田艷伶　李柏?！±钪据x　楊模華　張斌　周鑫偉

摘要： 該研究利用ISSR分子標(biāo)記，對(duì)分布于福建省內(nèi)5個(gè)樣地（ 邵武、建陽(yáng)、建甌、周寧和屏南）的61個(gè)野鉤錐（Castanopsis tibetana）單株的遺傳多樣性進(jìn)行了分析，并采用聚類分析方法探討了它們的遺傳關(guān)系。結(jié)果表明： 用10條ISSR引物從61個(gè)單株的基因組DNA共擴(kuò)增出158條帶，包含145條多態(tài)性條帶，多態(tài)性條帶百分率達(dá)91.77%，其中引物 UBC817、UBC819與UBC842的多態(tài)性條帶百分率（PPB）為100.0%。各居群的多態(tài)性條帶百分率（PPB）、有效等位基因數(shù)（Ne）、Neis基因多樣度（H）和Shannons多樣性指數(shù)（I）等各遺傳指數(shù)差異較大，其中各項(xiàng)遺傳指標(biāo)中最高的為邵武居群，而周寧居群則最低。5個(gè)居群的基因分化系數(shù)和基因流分別為0.144 0和2.973 0，說(shuō)明5個(gè)居群總遺傳變異的14.40%存在于居群間，85.60%存在于居群內(nèi)。種間總基因多樣度分別為0.395 8，種內(nèi)基因多樣度分別為0.338 8，表明鉤錐種間遺傳多樣性較高，且種間變異大于種內(nèi)變異。各居群間的遺傳距離差異較大； 其中，邵武與建甌居群的遺傳距離最近，僅為0.081 5； 建陽(yáng)和周寧居群的遺傳距離最遠(yuǎn)，為0.162 9。通過(guò)聚類分析可將5個(gè)鉤錐居群聚為3支，屏南與周寧的居群各自獨(dú)立聚為2支；來(lái)自邵武、建甌及建陽(yáng)的居群聚為一支，且可進(jìn)一步分為兩個(gè)亞支，建陽(yáng)居群為1個(gè)亞支，邵武和建甌居群聚為1個(gè)亞支。供試的鉤錐具有較高的遺傳多樣性，存在著較為頻繁的基因交流。該研究結(jié)果較準(zhǔn)確地揭示了鉤錐種間的遺傳多樣性。

關(guān)鍵詞： 鉤錐， ISSR標(biāo)記， 遺傳多樣性， 基因分化， 聚類分析

中圖分類號(hào)： Q943

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

文章編號(hào)： 10003142（2017）01004208

Abstract： Castanopsis tibetana is an evergreen hard wood tree of red Castanopsis， which is one of the excellent commercial tree species. C. tibetana has great development prospect and ecological value in China. In this paper， the genetic diversity of 61 individuals of C. tibetana collected from five plots （Shaowu， Jianyang， Jianou， Zhouning and Pingnan） in Fujian Province of China was analyzed by means of intersimple sequence repeat（ISSR） marker， and the genetic relationship among these individuals also was discussed by cluster analysis method. The results showed that 158 bands were amplified from genomic DNA of 61 C. tibetana individuals by ten intersimple sequence repeat （ISSR）primers， and there were 145 polymorphic bands with percentage of polymorphic band of 91.77%， in which， the percentage of polymorphic band of UBC817， UBC819 and UBC42 reached 100.0%. Percentage of polymorphic band（PPB）， effective number of alleles （Ne）， Neis gene diversity （H） and Shannons diversity index （I） were obviously different among five C. tibetana populations，in which all indexes of population in Shaowu were the highest，populations in Zhouning was the lowest. Gene differentiation coefficient and gene flow of five populations was 0.144 0 and 2.973 0，respectively， indicating that 14.40% of overall genetic variation of five populations exists among populations and 85.60% within populations. The gene diversity among species （Ht） and within species （Hs） were 0.395 8 and 0.338 8. It is suggested that the genetic diversity among species of C. tibetana was relatively rich and the interspecies variation degree was higher than intraspecies. Genetic distance among all populations differed obviously， and the genetic distance， between populations of Shaowu and Jianou was the nearest （only 0.081 5） while that between populations of Jianyang and Zhouning was the farthest （0.162 9）. Five populations could be divided into three groups by cluster analysis， in which populations of Pingnan and Zhouning were two separate groups，while three populations of Shaowu，Jianou and Jianyang were gathered into one group， which could be divided into two subgroups further， one was Jianyang population and another contained populations of Shaowu and Jianou. It is suggested that populations of C. tibetana tested possessed higher genetic diversity， and there were frequent gene exchange. The genetic diversity of C. tibetana could be accurately revealed by means of ISSR marker analysis.

