巫玲麗　穆禎強(qiáng)　張利

摘要：【目的】優(yōu)化金花葵多糖的提取工藝，考察金花葵多糖的抗氧化活性，為金花葵多糖的研究和利用提供參考依據(jù)?！痉椒ā恳越鸹嗵翘崛÷蕿樵u(píng)價(jià)指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用L9（33）正交試驗(yàn)優(yōu)化超聲輔助提取工藝，通過對(duì)DPPH自由基和羥基自由基（·OH）清除能力的考察評(píng)價(jià)金花葵多糖的體外抗氧化活性?！窘Y(jié)果】影響超聲輔助提取金花葵多糖效果的因素排序?yàn)椋撼晻r(shí)間>料液比>超聲溫度，其最佳提取工藝條件為：料液比1∶50、超聲時(shí)間30 min、超聲溫度50 ℃，在此條件下金花葵多糖的提取率為22.32%。自由基清除試驗(yàn)結(jié)果表明，金花葵多糖對(duì)DPPH自由基和·OH的清除率呈現(xiàn)劑量依賴性。【結(jié)論】優(yōu)化得到的金花葵多糖提取工藝操作簡(jiǎn)單可行，提取的金花葵多糖具有較強(qiáng)抗氧化活性，該工藝可在金花葵多糖的提取研究和開發(fā)利用中應(yīng)用。

關(guān)鍵詞： 金花葵；多糖；超聲提取；抗氧化活性

中圖分類號(hào)： TQ461 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2017）01-0109-05

Abstract：【Objective】The extraction process of polysaccharides from Hibiseu smanihot L. was optimized，and its antioxidant activity was investigated，in order to provide basis for research and utilization of polysaccharides from H. smanihot L. 【Method】Taking extraction rate of H. smanihot L. polysaccharides as index， and on the basis of single factor experiment，the extraction technology assisted by ultrasonic was optimized by L9（33） orthogonal test. The antioxidant activities of H. smanihot L. polysaccharides were evaluated through scavenging experiment on DPPH free radical and the hydroxyl free radical（·OH）. 【Result】The three factors affecting ultrasonic-assisted extraction of H. Smanihot L. polysaccharides were in order as follows：ultrasonic time>material-liquid ratio>ultrasonic temperature. The optimum extraction process parameters of polysaccharides were as follows material-liquid ratio 1∶50，ultrasonic time of 30 min， ultrasonic temperature 50 ℃. Under such condition， the extraction rate reached 22.32%. Free radical scavenging experiment showed that scavenging effects of H. Smanihot L. polysaccharides towards DPPH free radical and ·OH varied according to the dosage. 【Conclusion】The optimized extraction process of H. Smanihot L. polysaccharides is simple，convenient and feasible. And H. Smanihot L. polysaccharides has strong antioxidant activity. This processing technique can be applied in extraction and development of H. Smanihot L. polysaccharides.

Key words： Hibiseu smanihot L.； polysaccharides； ultrasonic extraction； antioxidant activity

0 引言

【研究意義】金花葵（Hibiseu smanihot L.）又名菜芙蓉、野芙蓉，是一年生草本植物，既可藥用又可食用，根、稈、花、葉和果均可利用，還可作觀賞植物，被稱為“植物界大熊貓”，近年來已在多地推廣種植。植物多糖具有降血糖和血脂（羅祖友等，2007）、免疫調(diào)節(jié)（尚慶輝等，2015）、抑制惡性黑素瘤（馬文宇和吳鄧婷，2016）等生物學(xué)功能。黃秋葵多糖有抗氧化活性，但對(duì)與其同屬金花葵中多糖活性的研究未見報(bào)道。因此，優(yōu)化金花葵多糖的提取工藝并考察其抗氧化活性，對(duì)金花葵多糖的研究和利用具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】梅洪睿等（2009）鑒別結(jié)果表明，金花葵種子中含有生物堿。王剛和姚佳（2010）采用水蒸氣蒸餾法從金花葵子中提取揮發(fā)油，用氣相色譜—質(zhì)譜法對(duì)其化學(xué)成分進(jìn)行分離鑒定，結(jié)果表明，金花葵子揮發(fā)油的主要成分為亞油酸（10.74%）、軟脂酸（42.01%）和順-9-烯-十八烷酸（8.14%）。劉琦（2012）應(yīng)用高速逆流色譜法分離金花葵花中兩種黃酮類化合物，結(jié)果表明，從100.3 mg金花葵花總黃酮純化物中分離得到金絲桃苷10.07 mg，純度達(dá)94.194%；葛根素13.5 mg，純度達(dá)94.579%。趙煥煥（2012）采用水提醇沉法提取黃秋葵多糖，并用蒽酮—硫酸法測(cè)定RPS含量，應(yīng)用1，1-二苯基苦味?；诫?、水楊酸法和鄰苯三酚自氧化法檢測(cè)多糖活性，結(jié)果表明，黃秋葵中多糖含量較高且對(duì)3種自由基的清除率呈現(xiàn)劑量依賴性?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，關(guān)于金花葵多糖提取及其體外抗氧化活性的研究未見報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問題】優(yōu)化金花葵多糖提取工藝，并考察提取的金花葵多糖抗氧化活性，為金花葵多糖的研究、開發(fā)和利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

