛光合效率，揭示鐵皮石斛光合作用機(jī)理自然成了鐵皮石斛研究領(lǐng)域的重要問(wèn)題，該研究利用RACE技術(shù)克隆出鐵皮石斛RCA2全長(zhǎng)基因，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為進(jìn)一步研究鐵皮石斛光合作用調(diào)節(jié)機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1 材料

鐵皮石斛原產(chǎn)地為貴州，現(xiàn)在種植于河南省鄭州市鄭州師范學(xué)院蘭花工程技術(shù)研究中心智能日光溫室，植物材料為一年生鐵皮石斛。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取選取一年生鐵皮石斛葉片，液氮速凍，保存于-80 ℃冰箱備用。葉片總RNA提取采用多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（Tiangen公司）；采用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA的完整性；采用 Quawell Q5000 微量紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定其A260/A280值及其濃度。

1.2.2 RCA2基因全長(zhǎng)的克隆以提取的葉片總RNA為模板，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成單鏈cDNA。根據(jù)GENBANK上已知植物的RCA保守區(qū)，利用DNAMAN和Primer 5.0生物軟件設(shè)計(jì)兼并引物（表1），擴(kuò)增RCA保守片段。PCR反應(yīng)體系為20.0 μL：10×PCR buffer 2.0 μL、dNTP Mix 2.0 μL、上游引物 RCAF1（10 μmol·L1） 1.0 μL、下游引物RCAR1（10 μmol·L1）1.0 μL、模板cDNA 1.0 μL、rTaq酶 （5 U·μL1 ） 0.2 μL，加滅菌雙蒸水至總體積 20.0 μL；反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性40 s，56 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。切膠回收目的片段，連接pGEMT Easy載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑選陽(yáng)性克隆送至上海英濰捷基生物技術(shù)公司測(cè)序，獲得RCA基因的保守區(qū)序列。再根據(jù)獲得的保守區(qū)序列，分別設(shè)計(jì)5′端和3′ 端特異性巢式引物（表1），以葉cDNA 為模板，用巢式PCR 方式分別擴(kuò)增RCA的5′ 端和3′ 端序列，按 Clontech 公司 SMARTerTM RACE 擴(kuò)增試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行反應(yīng)，回收擴(kuò)增目的產(chǎn)物，克隆到pGEMT Easy載體上，轉(zhuǎn)入大腸桿菌 DH5α菌株，進(jìn)行測(cè)序和拼接。

1.2.3 ORF的擴(kuò)增根據(jù) DNAMAN軟件拼接得到RCA基因序列全長(zhǎng)，利用Premier 5.0設(shè)計(jì)1對(duì)特異引物 RCAF2和 RCAR2（表1），用于完整開放閱讀框（ORF）的擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性45 s，58 ℃退火 45 s，72 ℃延伸1 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸15 min。ORF片段連接到pGEMT Easy載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，測(cè)序進(jìn)行ORF 序列驗(yàn)證。

1.2.4 生物信息學(xué)分析利用ORFfinder進(jìn)行開放閱讀框的預(yù)測(cè)；利用NCBI上的BLAST進(jìn)行基因相似性的分析（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/）；利用DNAMAN進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)分析；利用ProtScale程序（http：// expasy.org/tools/protscale.html）分析蛋白質(zhì)親疏水性；利用TargetP軟件（Using PLANT networks）和PSORT ll（http：//psort.hgc.jp/form.html）進(jìn)行亞細(xì)胞定位的分析；利用Protfun（http：//www.cbs.dtu.dk/services/ProtFun/）分析預(yù)測(cè)RCA2蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能和功能分類；利用ExPASy網(wǎng)站上的GOR進(jìn)行蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；利用ExPASy網(wǎng)站上的SWISSMODEL 進(jìn)行蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)分析。

2結(jié)果與分析

2.1 RCA2基因全長(zhǎng)克隆

葉片總RNA提取后經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性，檢測(cè)結(jié)果顯示，28S和18S條帶清晰，A260/A280值1.96，濃度為210.56 ng·μL1。

以鐵皮石斛葉片總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，以兼并引物RCAF1和RCAR2進(jìn)行保守區(qū)片段PCR擴(kuò)增，得到一個(gè)503 bp保守片段（圖1：B），根據(jù)設(shè)計(jì)的3′ 端和5′ 端特異引物，采用RACE技術(shù)，擴(kuò)增獲得3′端目的片段（圖1：D）和5′ 端目的片段（圖1：C）。利用生物軟件DNAMAN進(jìn)行序列拼接得到該基因的全長(zhǎng)為1 730 bp，利用ORFfinder分析，共有9個(gè)ORF，該基因最長(zhǎng)的ORF共計(jì)1 323 bp， 包含81 bp 的5′UTR、326 bp 的3′UTR，編碼440個(gè)氨基酸，將該基因命名為RCA2，GenBank登陸號(hào)為KT205842。利用引物RCAF2和RCAR2擴(kuò)增獲得1 323 bp ORF片段（圖1：A），連接到pGEMT Easy載體上測(cè)序驗(yàn)證，得到的陽(yáng)性質(zhì)粒命名為pGEMRCA2。

2.2 RCA2基因全長(zhǎng)的生物信息學(xué)分析

2.2.1 RCA2核苷酸及編碼蛋白序列的理化性質(zhì)利用blastp 和DNAMAN對(duì)RCA2氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)該基因包含Ploop NTPase Superfamily結(jié)構(gòu)域，分別為“WGGKGQGKS”（A區(qū)）和“GKMCCLFINDLD”（B區(qū)），屬于Ploop NTPase 超家族基因（圖2）。理化性質(zhì)分析該蛋白的分子質(zhì)量為48.53 kDa，等電點(diǎn)為6.19。將該基因全長(zhǎng)核苷酸序列在NCBI上進(jìn)行blastn相似性比較，結(jié)果表明基因均為RCA基因，且與蝴蝶蘭（Phalaenopsis）的相似性高達(dá)87%。氨基酸序列比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)其氨基酸序列與蝴蝶蘭、葡萄、荷花的相似性分別為89%、84%、85%（圖3）。

