張林甦 邵芬娟 秦利軍

摘要： 為了獲得滿足不同目的組織培養(yǎng)材料和穩(wěn)定高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系，該研究以丹參葉片和莖段為外植體，采用含不同濃度的植物激素（植物生長物質(zhì)）的Murashige Skoog（MS）培養(yǎng)基，探索誘導(dǎo)丹參產(chǎn)生不同愈傷的條件；采用正交法考察浸染時(shí)間、共培養(yǎng)時(shí)間、篩選壓等對農(nóng)桿菌介導(dǎo)的丹參遺傳轉(zhuǎn)化體系的影響，并根據(jù)出芽率及轉(zhuǎn)化陽性率優(yōu)化丹參遺傳轉(zhuǎn)化體系。結(jié)果表明：（1）能較快誘導(dǎo)丹參葉片產(chǎn)生愈傷的是MS+0.5 mg·L1 6BA+0.5 mg·L1 2，4D；誘導(dǎo)莖較快產(chǎn)生愈傷的是MS+0.1mg·L1 NAA+0.5 mg·L1 6BA； 1 mg·L1反式玉米素（ZR）可能有利于誘導(dǎo)產(chǎn)生含有丹參酮的愈傷組織；1.0 mg·L1 2，4D較易誘導(dǎo)丹參愈傷組織生根。（2）以卡那霉素為篩選劑時(shí)農(nóng)桿菌GV3101介導(dǎo)的丹參遺傳轉(zhuǎn)化的條件為浸染5 min、共培養(yǎng)1 d、卡那霉素30 mg·L1篩選，經(jīng)PCR鑒定轉(zhuǎn)基因陽性率為60%；而用10 mg·L1鏈霉素篩選陽性率達(dá)70%。該研究結(jié)果確定了丹參不同愈傷組織誘導(dǎo)條件，明確了以卡那霉素為篩選劑時(shí)農(nóng)桿菌GV3101介導(dǎo)的丹參遺傳轉(zhuǎn)化的條件，換用10 mg·L1鏈霉素篩選時(shí)體系更加穩(wěn)定、更易操作、更易重復(fù)。

關(guān)鍵詞： 丹參， 愈傷， 誘導(dǎo)， 遺傳轉(zhuǎn)化

中圖分類號： Q943.1， Q94336

文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A

文章編號： 10003142（2017）01010207

Abstract： With the decoding of its genome， Salvia miltiorrhiza， belonging to labiatae （Lamiaceae） sage （Salvia Linn）， is becoming an important model medicinal plant and is being widely studied. The earliest record of S. miltiorrhiza can be found in more than two thousand years ago in the Sheng Nongs Herbal Classic in which S. miltiorrhiza was listed as one of the top grade drugs. S. miltiorrhiza has a long history in treatment of many cardiovascular and cerebrovascular diseases. The active components of S. miltiorrhiza are divided into two categories： watersoluble phenolic acids and lipidsoluble tanshinones. As an important medicinal mode plant with long history， the biosynthetic pathways of S. miltiorrhiza active contents tanshinones and phenolic acids attract growing research interests. An appropriate tissue culture condition and a simple， stable and efficient genetic transformation system are very important in the research of the plant S. miltiorrhiza. Based on former studies， we investigated culture conditions to induce different S. miltiorrhiza calluses using different phytohormones on Murashige Skoog medium. And through a four factorthree level orthogonal design， we investigated the effects of submerging time， coculture time， screening pressure and concentrate of acetosyringone. The results of callus induction were that： MS+0.5 mg·L1 6BA+0.5 mg·L1 2，4D induce callus faster than other explants， while MS+0.1 mg·L1 NAA+0.5 mg·L1 6BA was suitable in inducing stems； 1 mg·L1 transzeatin could induce brawn callus maybe contain more tanshinone， 1.0 mg·L1 2，4D could induce more roots on callus. And the confirmed agrobacteriummediated genetic transformation parameters for agrobacterium tumefaciens GV3101 harboring nptII gene plasmid were： submerging 5 min， coculture 1 d and screening at 30 mg·L1 kanamycin， the positive ratio of transgenic plant by PCR verification was 60%. When submerging 5 min， coculture 1 d and screening at 10 mg·L1 streptomycin the transgenic plant positive rate was 70%. The later transgenic system seemed more stable and easier to be repeated in this trial， maybe due to the less toxic of streptomycin which indicated that streptomycin maybe another candidates for transgenic screening in S. miltiorrhiza. The determination of different callus inducing condition and the optimizing of genetic transformation system provide useful appliancation in further researches of S. miltiorrhiza.