金花葵干花苞購自河南新鄉(xiāng)。試驗(yàn)使用的儀器及藥劑：數(shù)控超聲波裝置（KQ-300DE型，昆山市超聲儀器有限公司）；紫外—可見分光光度計(jì)（752，上海光學(xué)儀器有限公司）；水浴鍋（OSB-2100，上海愛朗儀器有限公司）；雙循環(huán)水式多用真空泵（CA-1115，上海愛朗儀器有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（N-1100，上海愛朗儀器有限公司）；DPPH（美國Sigma公司）；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品無水乙醇、鄰苯三酚、三（羥甲基）氨基甲烷、苯酚、硫酸、水楊酸、雙氧水和硫酸亞鐵均為分析純，購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1. 2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

參考羅澤萍等（2015）的方法，稱取干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品250.0 mg置于250 mL容量瓶中，加蒸餾水溶解并定容至刻度。分別吸取質(zhì)量濃度1.0 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0和6.0 mL于6個(gè)100 mL容量瓶中定容，備用。再分別吸取這6種濃度溶液2.0 mL于25 mL比色管中，以蒸餾水作參比，依次加入新配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的苯酚溶液1.0 mL，混勻，再緩慢加入5.0 mL濃硫酸，搖勻后靜置5 min，在沸水浴中加熱15 min后冷卻至室溫。在200～800 nm范圍內(nèi)掃描波長，得出在490 nm處的吸收最強(qiáng)，故在490 nm處測(cè)定吸光值，以葡萄糖質(zhì)量濃度C（mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光值A(chǔ)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1. 3 金花葵多糖提取工藝優(yōu)化

1. 3. 1 金花葵多糖提取 金花葵在70 ℃下干燥24 h，粉碎，過80目篩備用。取1.000 g金花葵花粉，以蒸餾水為溶劑，在一定料液比、超聲時(shí)間及超聲溫度條件下超聲提取金花葵多糖。提取液經(jīng)離心，取上清液減壓濃縮，加入無水乙醇至終濃度80%，醇沉過夜，離心，取下層沉淀，無水乙醇洗滌數(shù)次，冷凍干燥即得金花葵粗多糖。

1. 3. 2 單因素試驗(yàn) 稱取1.000 g金花葵粉，分別以料液比、超聲時(shí)間和超聲溫度為單一變量，對(duì)金花葵多糖提取率進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

1. 3. 3 正交試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，料液比、超聲時(shí)間和超聲溫度分別取3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，優(yōu)化金花葵多糖的超聲提取工藝。正交試驗(yàn)水平和因素見表1。

1. 4 金花葵多糖抗氧化活性測(cè)定

1. 4. 1 DPPH自由基清除 分別取不同量多糖，用超純水溶解，并按1.2方法測(cè)得其濃度分別為3.290、1.645、0.823、0.412和0.206 mg/mL，稱取陽性對(duì)照品維生素C（Vc）配制為相同濃度溶液。稱取DPPH 0.0040 g，用乙醇溶液溶解定容至100 mL棕色瓶中，得0.1 mmol/L DPPH溶液，避光保存?zhèn)溆?。參考趙煥煥等（2012）的方法，分別取1.0 mL不同濃度金花葵多糖溶液于比色管中，再加入2.0 mL DPPH溶液，搖勻后置于暗處30 min，于517 nm處測(cè)定吸光值A(chǔ)i；同時(shí)設(shè)空白組A0（1.0 mL蒸餾水代替樣品溶液）和樣底組Aj（2.0 mL乙醇溶液代替DPPH溶液），3次重復(fù)，求其平均值，計(jì)算清除率。清除率（%）=[A0-（Ai-Aj）]/A0 ×100。以同等條件測(cè)得Vc對(duì)DPPH自由基的清除率。