Key words： Castanopsis tibetana， ISSR marker， genetic diversity， gene differentiation， cluster analysis

鉤錐（Castanopsis tibetana）為殼斗科錐屬 （Castanopsis）樹(shù)種，又名鉤栗或鉤栲，為常綠闊葉高大喬木，高達(dá)30 m；材質(zhì)堅(jiān)硬，耐水腐，為優(yōu)良的建筑、車(chē)船、家具和室內(nèi)裝飾用材（張宏達(dá)，1988；林敏和黃宗安，2003），屬紅錐類，為長(zhǎng)江以南極具重要開(kāi)發(fā)前景的珍貴用材樹(shù)種。有關(guān)鉤錐方面的研究尚不多見(jiàn)，已有的研究主要集中在種群生態(tài)及生命表分析（林敏和黃宗安，2003；張嘉生，2005）、種子特性（王佩蘭等，2013）與播種育苗（陳養(yǎng)，2007；李純教，2012）等方面，目前還無(wú)任何研究涉及鉤錐分子水平這一方面。對(duì)鉤錐種群生態(tài)研究的結(jié)果表明，現(xiàn)存的鉤錐常散生于常綠闊葉林中，居群規(guī)模小、更新情況差，居群處于衰退狀態(tài)（林敏等，2003；李純教，2012）。因此，在分子水平上對(duì)鉤錐居群進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)及其遺傳多樣性，可為鉤錐珍貴用材林的營(yíng)建、應(yīng)用與推廣提供必要的理論依據(jù)，也能為鉤錐種質(zhì)資源的有效保護(hù)提供相關(guān)的遺傳改良策略。

ISSR分子標(biāo)記，即簡(jiǎn)單重復(fù)序列區(qū)間擴(kuò)增多態(tài)（ intersimple sequence repeat）分子標(biāo)記。此標(biāo)記不受環(huán)境與季節(jié)等外在因素影響，能有效揭示整個(gè)基因組的一些特征，用于檢測(cè)2個(gè)SSR之間一段DNA 序列上的多態(tài)性（Zietkiewicz & Rafalski，1994）。ISSR具有操作方便、模板用量少、產(chǎn)物多態(tài)性豐富和結(jié)果重復(fù)性高等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛用于林木種質(zhì)資源遺傳結(jié)構(gòu)、品種鑒定與遺傳多樣性分析（李海生和陳桂珠，2004；趙冰和張啟翔，2008；李乃偉等，2011）。目前，ISSR標(biāo)記技術(shù)主要運(yùn)用于種質(zhì)資源鑒定（Fang et al，1988）、指紋圖譜構(gòu)建（Cho et al， 2002）、遺傳多樣性分析（Ge & Sun，1999；）和親緣關(guān)系研究（林樂(lè)靜等，2015）等方面。本研究通過(guò)ISSR分子標(biāo)記技術(shù)，在遺傳結(jié)構(gòu)與遺傳多樣性等方面對(duì)5個(gè)福建野生居群進(jìn)行了遺傳分化水平比較，采用聚類分析方法對(duì)鉤錐不同居群進(jìn)行了遺傳關(guān)系的研究，為進(jìn)一步評(píng)價(jià)鉤錐種質(zhì)資源的遺傳多樣性提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1 材料

于2013年7月，在福建邵武、建陽(yáng)、建甌、周寧和屏南選取了5個(gè)鉤錐野生居群61個(gè)單株（表 1）。對(duì)各居群進(jìn)行了種質(zhì)資源調(diào)查，采集了具有代表性的待測(cè)樣品，選取的植株無(wú)病蟲(chóng)害且生長(zhǎng)狀況良好，將采集好的健康嫩葉裝于編號(hào)的錫箔紙中包好，再放入裝有適量硅膠的封口袋中，及時(shí)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，于-70 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

所用儀器和試劑： Eppendorf Centrifuge 5415R冷凍離心機(jī)，GeneAmp PCR System 9700擴(kuò)增儀，WH2微型旋蝸混合儀，電熱恒溫水浴鍋，DYY12型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀，BioRad紫外凝膠成像儀。ISSR 引物的設(shè)計(jì)參考加拿大哥倫比亞大學(xué)（UBC）（余艷等，2003），由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成； Marker由廣州東盛生物科技有限公司提供；dNTPs、Taq DNA 聚合酶和 10×PCR buffer 等購(gòu)自TINGEN公司。