Key words： Salvia miltiorrhiza， callus， induction， genetic transformation

丹參（Salvia miltiorrhiza）為鼠尾草屬（Salvia Linn.）植物，其藥用歷史悠久，最早記載于

瘙爯神農(nóng)本草經(jīng)

瘙爲(wèi)和

瘙爯吳普本草

瘙爲(wèi)，現(xiàn)臨床上廣泛應(yīng)用于心腦血管等多種疾病的治療（趙陽等，2010；李佑生等，2006；戈升榮等，2002）。丹參的有效成分為兩大類代表性次生代謝物質(zhì)：萜類（丹參酮）和酚酸類（丹酚酸）（鄭國墀和柿澤寬，1989； Ma et al，2012； Ma et al，2015）。同時(shí)，由于丹參基因組較小，生長條件簡單、生長周期快，已經(jīng)成為研究藥用植物萜類和酚酸類的模式植物（宋經(jīng)元等，2013）。隨著模式植物如擬南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻（Oryza sativa）、楊樹（Populus）等在分子水平上的研究不斷深入，為人們認(rèn)識和了解植物的生長發(fā)育及其調(diào)控機(jī)理提供了大量的參考（Mukherjee et al，2015；Del ToroDe et al，2016； Shi et al，2015；Ding & Nilsson， 2015）。因此，組織快繁再生、遺傳轉(zhuǎn)化等技術(shù)是對植物進(jìn)行研究的重要基礎(chǔ)。

丹參的組織培養(yǎng)條件寬泛，一定范圍內(nèi)的植物激素（植物生長物質(zhì)）配比均能誘導(dǎo)出愈傷并再生植株（王建英和劉滌，1987；胡月紅等，1992；姜廣奮，1994；趙潔等，1999；田宇紅和王喆之等，2003）。郭肖紅等（2007a， b）主要從培養(yǎng)基的氮源、碳源及有機(jī)物等方面研究了丹參不定根的培養(yǎng)條件，張蔭麟等（1997）用發(fā)根農(nóng)桿菌和根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化丹參得到冠癭瘤和毛狀根再生得到丹參植株，但是他們沒有轉(zhuǎn)入目的基因，沒有涉及抗性篩選的步驟。這些研究對于丹參的組織培養(yǎng)具有重要意義，但是至今還沒有系統(tǒng)性的試驗(yàn)，尤其是從不同植物激素的影響來探討丹參不同愈傷產(chǎn)生的條件，而這些不同愈傷對于丹參的進(jìn)一步研究具有重要意義。對于丹參的遺傳轉(zhuǎn)化體系，最早是王倩（2005）、王麗娟（2005）和Yan & Wang （2007）報(bào)道了用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系，他們構(gòu)建了含有目的基因的載體并經(jīng)根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化丹參葉片獲得陽性植株。Cui et al （2015）也用RNAi載體成功轉(zhuǎn)化出轉(zhuǎn)基因丹參。但是由于丹參品種不同、載體不同、農(nóng)桿菌不同等原因，本實(shí)驗(yàn)室在丹參遺傳轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)采用已有方法其結(jié)果隨機(jī)性較大，很多時(shí)候轉(zhuǎn)化后的丹參葉片停止生長。因此在參閱已有文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，筆者摸索了丹參葉片和莖段為外植體誘導(dǎo)不同愈傷產(chǎn)生的條件，用正交法系統(tǒng)地對丹參遺傳轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行了研究，優(yōu)化得到較易重復(fù)的遺傳轉(zhuǎn)化體系，為丹參植物的組織培養(yǎng)研究提供了更多的基礎(chǔ)工具。