1. 4. 2 羥基自由基（·OH）清除 參考楊申明等（2015）的方法，分別取不同量多糖，用超純水溶解，并按1.2方法測(cè)得其濃度分別為4.110、3.425、2.740、2.060和1.370 mg/mL，稱取陽性對(duì)照品Vc配制為相同濃度溶液。在11支比色管中依次加入1.0 mL 6 mmol/L FeSO4溶液、1.0 mL 6 mmol/L水楊酸乙醇溶液和1.0 mL不同濃度的樣品溶液，最后再加入1.0 mL 5 mmol/L H2O2溶液搖勻，37 ℃水浴中靜置30 min，在510 nm處測(cè)吸光值A(chǔ)1。以1.0 mL水代替樣品測(cè)得吸光值A(chǔ)0，以1.0 mL水代替H2O2測(cè)得吸光值A(chǔ)2。用同樣方法測(cè)得對(duì)照品Vc的清除率。

清除率（%）=[A0-（A1-A2）]/A0×100

2 結(jié)果與分析

2. 1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

以不同質(zhì)量濃度葡萄糖對(duì)照品測(cè)得的吸光值建立回歸方程：y=14.203x-0.0079（R2=0.9993），葡萄糖在質(zhì)量濃度0.01～0.06 mg/mL范圍內(nèi)與吸光值有良好的線性關(guān)系（圖1）。

2. 2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2. 2. 1 不同料液比對(duì)金花葵多糖提取率的影響 取1.000 g金花葵粉末，以料液比1∶20、1∶30、1∶40、1∶50和1∶60，固定超聲溫度60 ℃，超聲30 min過濾取上清液，濃縮至一定體積，加無水乙醇使乙醇濃度達(dá)到80%，靜置過夜析出多糖，再用無水乙醇洗滌數(shù)次，冷凍干燥得粗多糖，用水溶解定容至250 mL，按照1.2方法測(cè)定多糖含量，并計(jì)算提取率。由圖2可看出，料液比對(duì)金花葵多糖提取的影響分兩個(gè)階段，以1∶40為界，1∶40前隨著料液比的降低提取率升高，1∶40后隨著料液比的降低提取率降低，但總體上低料液比的提取率比高料液比高，因此選擇1∶40、1∶50和1∶60作為正交優(yōu)化試驗(yàn)參數(shù)。

2. 2. 2 不同超聲時(shí)間對(duì)金花葵多糖提取率的影響 取1.000 g金花葵粉末，以1∶40料液比，固定超聲溫度60 ℃，分別超聲10、20、30、40和50 min后過濾取上清液，濃縮至一定體積，加無水乙醇使乙醇濃度達(dá)到80%，靜置過夜析出粗多糖，再用無水乙醇洗滌數(shù)次，冷凍干燥得粗多糖，用水溶解定容至250 mL，按照1.2方法測(cè)定多糖含量，并計(jì)算提取率。由圖3可看出，超聲10～20 min的多糖提取率呈升高趨勢(shì)，超聲時(shí)間達(dá)20 min后隨著超聲時(shí)間的延長多糖提取率降低，超聲30 min與超聲10 min時(shí)提取率相差不明顯，超聲30 min后提取率急劇減小，所以選擇超聲10、20和30 min作為正交優(yōu)化試驗(yàn)參數(shù)。

2. 2. 3 不同超聲溫度對(duì)金花葵多糖提取率的影響 取1.000 g金花葵粉末，以1∶40料液比，分別設(shè)超聲溫度30、40、50、60和70 ℃，超聲20 min后過濾取上清液，濃縮至一定體積，加無水乙醇使乙醇濃度達(dá)到80%，靜置過夜析出粗多糖，再用無水乙醇洗滌數(shù)次，冷凍干燥得粗多糖，用水溶解定容至250 mL，按照1.2方法測(cè)定多糖含量，并計(jì)算提取率。從圖4可看出，多糖提取率隨著超聲溫度的升高而增加，但當(dāng)超聲溫度達(dá)到一定值后多糖提取率隨著溫度的升高而降低，可能是因?yàn)槌暅囟冗^高對(duì)多糖的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定的破壞。因此選擇超聲溫度40、50和60 ℃作為正交優(yōu)化試驗(yàn)參數(shù)。

