劉孟　歐陽學軍　陳潔　全慧敏　葉萬輝　劉衛(wèi)

摘要： 基因組甲基化修飾受環(huán)境因素的影響。在以甲基化為代表的表觀遺傳學研究中，如何減少保存環(huán)境對異地采后樣品的影響，提高整個實驗的準確性和科學性，目前尚未有系統(tǒng)的認知。該研究選取5種常用的采后樣品保存方式（液氮冷凍、-20 ℃冷凍、變色硅膠干燥、密封袋密封、75%酒精浸泡），分別用Wilcoxon signed ranks tests統(tǒng)計分析和UPGMA聚類分析方法，對華南植物園錐栗進行FMSAP研究，以期找出最佳保存方式。同時，利用正交試驗法對FMSAP體系進行優(yōu)化，篩選出9對引物（E3H/M2；E5H/M2；E6H/M1；E6H/M5；E8H/M1；E8H/M5；E9H/M2；E11H/M5；E14H/M1），并對不同發(fā)育時期的錐栗甲基化水平及遺傳多樣性進行了論述。結(jié)果表明：在錐栗FMSAP的研究中，Willcoxon signed ranks tests統(tǒng)計分析和UPGMA聚類分析結(jié)論一致，密封袋保存效果最佳；成熟葉半甲基化率（27.83%）和總甲基化率（51.13%）高于幼葉（21.35%，45.90%），全甲基化率（23.30%）低于幼葉（24.55%），平均多態(tài)位點百分數(shù)39.60%，香農(nóng)信息指數(shù)0.207±0.002，表現(xiàn)出較高的甲基化水平和遺傳多樣性。

關(guān)鍵詞： 錐栗， 甲基化， FMSAP， 引物篩選， 樣品保存

中圖分類號： Q943

文獻標識碼： A

文章編號： 10003142（2017）01001508

Abstract： Genomic methylation characteristics were influenced by environmental factors. In the study of epigenetics， represented by DNA methylation， the preservation environmental of postharvest samples， especially the samples in the remote place， would have an influence on the later experiment. In this reason， standard sampling and preserve operation were crucial in the field of epigenetic. But the related research was few. Therefore， we studied Castanopsis chinensis in South China Botanical Garden with FMSAP sampling strategy using wilcoxon signed rank tests and unweighted pairgroup method with arithmetic means（UPGMA） methods， in order to find out the best way of sample preservation in five different environments （Liquid nitrogen， -20 ℃， allochroic silicagel， hermetic bag and 75% alcohol）. Using the orthogonal experiment method， we optimized the FMSAP system and screened nine pairs of primers （E3H/M2， E5H/M2， E6H/M1， E6H/M5， E8H/M1， E8H/M5， E9H/M2， E11H/M5 and E14H/M1）. Additionally， we briefly described different periods of methylation level and genetic diversity. The results showed that hermetic bag preservation was the most appropriate way. And the half and total methylation rate of mature leaves was 27.83% and 51.13%， higher than that of young leaves. The full methylation rate of mature leaves was 23.30%， lower than that of young leaves. The average percentage of polymorphic loci was 39.60%. Shannon information index was 0.207 ± 0.002， which showed a higher level of methylation and genetic diversity.

Key words： Castanopsis chinensis， methylation， FMSAP， primer selection， sample preservation

目前已有研究證據(jù)證明DNA甲基化這種重要的表觀遺傳方式，在植物生長發(fā)育及進化過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用， 并顯著影響所在DNA區(qū)域的遺傳變異速率（Johannes et al， 2009；Paun et al， 2010；Angers et al， 2010）。近年來，DNA甲基化已成為生物學研究的熱點之一，特別在植物學研究上，由于植物固著生長的特性，使之發(fā)展出以表型可塑性為主的適應(yīng)性機制，因此研究DNA甲基化對植物轉(zhuǎn)錄表達以及表型適應(yīng)性變化的影響已經(jīng)成為植物生理生態(tài)適應(yīng)機制和進化的主要手段之一（高樂旋等，2008）。但是，相對于基因組序列特征，DNA甲基化的選擇性可遺傳特征對實驗研究方法的影響卻極少被注意和研究。