1.2 方法

1.2.1 鉤錐DNA提取每個(gè)鉤錐樣品稱取3 g，液氮中充分粉碎，采用天根試劑盒法提取鉤錐總DNA（田艷伶等，2015），-20 ℃的冰箱儲(chǔ)存、備用。

1.2.2 引物的篩選參照錐栗ISSR遺傳分析中引物篩選的方法（龔榜初和劉國(guó)彬，2013），通過(guò)對(duì)100條ISSR引物進(jìn)行篩選，共篩選出10條譜帶清晰，信號(hào)強(qiáng)且，重復(fù)性好且擴(kuò)增結(jié)果穩(wěn)定的引物，用于本研究鉤錐遺傳結(jié)構(gòu)分析。

1.2.3 PCR 擴(kuò)增與檢測(cè)ISSRPCR反應(yīng)體系總體積為20 μL，含30 ng模板DNA，0.4 mmol·L1 dNTPs，0.75 U Taq DNA聚合酶，3 mmol·L1 Mg2+， 0.3 μmol·L1引物，用純水補(bǔ)足。鉤錐ISSRPCR反應(yīng)擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性2 min；然后于94 ℃變性30 s、50～59.3 ℃退火30 s（根據(jù)不同引物的Tm值而設(shè)定具體退火溫度）、68 ℃延伸2 min 30 s，共40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min保存。用質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為0.7%的瓊脂糖凝膠（含少量溴化乙錠）電泳30～35 min（4～5 V·cm1）（田艷伶等，2015），電泳結(jié)束后在紫外凝膠成像儀上成像并檢測(cè)鉤錐DNA的提取濃度及其質(zhì)量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析

將清晰、多態(tài)性好、遷移率相同的條帶按照同源位點(diǎn)進(jìn)行處理，條帶出現(xiàn)，賦值“1”，沒(méi)出現(xiàn)賦值“0”，通過(guò)圖形資料轉(zhuǎn)化成1、0二元數(shù)據(jù)矩陣的數(shù)據(jù)資料。按照Neis（1979）的方法，通過(guò)Popgene 1.32軟件，在假定種群處于哈迪-溫伯格平衡前提下，計(jì)算分析總遺傳多樣性指數(shù)（Ht）、居群間基因分化系數(shù)（Gst）、Neis居群內(nèi)遺傳多樣性指數(shù)（Hs）、Neis標(biāo)準(zhǔn)遺傳距離（GD）、遺傳一致度（GI）、居群間基因流（Nm*）；采用NTSYSpc version 2.10軟件計(jì)算5個(gè)居群61個(gè)鉤錐樣品的遺傳相似性系數(shù)（SC）和和遺傳距離（DS），聚類分析采用UPGMA 法對(duì)遺傳關(guān)系進(jìn)行研究分析。

2結(jié)果與分析

2.1 ISSRPCR 擴(kuò)增結(jié)果分析

利用優(yōu)化的反應(yīng)體系從100條ISSR 引物中篩選出多態(tài)性高、重復(fù)性好的10條引物進(jìn)行ISSR分析，10條引物的序列以及擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)表2。從表2可見(jiàn)，10 條引物中（AC）n、（AG）n、（GA）n引物占多數(shù)，說(shuō)明鉤錐基因中可能存在大量的（AG） 二核苷酸重復(fù)序列。不同引物組合擴(kuò)增出不同的多態(tài)性條帶數(shù)，本研究的10條引物片段長(zhǎng)度為250～2 000 bp，共擴(kuò)增出了158條清晰條帶，其中多態(tài)性條帶145條；參試引物擴(kuò)增條帶數(shù)為13～19條，平均每條引物檢測(cè)到的條帶數(shù)為15.8。其中檢測(cè)出的條帶數(shù)最多的為引物UBC808，達(dá)19條；而數(shù)量最少的為UBC846號(hào)引物，僅13條。其中，多態(tài)性條帶數(shù)最多的為UBC880號(hào)引物（18條）；而多態(tài)性條帶數(shù)最少的為UBC830號(hào)引物（11條）。各引物的多態(tài)性條帶百分率（PPB）為73.30%～100.00%，平均為91.77%； 其中 UBC817、 UBC819和 UBC842號(hào)引物擴(kuò)增的PPB均達(dá)到 100. 00%。由此可見(jiàn)，供試的5個(gè)鉤錐居群具有較豐富的遺傳變異和遺傳多樣性。