2. 3 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表2可知，不同因素對(duì)金花葵多糖提取率的影響程度不同，通過比較不同因素和水平的平均值和極差，確定各因素對(duì)多糖提取率影響大小順序?yàn)锽>A>C，即超聲時(shí)間影響最大，是多糖提取的關(guān)鍵因素；最優(yōu)試驗(yàn)條件組合為A2B3C2，優(yōu)化后的最佳提取工藝試驗(yàn)條件為：料液比1∶50，超聲時(shí)間30 min，超聲溫度50 ℃。在此優(yōu)化條件下進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)（n=3），測(cè)得金花葵多糖平均提取率為22.32%，RSD=1.35%。

2. 4 金花葵多糖抗氧化活性的測(cè)定結(jié)果

2. 4. 1 金花葵多糖對(duì)DPPH自由基的清除能力 由圖5可看出，金花葵多糖和Vc對(duì)DPPH自由基均具有較好的清除效果。在金花葵多糖0.103～3.290 mg/mL范圍內(nèi)，DPPH自由基清除率逐漸升高，在金花葵多糖最大濃度3.290 mg/mL時(shí)，DPPH的清除率達(dá)75.75%。

2. 4. 2 金花葵多糖對(duì)·OH的清除能力 由圖6可看出，在金花葵多糖0.685～4.110 mg/mL范圍內(nèi)，隨著多糖濃度的增加，其對(duì)·OH的清除率也逐步增加，當(dāng)濃度達(dá)到4.110 mg/mL時(shí)，清除率達(dá)最大值，為73.36%，說明金花葵多糖具有較強(qiáng)的清除·OH能力。

3 討論

水提醇沉、超聲輔助提取方法提取多糖，因具有操作簡(jiǎn)單、提取率高、能耗低和時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于蔗梢多糖提?。ê窝┟返?，2014）、脆江蘺多糖提?。ň犀幀幍?，2016）和香菇多糖提取（張敏瑜等，2016）。本研究結(jié)果表明，超聲時(shí)間是影響金花葵多糖提取效果的最主要因素，超聲時(shí)間過長會(huì)破壞其他大分子物質(zhì)活性（董汝晶，2014），其次是料液比，最后是超聲溫度。通過正交試驗(yàn)得到金花葵多糖的最佳提取工藝條件為：料液比1∶50、超聲時(shí)間30 min、超聲溫度50 ℃，在該工藝條件下重復(fù)試驗(yàn)金花葵多糖的平均提取率為22.32%，其RSD為1.35%，說明該方法重復(fù)性較好。超聲輔助提取不僅操作簡(jiǎn)單，還省時(shí)、環(huán)保，適合金花葵多糖的提取。

生命體在新陳代謝中會(huì)產(chǎn)生一定的自由基，這些自由基具有很高的活性，會(huì)攻擊人體細(xì)胞和器官等，嚴(yán)重時(shí)造成組織損傷引起機(jī)體衰老，同時(shí)會(huì)誘發(fā)腫瘤等惡性疾?。ㄇ窦芽。?015）。利用清除DPPH自由基和·OH法來評(píng)價(jià)抗氧化效果的方法運(yùn)用較普遍，其中高嘉嶼等（2016）采用DPPH法測(cè)定白花蛇多糖的抗氧化能力取得了良好的效果。本研究通過體外抗氧化試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)金花葵多糖對(duì)DPPH自由基和·OH有較強(qiáng)的清除能力，與同屬的黃秋葵多糖的抗氧化能力（趙煥煥等，2012）相比，金花葵多糖清除DPPH自由基和·OH的能力更強(qiáng)，可作為今后深入研究和開發(fā)利用金花葵多糖的參考依據(jù)。

4 結(jié)論

結(jié)合單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化得到的金花葵多糖提取工藝簡(jiǎn)單、高效可行，提取的金花葵多糖具有較強(qiáng)抗氧化活性，該工藝可在金花葵多糖的提取研究、開發(fā)和利用中應(yīng)用。

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（責(zé)任編輯 思利華）