從目前的研究看，一方面如低溫誘導(dǎo)的金魚草（Antirrhinum majus）的轉(zhuǎn)座子Tam 3序列的甲基化水平下降，在一個世代內(nèi)可逆地響應(yīng)溫度變化（Hashinda et al， 2003）；干早脅迫誘導(dǎo)水稻DNA甲基化水平發(fā)生變化，復(fù)水后有70%回復(fù)到初始狀態(tài)（Wang et al， 2010）；煙草異染色質(zhì)DNA受到脅迫后甲基化水平上升，當脅迫移除后部分可逆地去甲基化（Kovar et al，1997）。另一方面，許多研究表明，表觀遺傳變異與遺傳變異有緊密的聯(lián)系，且可遺傳的表觀遺傳變異具有適應(yīng)性，能夠影響適應(yīng)的速度和結(jié)果，有助于微進化（Kaeppler & Phillips， 1993； Stokes et al， 2002； Klironomos et al， 2013；Herrera et al， 2013）。許多由環(huán)境改變或脅迫引發(fā)的植物DNA甲基化，通過有絲分裂和減數(shù)分裂，可以在一些植物中遺傳數(shù)代（Calarco et al， 2012；Klose & Bird， 2006；Heard & Martienssen， 2014；Morgan et al， 2005； Paszkowski & Grossniklaus， 2011）。

甲基化的選擇性可遺傳性對具體的試驗研究帶來了特殊的要求?；蚪M內(nèi)，許多位點上甲基化特征的穩(wěn)定性較低，容易在短時間內(nèi)因環(huán)境因素而變化。尤其在木本植物的生態(tài)適應(yīng)機制的研究中，因采樣地點偏遠，采樣量大等現(xiàn)實問題，無法立即對DNA進行提取。而在以甲基化為代表的表觀遺傳研究中，樣品采后保存環(huán)境對后期實驗具有影響。因此，研究如何進行規(guī)范的采樣和樣品保存操作具有至關(guān)重要的現(xiàn)實意義。

錐栗作為森林生態(tài)系統(tǒng)的優(yōu)勢種，在生物多樣化格局形成中有著舉足輕重的地位（王崢峰等，2001）。尤其是從微觀角度研究錐栗遺傳多樣性分布格局和生理適應(yīng)性調(diào)節(jié)機制已然成為了研究熱點（王崢峰等，2004）。但在研究初期，錐栗樣品采集后，尤其是異地采樣后，如何科學完好的保存樣品，最大可能的減少外界環(huán)境因素對DNA甲基化的影響，則鮮有研究報道。因此，本文重點就華南植物園錐栗葉片不同保存方式對FMSAP的影響，不同生長階段甲基化水平及遺傳多樣性信息進行了系統(tǒng)研究，以期為研究錐栗甲基化修飾制定科學合理的采樣策略和遺傳多樣性分析提供理論指導(dǎo)。

1材料與方法

1.1 樣品采集

以華南植物園內(nèi)25棵錐栗作為研究對象，分別進行樣品保存試驗和老幼葉試驗。

樣品保存試驗：每棵錐栗采集5片健康成熟葉片，共125片。葉片沿中脈一分為二，一半為實驗組，一半為對照組。老幼葉試驗：任選3棵胸徑相近個體，每棵采3片成熟葉和3片幼葉，共18片。

采后樣品均立即帶回實驗室，進行下一步研究。

1.2 DNA提取

樣品保存試驗：5個試驗組（液氮冷凍處理組、-20 ℃冷凍處理組、變色硅膠干燥處理組、密封袋密封處理組、75%酒精浸泡組），處理24 h后，用改良的CTAB法提取DNA（陳昆松等，2004），對照組及老幼葉試驗葉片，采后立即提取DNA。

Nano Drop 2000/2000c 超微量紫外可見分光光度計和1%瓊脂糖凝膠電泳對DNA進行篩選檢測，-20 ℃冷凍保存。

1.3 FMSAP

熒光標記甲基化敏感擴增多態(tài)性（fluorescent labeled methylation sensitive amplified polymorphism， FMSAP）是在甲基化敏感擴增多態(tài)性（methylation sensitive amplification polymorphism， MSAP）的基礎(chǔ)上對選擇性引物進行了熒光標記。FMSAP包括4個反應(yīng)體系，酶切體系、連接體系、預(yù)擴增體系和選擇性擴增體系（褚會娟等，2011）。通過梯度設(shè)置參數(shù)，優(yōu)化體系中的酶切時間、連接時間、退火溫度及時間等因素，結(jié)合正交試驗法，對預(yù)擴增體系和選擇性擴增體系進行優(yōu)化，得到錐栗FMSAP技術(shù)的最優(yōu)反應(yīng)體系。接頭序列見表1。