1材料與方法

1.1 材料和試劑

丹參苗（993品系）由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所盧善發(fā)實(shí)驗(yàn)室擴(kuò)繁保存。帶有NPTII基因激活標(biāo)簽載體由筆者先期構(gòu)建，并轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101。植物激素6BA、NAA、2，4D及瓊脂粉為Sigma公司產(chǎn)品，硫酸卡那霉素為Amresco公司產(chǎn)品，MS培養(yǎng)基粉末購自phytotech公司，DNA提取試劑盒購自北京艾德萊生物公司，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 丹參組織培養(yǎng)

切下丹參993成熟無菌苗帶腋芽的莖段接種于1/2MS培養(yǎng)基（含30%蔗糖，0.85%的瓊脂）繼代，2個(gè)月左右長成成熟植株，取較為幼嫩的丹參葉片切成0.5 cm × 0.5 cm的方形，莖段1 cm左右，接種在附加不同濃度植物激素的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，10 d左右更換一次培養(yǎng)基，15～20 d觀察愈傷及不定芽出芽情況。切下不定芽接種于1/2MS培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)。待1～2個(gè)月后丹參苗生根較多、苗較壯時(shí)移栽在土里繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 丹參遺傳轉(zhuǎn)化

1.3.1 殺死濃度范圍的確定本實(shí)驗(yàn)激活標(biāo)簽載體以PBI121為基本載體改造得到，含有NPTII基因，可編碼編碼新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶，產(chǎn)生卡那霉素抗性，因此選用不同濃度的卡那霉素來確定殺死濃度范圍（killing scale），同1.2的操作，將丹參無菌葉片切成塊后接種在附加不同濃度卡那霉素的MS培養(yǎng)基中（含NAA 0.1 mg·L1+BA 1.0 mg·L1），20 d時(shí)觀察出芽及生長情況。

1.3.2 遺傳轉(zhuǎn)化體系確定以正交法設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，4因素（浸染時(shí)間、共培養(yǎng)時(shí)間、抗生素濃度及乙酰丁香酮濃度）3水平（低、中、高），采用正交表L9（34），工作表如表2。浸染時(shí)間低、中、高分別為3、5、10 min，共培養(yǎng)時(shí)間低、中、高分別為1、2和3 d，抗生素卡那霉素濃度低、中、高分別為20、30、40 mg·L1，乙酰丁香酮濃度低、中、高分別為100、200、300 μmol·L1。分為9組，每組4皿（約60個(gè)外植體）。30 d內(nèi)統(tǒng)計(jì)外植體出芽率。

1.3.3 丹參遺傳轉(zhuǎn)化按照最終選定的遺傳轉(zhuǎn)化條件：浸染5 min、共培養(yǎng)1 d、卡那霉素30 mg·L1篩選，按照1.2的操作方法浸染一批丹參葉片，待不定芽長出后切下不定芽接種于1/2MS培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)。1～2個(gè)月后待轉(zhuǎn)基因丹參苗生根較多、苗較壯時(shí)移栽在土里繼續(xù)培養(yǎng)待PCR鑒定。

1.4 轉(zhuǎn)基因植株的PCR鑒定

每棵丹參苗取1片葉片（帶葉柄）液氮研磨，按北京艾德萊公司CTAB植物基因組 DNA提取試劑盒DN14說明書步驟提取DNA，電泳檢查DNA提取質(zhì)量。提取的DNA 2 μL為模板，用NPTII正向引物（GTATCCATCATGGCTGATGCA AT）、反向引物（GAAGAACTCGTCAAGAAGGCGA）各1 μL， 2×premix rTaq 10 μL，水6 μL，總共20 μL體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、 72 ℃ 1 min 30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。取PCR產(chǎn)物10 μL上樣，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測是否有目的條帶。同時(shí)以野生型丹參作對照（CK）。