2.2.2 RCA2編碼蛋白質(zhì)的親疏水性分析利用ProtScale分析蛋白的親疏水性發(fā)現(xiàn)， RCA2蛋白質(zhì)序列具有較高的親水性，其中第69位的Thr親水性最強(qiáng)（-3.078），第162位Leu的疏水性最強(qiáng)（2.122）（圖4）。

2.2.3 RCA2編碼蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位蛋白的亞細(xì)胞定位與該蛋白所執(zhí)行的功能是密切相關(guān)的， 用TargetP和PSORT II軟件進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析，TargetP預(yù)測(cè)結(jié)果顯示RCA2蛋白定位于葉綠體基質(zhì)，可信度為3（圖5：A），用PSORT II預(yù)測(cè)蛋白顯示，RCA2蛋白定位于葉綠體基質(zhì)、線粒體基質(zhì)間隙、葉綠體類囊體膜、葉綠體類囊體腔，RCA2蛋白主要存在于葉綠體基質(zhì)（圖5：B）。

2.2.4 RCA2編碼蛋白質(zhì)的功能預(yù)測(cè)與分析利用Protfun software of CBS 分析預(yù)測(cè)RCA2蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能和功能分類，可能有意義的功能包括中間代謝、脂肪酸代謝、翻譯、輔酶因子的生物合成和能量代謝等，他們的幾率分別是5.484、4.387、4.048、3.639、3.098。這表明RCA2在中間代謝起到了一個(gè)非常重要的角色，在脂肪酸代謝、翻譯中起到了重要作用，在輔酶因子的生物合成和能量代謝中也起到了關(guān)鍵作用。

2.2.5 RCA2編碼蛋白質(zhì)的二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)采用ExPASy網(wǎng)站上的GOR進(jìn)行蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)果表明，α螺旋占30.68%，延伸鏈占25.45%，不規(guī)則折疊占43.86%（圖6）。用ExPASy網(wǎng)站上的SWISSMODEL Workspace預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)以4w5w.1.A（SMTL id）為模板進(jìn)行建模，該模板以XRAY 2.90 方法產(chǎn)生，與RCA2蛋白一致性為86.02%（圖7）。

3討論與結(jié)論

該研究通過(guò)RTPCR和RACE技術(shù)方法，成功克隆了鐵皮石斛RCA2基因（GenBank登錄號(hào)KT205842）全長(zhǎng)1 730 bp，開放閱讀框1 323 bp，編碼440個(gè)氨基酸；核苷酸序列分析結(jié)果表明，RCA2核苷酸序列與蝴蝶蘭（Phalaenopsis）的相似性高達(dá)87%，其編碼蛋白屬于Ploop NTPase Superfamily家族基因。蛋白理化性質(zhì)分析該蛋白的分子質(zhì)量為48.53 kDa，等電點(diǎn)為6.19，為親水性蛋白，RCA2編碼蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位于葉綠體基質(zhì)；編碼蛋白質(zhì)的功能包括中間代謝、脂肪酸代謝、翻譯、輔酶因子的生物合成和能量代謝等，蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)模型與RCA2蛋白一致性為86.02%，這些生物學(xué)參數(shù)為進(jìn)一步研究RCA2蛋白的酶學(xué)性質(zhì)及其在鐵皮石斛中的光合作用機(jī)理奠定了理論基礎(chǔ)。

Rubisco作為光合速率的限制性因子，近些年已成為提高植物光合效率的研究目標(biāo)之一，而 RCA對(duì)維持 Rubisco 的凈光合速率及初始羧化活力均有重要調(diào)節(jié)作用（張國(guó)等，2005） RCA自被Salvucci et al（2005）在擬南芥中報(bào)道以來(lái)，一直是農(nóng)業(yè)生物工程研究關(guān)注的焦點(diǎn)。當(dāng)RCA基因表達(dá)量降低時(shí)，植物的光合速率隨之下降，生長(zhǎng)也變慢， 因此通過(guò)調(diào)控RCA的表達(dá)提高光合作用，最終實(shí)現(xiàn)植株產(chǎn)量的增加，將會(huì)有廣泛及良好的前景（李海霞等， 2010）。Rubisco活化酶能維持并調(diào)節(jié)植物Rubisco 的活性，使 Rubisco 的活性位點(diǎn)因?yàn)榕c磷酸糖類物質(zhì)的結(jié)合而導(dǎo)致活性降低的不利影響得到最大程度的抑制，且能夠降低 Rubisco 去氨基甲?；瘯r(shí)所需CO2的濃度，顯著提高Rubisco 的活性，因此對(duì)調(diào)節(jié)植物光合速率有著直接作用 （Portis， 2003；Salvucci & CraftsBrandner， 2004； Zhang et al， 2002）。鐵皮石斛是藥用觀賞植物，其RCA基因的分子克隆、生物信息學(xué)的研究，為研究其他藥用觀賞植物RCA基因的結(jié)構(gòu)及功能提供了參考和借鑒價(jià)值，并為進(jìn)一步研究 Rubisco 活化酶在鐵皮石斛光合作用中的功能和分子調(diào)控機(jī)理奠定了基礎(chǔ)，其進(jìn)一步的相關(guān)研究工作正在進(jìn)行中。

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