酶切體系：50 μL（DNA 500 ng，10×Buffer 5 μL，EcoR Ⅰ 10 U，Hpa Ⅱ/Msp Ⅰ 10 U，10 mg·mL1 100×BSA 0.2 μL），37 ℃恒溫孵育6 h，65 ℃變性10 min。

連接體系：50 μL（酶切液12.5 μL，5 pmol·μl1 EcoR Ⅰ接頭1 μL，50 pmol·μl1 Hpa Ⅱ/Msp Ⅰ接頭1 μL， 5 U·μL1 T4連接酶0.5 μL，10×T4 Buffer 5 μL），16 ℃連接過夜，65 ℃變性8 min（Vos et al，1995）。

預(yù)擴增體系：25 μL（5 U·μL1 Taq聚合酶0.4 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，模板5 μL，2.5 pmol·μL1 dNTPs 1.6 μL，10 pmol·μL1引物各1 μL），94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，25個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

選擇性擴增體系：25 μL（5U·μL1 Taq聚合酶0.2 μL，2.5 pmol·μL1 dNTPs 1.6 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，10 pmol·μL1引物各3 μL），94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，65 ℃退火30 s，每個循環(huán)退火溫度降低0.7 ℃，72 ℃延伸1 min，12個循環(huán)；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，23個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.4 引物篩選

在EcoR Ⅰ、Hap Ⅱ/Msp Ⅰ通用引物的基礎(chǔ)上，通過添加隨機堿基，組合出128個引物對（Xiong et al，1999）。用優(yōu)化的FMSAP體系進行多態(tài)性擴增，產(chǎn)物先用1%瓊脂糖凝膠電泳初步篩選，再用6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳篩選，最終選出9對可擴增出完整清晰且多態(tài)性高條帶的引物對（表2，圖1）。

1.5 數(shù)據(jù)分析

利用GeneMarker2.2.0軟件讀取熒光標記引物擴增產(chǎn)物的高效毛細管電泳（High performance capillary electrophoresis，HPCE）結(jié)果（錢曉偉等，2014；李金龍等，2014），得到表示擴增片段大小的熒光峰值圖，選取30～500 bp的片段進行下一步的研究。

利用半?yún)^(qū)間放置法將表示片段大小的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成0/1二元數(shù)據(jù)矩陣，即某一特定位點，有條帶記為“1”，無條帶記為“0”（陳秋博等，2014；夏寒冰等，2009）。根據(jù)Hpa Ⅱ/EcoR Ⅰ和Msp Ⅰ/EcoR Ⅰ雙酶切位點帶型差異，將基因組甲基化模式分為3種：Ⅰ型，記作“11”，雙鏈內(nèi)胞嘧啶全甲基化；Ⅱ型，記作“10”，單鏈外胞嘧啶半甲基化；Ⅲ型，記作“01”，胞嘧啶未甲基化（Salmon et al，2008）。

根據(jù)Gervera et al（2002）的方法，把MSAP二元矩陣分為甲基化敏感多態(tài)矩陣（Methylation Sensitive Polymorphisms，MSP），即將原矩陣中“01”“10”的位點記為“1”，其它記為“0”，以及甲基化不敏感多態(tài)矩陣（Methylation Insensitive Polymorphisms，MISP），即將原矩陣中“11”位點記為“1”，其它記為“0”。

接著，將原始數(shù)據(jù)進行l(wèi)og函數(shù)歸一化標準處理，KolmogorovSmirnova檢驗，分析實驗組與對照組擴增片段數(shù)是否符合正態(tài)分布規(guī)律。如果符合，實驗組與對照組兩兩配對，用參數(shù)檢驗法進一步分析，否則，選擇非參數(shù)檢驗法（郭東星等，2000）。

2結(jié)果與分析

2.1 不同樣品保存方式對錐栗甲基化影響的統(tǒng)計分析

從篩選出的9對引物中選取3對（E3H/M2，E5H/M2，E9H/M2）分別對5種樣品保存處理組的DNA進行FMSAP擴增?；诨蚪M甲基化帶型分類，統(tǒng)計實驗組與對照組各帶型的擴增條帶數(shù)，然后通過兩兩配對的統(tǒng)計分析方法， 找出實驗組與對