2結(jié)果與分析

2.1 各種激素配比情況下丹參愈傷誘導(dǎo)情況

從表1可以看出，丹參的愈傷較容易誘導(dǎo)，除了Y4 培養(yǎng)基誘導(dǎo)出的愈傷是深褐色，其余均為綠色或淺綠色，具有較好的再生能力，D1誘導(dǎo)的愈傷易生根。Y2培養(yǎng)基誘導(dǎo)愈傷最快，10 d左右可觀察到愈傷，Y1培養(yǎng)基誘導(dǎo)莖產(chǎn)生愈傷快于誘導(dǎo)葉。根據(jù)這些結(jié)果，對于不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康目梢赃x擇不同的誘導(dǎo)條件：Y1適合于以莖作為外植體，Y4可能適合于考查愈傷組織產(chǎn)丹參酮的研究（丹參酮呈紅色，會令愈傷的顏色較深）， D1適合用于對丹參根的研究，而探索丹參遺傳轉(zhuǎn)化體系，需要較多可再生的芽，因此在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇出芽較多的Y3培養(yǎng)基。

2.2 殺死濃度范圍

通過觀察丹參葉片在含不同濃度的卡那霉素培養(yǎng)基上的生長狀況考察丹參對卡那霉素敏感的敏感性。發(fā)現(xiàn)高濃度卡那霉素抑制外植體生長，70 mg·L1卡那霉素10 d內(nèi)使葉片褐化，不加卡那霉素的葉片一直可保持鮮活綠色。葉片生長狀況及出芽率（表2）隨卡那濃度降低而好轉(zhuǎn)。未經(jīng)農(nóng)桿菌浸染的丹參葉片可耐受50 mg·L1的卡那霉素。

2.3 丹參遺傳轉(zhuǎn)化體系確定

農(nóng)桿菌的浸染對丹參葉片的生長會有影響，因此將浸染后的卡那霉素篩選濃度梯度設(shè)為40、30、20 mg·L1。將浸染時(shí)間、共培養(yǎng)時(shí)間、卡那霉素濃度和乙酰丁香酮濃度按正交表L9（34）設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，考察丹參葉片出芽率，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表3。

由表3可知，影響丹參遺傳轉(zhuǎn)化出芽率的主要因素是浸染時(shí)間、共培養(yǎng)時(shí)間和選擇壓。乙酰丁香酮的濃度對雙子葉植物的轉(zhuǎn)化影響不明顯（因后續(xù)重復(fù)實(shí)驗(yàn)中去除乙酰丁香酮對出芽率無大的影響）。浸染時(shí)間短（3 min）外源基因整合到丹參基因組的幾率理論上會下降，但是1～3 d的共培養(yǎng)可以減輕這個(gè)問題。浸染時(shí)間長（10 min）對丹參葉片的損傷較大，有些葉片浸染后呈現(xiàn)褐色，后面的生長狀態(tài)受影響，出芽不多。浸染5 min左右較為適宜，第4組和第6組均能達(dá)到45%左右的出芽率，但是第6組共培養(yǎng)時(shí)間較長，農(nóng)桿菌的生長旺盛，染菌的幾率加大。因此綜合考慮，確定遺傳轉(zhuǎn)化條件為浸染5 min，共培養(yǎng)1 d，卡那霉素30 mg·L1。轉(zhuǎn)基因過程及植株生長狀況見圖1。

2.4 轉(zhuǎn)基因植物的鑒定

提取兩組轉(zhuǎn)基因苗的DNA，第1組：浸染5 min，共培養(yǎng)1 d，用30 mg·L1卡那霉素篩選，第2組：浸染5 min，共培養(yǎng)1 d，用10 mg·L1鏈霉素篩選，每組10株，DNA經(jīng)電泳檢測質(zhì)量（圖2：A，C），然后分別用NPTII基因的正反向引物做PCR擴(kuò)增做轉(zhuǎn)基因鑒定，電泳結(jié)果見圖2。第1組10棵植株中有6棵呈陽性（第3，第4，第5，第7，第8，第9號植株），野生型CK沒有條帶（圖2：B），轉(zhuǎn)基因陽性率達(dá)60%。第2組陽性率達(dá)到70%（圖2：D）。這說明本研究丹參遺傳轉(zhuǎn)化方法可行，用鏈霉素篩選陽性率高于用卡那霉素篩選。