2.2 鉤錐居群遺傳多樣性分析

表3中記錄了采用ISSR分子標(biāo)記對(duì)福建5個(gè)鉤錐居群進(jìn)行的遺傳多樣性指標(biāo)分析，結(jié)果表明：參試各居群的多態(tài)性條帶數(shù)、多態(tài)性條帶百分率（PPB）、有效等位基因數(shù)（Ne）、Shannons 多樣性指數(shù)（I）和Neis 基因多樣度（H）均有明顯差異。邵武居群的各項(xiàng)指標(biāo)均最高，明顯高于其他 4 個(gè)居群；而周寧居群的各項(xiàng)遺傳指標(biāo)則最低。5 個(gè)鉤錐居群的多態(tài)性條帶百分率為84.81% ～ 91.14%，平均值為88.61%； 觀測(cè)等位基因數(shù)（Na）為1.848 1～1.911 4，平均值為1.886 1； 有效等位基因數(shù)（Ne）為1.551 7～1.630 7，平均值為1.588 7； Neis 基因多樣度（H）為0.323 1～0.362 2，平均值為0.337 8； Shannons信息指數(shù)（I） 為0.480 6～0.531 3，平均值為0.499 8。多態(tài)性條帶百分率最高的為邵武（91.14%），建陽(yáng)和建甌次之（90.51%），而屏南（86.08%）和周寧（84.81%）則最低； Ne、H和I等遺傳指數(shù)最高的均是邵武，建陽(yáng)和建甌次之，屏南略低，而周寧則最低。這表明鉤錐居群間的遺傳多樣性水平較高。

本研究進(jìn)一步利用AMOVA軟件 （Excofier， 1992）對(duì)分布于福建的鉤錐居群內(nèi)和居群間的分子變異進(jìn)行了分析。從表4結(jié)果可以看出，鉤錐居群間變異占13.81%，居群內(nèi)變異占86.19%，居群內(nèi)和居群間的變異均極顯著（P<0.001）。

從兩種方法得出的數(shù)據(jù)可知， Neis遺傳多樣性分析的結(jié)果和AMOVA分析所得結(jié)果相差不大。

2.3 不同種源間的遺傳距離及聚類分析

根據(jù)ISSR擴(kuò)增結(jié)果組成二元數(shù)據(jù)矩陣，用SM方法計(jì)算5個(gè)鉤錐居群的遺傳相似系數(shù)（表4）。表4結(jié)果表明，邵武和建甌居群的遺傳距離最近，僅為0.081 5，表明親緣關(guān)系很近。建陽(yáng)與周寧居群的遺傳距離最遠(yuǎn)，為0.162 9，表明親緣關(guān)系很遠(yuǎn)，可能與其分布地距離相對(duì)較遠(yuǎn)、生長(zhǎng)環(huán)境差異較大有關(guān)。5個(gè)鉤錐居群的遺傳距離平均值為0.126 6。

依據(jù)遺傳距離，進(jìn)行UPGMA聚類分析，獲得基于ISSR的5個(gè)不同鉤錐居群間的聚類圖（圖1）。從表4和圖1可以看出，當(dāng)λ=0.89時(shí)，可將5個(gè)鉤錐居群聚為兩支，邵武、建甌、建陽(yáng)和屏南居群聚為一支；周寧的居群?jiǎn)为?dú)聚為一支。當(dāng)λ=0.90時(shí)，5個(gè)鉤錐居群聚為3支，屏南與周寧的居群各自聚為一支；來(lái)自邵武、建甌及建陽(yáng)的居群聚為一支，細(xì)分為建陽(yáng)居群亞支和邵武和建甌居群亞支。

通過(guò)軟件NTsysPc2.10，對(duì)來(lái)自不同居群的61個(gè)鉤錐個(gè)體進(jìn)行了UPGMA聚類分析，從圖2的遺傳關(guān)系聚類圖我們可以得出，在遺傳關(guān)系上和遺傳結(jié)構(gòu)相一致。從圖2可以看出，當(dāng)相似系數(shù)為0.545時(shí)，61個(gè)鉤錐個(gè)體可分為三大類，第一類為采自邵武、建甌和建陽(yáng)的38個(gè)單株；采自屏南的10個(gè)單株聚為第二類；而采自周寧的13個(gè)單株則聚為第三類。從整體來(lái)看，各地區(qū)資源有規(guī)律的聚類在一起，能按地區(qū)單獨(dú)聚類。