照組差異最小的處理組，選出最優(yōu)樣品保存方式。KolmogorovSmirnova檢驗結(jié)果（表3）顯示，30組數(shù)據(jù)中有18組不符合正態(tài)分布規(guī)律。因此，實驗組與對照組配對差異性分析選用非參數(shù)檢驗法，Wilcoxon signed ranks tests，檢驗結(jié)果見表4。

Wilcoxon signed ranks tests 檢驗結(jié)果顯示，與自身對照組相比，用75%酒精保存的錐栗葉片，3種甲基化模式擴增條帶數(shù)均差異極顯著；用-20 ℃冷凍保存的，半甲基化、全甲基化擴增條帶數(shù)差異極顯著，未甲基化無顯著差異；用變色硅膠和液氮保存的，半甲基化和全甲基化擴增條帶數(shù)差異不顯著，未甲基化差異極顯著；用密封袋保存的，3種甲基化模式均無差異。

5種樣品保存方式對DNA甲基化修飾的影響程度由小到大依次為密封袋保存、液氮保存和變色硅膠保存、-20 ℃冷凍保存、75%酒精保存。初步判定最佳樣品保存方式是密封袋保存。

2.2 不同樣品保存方式對錐栗甲基化影響的聚類分析

利用非參數(shù)檢驗法，統(tǒng)計分析不同樣品保存方式下擴增條帶數(shù)差異，可以初步判定不同處理方式對DNA甲基化修飾影響的大小程度，但無法排除其中個體差異和位點差異。利用個體位點信息進行聚類分析，將相似組歸為一類，相異組進行區(qū)分，可以解決這個問題，驗證上述結(jié)論。

將5種處理組的實驗組與對照組各視為一類，根據(jù)基因頻率得到 MSP矩陣的Nei氏遺傳距離，用MEGA軟件進行非加權(quán)組（Unweighted pairgroup method with arithmetic means， UPGMA）聚類分析（圖2）（Zhang et al，2015）。結(jié)果顯示，隨著遺傳距離的增加，每種處理的實驗組與對照組先后聚在一起，依據(jù)聚在一起的先后順序，判定不同樣品保存方式對甲基化影響。影響程度由小到大依次為密封袋保存、變色硅膠保存、液氮保存，-20 ℃冷凍保存、75%酒精保存。與上述Wilcoxon signed ranks tests結(jié)果基本一致。最終得出結(jié)論，利用FMSAP技術(shù)對錐栗甲基化修飾進行研究時，密封袋保存采后葉片樣品，能最大程度的減少對后期實驗的影響，為最佳保存方式。

2.3 錐栗不同發(fā)育階段甲基化特異性分析

錐栗成熟葉和幼葉分別進行FMSAP擴增，成熟葉擴增出2 828條，幼葉3 377條。成熟葉半甲基化率（27.83%）和總甲基化率（51.13%）均高于幼葉（21.35%，45.90%），而全甲基化率（23.30%）低于幼葉（24.55%）（表5）。同一個體不同發(fā)育階段甲基化水平的差異，表明錐栗在生長發(fā)育過程中，生長環(huán)境的變化可能誘導(dǎo)了甲基化調(diào)控，出現(xiàn)了一定程度的去甲基化過程（孫慧敏，2013；郭廣平，2011）。

2.4 錐栗甲基化模式與遺傳多樣性分析

用樣品保存試驗對照組數(shù)據(jù)，對華南植物園錐栗甲基化模式與遺傳多樣性進行分析。擴增產(chǎn)物中共檢測出471個位點，總擴增條帶數(shù)56 488條，其中全甲基化條帶數(shù)15 920條，半甲基化條帶數(shù)13 340條，總甲基化率51.80%，平均多態(tài)位點百分數(shù)為39.60%，香農(nóng)信息指數(shù)0.207±0.002，說明華南植物園錐栗具有較高的甲基化水平和遺傳多樣性（表6）。

GenALEx軟件得出錐栗個體遺傳距離的范圍為71～175，通過設(shè)置重復(fù)個體，得到Nei Genetic Distance的范圍為 0.031～0.205（高寶嘉等，2010）。將MISP矩陣與MSP矩陣進行 Mantel檢驗，r=0.806，P=0.001，基因組遺傳變異與表觀遺傳變異顯著相關(guān)（覃光蓮和譚勁英，2014）。