3討論與結(jié)論

丹參作為重要的藥用植物在心腦血管及神經(jīng)退行性疾病等方面具有治療作用（趙陽等，2010； Zhang et al，2015），其中的有效成分丹參酮主要存在于根。 因此丹參的組織培養(yǎng)中對于丹參根及丹參酮的關(guān)注較多。本研究通過系統(tǒng)考察不同的激素配比得到不同的愈傷組織，發(fā)現(xiàn)在MS培養(yǎng)基中僅用反式玉米素ZR可誘導(dǎo)出褐色愈傷，此色素見光易分解，這與丹參酮的特點(diǎn)一致，因此可考慮將反式玉米素用于誘導(dǎo)丹參酮的研究。丹參的毛狀根可以用來研究丹參的次生代謝物（Zhang et al，2015； Shi et al，2016），但是這個(gè)過程需要發(fā)根農(nóng)桿菌、或攜帶相關(guān)基因的發(fā)根農(nóng)桿菌的刺激或基因整合，與植物正常條件下的生長狀態(tài)不同，不定根可以作為研究丹參根生長發(fā)育的工具，我們發(fā)現(xiàn)1.0 mg·L1的2，4D可以促進(jìn)丹參愈傷生根。因此對于不同的研究目的，我們可以采用不同的愈傷誘導(dǎo)條件。

丹參作為藥用模式植物（Tian， 2011），在分子層面的研究離不開快捷穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系。王喆之課題組在利用陜西本地的丹參葉片作外植體，在遺傳轉(zhuǎn)化方面做了大量工作（王倩，2005；王麗娟，2005；Yan & Wang，2007），Cui et al（2015）用山東白花丹參葉片作外植體也取得成功。 但是由于丹參品種繁多且種間差異大、外植體培養(yǎng)條件及狀態(tài)不同等原因，我們用已經(jīng)完成基因組測序的紫花丹參993品系無菌苗按照已報(bào)道的方法在本研究室只有最開始的一批轉(zhuǎn)化成功，成為制約進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的瓶頸。卡那霉素作為篩選抗性基因NPTII的常用抗生素，主要是通過與30S核糖體結(jié)合，影響mRNA密碼的讀取，從而導(dǎo)致蛋白翻譯受阻。雖然我們的實(shí)驗(yàn)表明了丹參葉片對卡那霉素敏感，但是用它做篩選劑重現(xiàn)性差，常常發(fā)現(xiàn)葉片停止生長。鏈霉素同屬于氨基糖苷類，具有相同的作用機(jī)制，但是在這類抗生素中毒性較小。在本實(shí)驗(yàn)中也證實(shí)用工作濃度（10 mg·L1）的鏈霉素篩選可以獲得較高的轉(zhuǎn)基因陽性率，同時(shí)實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)性較好。因此認(rèn)為，鏈霉素似可以作為卡那霉素篩選劑的替代品，當(dāng)然這還需要在其他物種中嘗試驗(yàn)證。莖也是丹參遺傳轉(zhuǎn)化的好材料，但是在實(shí)際操作中，浸染農(nóng)桿菌后農(nóng)桿菌進(jìn)入到其內(nèi)部，在后期農(nóng)桿菌較難除凈，因此我們選擇葉片作為遺傳轉(zhuǎn)化外植體。另外，我們摸索出的浸染時(shí)間和共培養(yǎng)時(shí)間大大縮短（浸染5 min，共培養(yǎng)1 d與報(bào)道的浸染20 min、共培養(yǎng)3 d相比）（Yan & Wang， 2007），這也簡化了實(shí)驗(yàn)操作，減少了后期因農(nóng)桿菌污染的風(fēng)險(xiǎn)。這些方法的優(yōu)化改進(jìn)為深入研究丹參植物提供了很好的技術(shù)保障。

致謝感謝中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所盧善發(fā)老師的指導(dǎo)及提供場地和經(jīng)費(fèi)支持。

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