2.4 基因分化

通過(guò)POPGENE 軟件對(duì) 5 個(gè)鉤錐居群進(jìn)行遺傳分化分析，得出的在種水平上的基因多樣度為0.013 5，在居群水平上鉤錐的基因多樣度為0.016 7，基因流為2.973 0；基因分化系數(shù)（Gst） 為0.144 0，即 5 個(gè)居群總的遺傳變異主要發(fā)生在居群內(nèi)（ 85.60%） ，總變異的14.40% 來(lái)自居群間。

3討論

本研究中，用10個(gè)寡聚核苷酸隨機(jī)引物擴(kuò)增了5個(gè)鉤錐居群的基因組DNA，獲得了158條清晰穩(wěn)定的DNA譜帶，多態(tài)性譜帶145條，多態(tài)性條帶百分率（PPB）達(dá)到91.77%，根據(jù)譜帶的差異較好地區(qū)分了5個(gè)參試鉤錐居群。Hamrick et al（1992）研究發(fā)現(xiàn)多數(shù)多年生木本樹(shù)種平均多態(tài)位點(diǎn)百分?jǐn)?shù)為 65%。由此可知，供試的鉤錐有豐富的遺傳多態(tài)性。利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)能快速準(zhǔn)確地檢測(cè)其遺傳變異，也為鉤錐提供了分子標(biāo)記輔助選擇與評(píng)價(jià)的技術(shù)方法。5個(gè)鉤錐居群61份樣品的基因組DNA多態(tài)性程度、平均Shannon信息指數(shù)及平均Neis基因多樣性指數(shù)均較高，表明鉤錐對(duì)其生存環(huán)境有很強(qiáng)的適應(yīng)能力。

聚類分析表明地理分布距離近的鉤錐居群聚類在一起，說(shuō)明這些居群間的遺傳背景差異較小。來(lái)自邵武、建甌和建陽(yáng)居群聚為一類，且邵武與建陽(yáng)居群間的遺傳距離大于和建甌之間的遺傳距離，表明在親緣關(guān)系上來(lái)看，邵武和建甌居群之間的較近；而來(lái)自屏南和周寧的居群則各自獨(dú)立分為兩支，說(shuō)明兩者的遺傳差異很相對(duì)較大。同種居群間的遺傳距離一般為 0.03～0.20，相似系數(shù)一般為 0.80～0.975的福建鉤錐居群間存在著一定的遺傳分化，是因?yàn)槠涫墉h(huán)境差異和地理隔離等因素的影響，然而，根據(jù)Thorpe（1982）的標(biāo)準(zhǔn)理論值來(lái)看，這5個(gè)鉤錐居群仍然屬于同一地理群體。

從反映物種遺傳多樣性的多個(gè)參數(shù)上，包括物種水平的Neis基因多樣度（0.337 8）、Shannons多樣性指數(shù) （0.499 8） 和多態(tài)性條帶百分率（91.77%）等，均揭示了福建鉤錐種內(nèi)具有較為豐富遺傳多樣性，且其N(xiāo)eis 基因多樣度前人所較研究過(guò)的一般針闊葉樹(shù)種的估算值（0.206）還要高

（Thorpe，1982；Hamrick et al， 1992；張青林和羅正榮，2004）。

基因流（Nm），是影響居群內(nèi)部和居群間遺傳變異程度的重要因素。在群體遺傳學(xué)理論中， Hamrick et al（1992）和Wright（1931）的研究表明，不管居群大小，當(dāng)基因流大于或等于1時(shí)，就能防止居群間因遺傳漂變而引起的遺傳分化；若基因流Nm<1，遺傳漂變就成為刻劃種群遺傳結(jié)構(gòu)的主導(dǎo)因素。本研究通過(guò)POPGENE 軟件得出鉤錐基因流為2.973 0，大于1，故能防止鉤錐居群間因遺傳漂變而引起的遺傳分化

由于本研究的實(shí)驗(yàn)材料采樣范圍相對(duì)集中，取自福建省內(nèi)的5個(gè)山區(qū)，并不能完全地揭示出鉤錐的全部遺傳背景，故仍需做好擴(kuò)大鉤錐種質(zhì)資源的收集的工作，最好對(duì)已發(fā)現(xiàn)的具有代表性的?。▍^(qū)）（如浙江、廣西、湖南等）進(jìn)行樣品采集，并采用多種方法對(duì)鉤錐進(jìn)行遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)的研究分析，為我們科學(xué)地經(jīng)營(yíng)、管理、保護(hù)和利用鉤錐野生種質(zhì)基因資源，維持其豐富的遺傳育種潛力和遺傳多樣性奠定基礎(chǔ)。

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