利用Pearson相關(guān)分析將全甲基化率、半甲基化率、未甲基化率、總甲基化率分別與胸徑進行相關(guān)檢驗，相關(guān)系數(shù)分別0.215、-0.012、-0.14、0.131，即全甲基化率和總甲基化率與胸徑呈正相關(guān)，未甲基化率、半甲基化率與胸徑呈負相關(guān)。

3討論

植物從種子萌發(fā)到死亡的整個生命過程中，生物或非生物因素的誘導(dǎo)均伴隨著DNA甲基化的特異性改變（Vanyushin & Ashapkin， 2011）。DNA甲基化通常在植物中扮演兩個角色。一是保護基因組抵御轉(zhuǎn)座子的干擾，進而調(diào)控基因的表達（Chan et al， 2005）。在逆境脅迫下，通過DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的作用（Goll & Bestor， 2005）和相關(guān)機制，如RNA干擾（RNAi）的介導(dǎo)（Lukens & Zhan， 2007），甲基基團可以迅速、可逆地對植物基因組DNA進行修飾，避免過渡的、不必要的基因重組與種群多樣性（Boyko & Kovalchuk， 2008）。二是在物種受到環(huán)境脅迫時，DNA甲基化模式對不同逆境脅迫表現(xiàn)出不同的水平響應(yīng)（Verhoeven et al， 2010），使植物在環(huán)境脅迫下作出快速應(yīng)答（Peng & Zhang， 2009； Fulnecˇek & Kovarˇík， 2014），從而根據(jù)發(fā)育階段、環(huán)境誘因的變化對基因表達模式進行“可塑性”調(diào)節(jié)（Boyko & Kovalchuk， 2008； Grant-Downton & Dickinson， 2006； Rapp & Wendel； 2005）。

DNA甲基化所扮演的兩個角色使得其MSAP帶譜比AFLP蘊含更加復(fù)雜的機理。本研究從擴增產(chǎn)物位點差異和擴增產(chǎn)物總量差異兩個水平，利用統(tǒng)計分析和聚類分析的方法，分別分析了不同樣品保存方式之間FMSAP的差異。非參數(shù)檢驗法Wilcoxon signed ranks tests和UPGMA聚類結(jié)果表明，采后樣品保存方式顯著影響FMSAP的帶譜特征，24 h內(nèi)的常溫密封保存對樣品的影響最小，而其它保存條件顯著影響表觀遺傳修飾。

雖然目前有不少研究表明，甲基化遺傳變異標記（如FMSAP）可用于區(qū)分種內(nèi)遺傳差異。但在實際分析FMSAP結(jié)果時，情況可能更加復(fù)雜，特別在多年生木本植物中，我們的研究表明不同發(fā)育階段錐栗甲基化修飾的特異性以及胸徑與不同甲基化模式之間存在相關(guān)性（結(jié)果尚未公布）。今后，在對研究結(jié)果分析時，這些均值得重點關(guān)注。

植物在不同生長發(fā)育階段，通過表觀遺傳修飾介導(dǎo)基因表達，進而適應(yīng)環(huán)境的不斷變化。通常認為，DNA甲基化水平的升高通常抑制基因表達，而去甲基化可促進基因的表達（Suzuki & Bird， 2008）。Sherman & Talbert（2002）研究發(fā)現(xiàn)，春化可以通過降低冬小麥的甲基化水平誘導(dǎo)冬小麥開花。馬開峰等（2012）研究發(fā)現(xiàn)，毛白楊子代和親代之間甲基化水平和模式存在較大的差異；本研究分別對錐栗成熟葉和幼葉甲基化水平和模式進行分析，發(fā)現(xiàn)成熟葉擴增條帶數(shù)（2 828條）低于幼葉（3 377條），半甲基化率（27.83%）和總甲基化率（51.13%）高于幼葉（21.35%，45.90%）。成熟葉和幼葉DNA甲基化表現(xiàn)出的發(fā)育特異性，與前人在其他植物的研究結(jié)果一致。因此，在錐栗甲基化修飾研究過程中，有效區(qū)分不同生長發(fā)育階段的樣品，是制定合理有效采樣方案的前提。

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