余信強，張?zhí)K川，劉敏，蔣偉

{江漢大學附屬醫(yī)院(武漢市第六醫(yī)院) 心血管內(nèi)科，湖北 武漢 430016}

·論 著·

缺血性心肌病患者血漿miR- 21和miR- 214的表達及其意義

余信強，張?zhí)K川，劉敏，蔣偉

{江漢大學附屬醫(yī)院(武漢市第六醫(yī)院) 心血管內(nèi)科，湖北 武漢 430016}

目的：探討缺血性心肌病(ICM)患者血漿miR- 21和miR- 214的表達及其意義。方法：選取2015年1月至2016年1月我院收治的ICM患者和同期體檢健康的志愿者各33例，檢測血漿miR- 21和miR- 214表達水平、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL- C)、低密度脂蛋白(LDL- C)、舒張壓(DBP)、收縮壓(SBP)、N末端B型腦鈉肽原(NT- proBNP)、左心室舒張末期內(nèi)徑(LVEDd)、左心室舒張末期容積(LVEDV)、左心室收縮末期容積(LVESV)、左心室射血分數(shù)(LVEF)。分析ICM患者miR- 21及miR- 214水平與各指標的相關性，采用受試者工作特征曲線(ROC曲線)評價其對ICM的診斷價值。結果：ICM組與對照組TC、TG、DBP及SBP比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；ICM組HDL- C、LVEF低于對照組，而LDL- C、NT- proBNP、LVEDd、LVEDV及LVESV高于對照組(P<0.05)；ICM組miR- 21及miR- 214表達水平較對照組顯著上調(diào)(P<0.001)。ICM患者miR- 21及miR- 214水平與NT- proBNP、LVEDd、LVEDV、LVESV呈正相關(P<0.05)，與LVEF呈負相關(P<0.05)。二者聯(lián)合診斷的ROC曲線下面積(AUC，為0.865)、靈敏度(87.5%)和特異度(78.3%)均大于單獨診斷(P<0.05)。結論：ICM患者血漿miR- 21和miR- 214表達升高，且與NT- proBNP、LVEDd、LVEDV及LVESV呈正相關，與LVEF呈負相關，可能參與了ICM患者心室重構過程。聯(lián)合檢測對ICM有較好的診斷效能，或可作為臨床上鑒別診斷ICM的生物標志物。

缺血性心肌??； 微小RNA； 心室重構

缺血性心肌病(ischemic cardiomyopathy， ICM)是冠心病的一種特殊類型或晚期階段，是指由于冠狀動脈管腔狹窄或堵塞引起的長期心肌缺血。心室重構是導致ICM最終進展為心力衰竭的重要病理生理機制，這一過程伴隨著心肌細胞缺血引起的心肌代償性肥大、肥厚，繼而進展為失代償，心肌細胞萎縮甚至凋亡[1]。miRNAs是近幾年來被大量研究的一類非編碼單鏈小分子RNA，它通過調(diào)節(jié)基因表達、蛋白質(zhì)翻譯及其靶RNA的穩(wěn)定性而發(fā)揮生物學作用[2]。有研究報道顯示，miR- 21[3- 5]和miR- 214[6- 7]在多種心血管疾病的病理生理過程中發(fā)揮重要作用。本研究旨在探討ICM患者血漿miR- 21和miR- 214的表達，并揭示其在ICM患者心室重構中的意義，從而為臨床上ICM的鑒別診斷提供一定的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年1月至2016年1月在我院就診的經(jīng)確診為ICM的患者33例為ICM組，另選取我院同期體檢的33例健康志愿者為對照組。依據(jù)2010年美國心臟病學會診斷標準：(1)冠脈造影顯示至少有1條冠脈及分支病變性狹窄≥50%；(2)左心室擴大，左心室射血分數(shù)(LVEF)≤40%；(3)心臟功能分級Ⅲ級及以上。排除標準：(1)風濕性心肌病、原發(fā)性心肌病等其他類型心臟疾病引起的心臟擴大；(2)伴乳頭肌功能不全、室間隔穿孔等嚴重冠心病并發(fā)癥；(3)伴腫瘤、肝腎功能嚴重不全、急性傳染病、自身免疫性疾病等其他系統(tǒng)嚴重疾?。?4)伴腦出血、腦梗死等其他心腦血管疾病。兩組對象性別、年齡、病程、吸煙史、糖尿病史等一般臨床資料差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。所有研究對象均簽署知情同意書，并經(jīng)本院醫(yī)學倫理委員會批準。

1.2 主要儀器和試劑

EPIQ7心臟彩超機(美國PHILIPS)，Nano Drop 2000c分光光度計(美國Thermo Scientific)，C1000熒光定量PCR儀(美國BIO- RAD)，COBAS INTEGRA 800全自動生化分析儀(瑞士Roche)，miRNeasy Serum/Plasma Kit提取試劑盒(德國QIAGEN)，逆轉錄試劑盒(法國Fermentas)，miR- 21、miR- 214及U6引物(上海生工生物工程技術服務有限公司)。

1.3 常規(guī)指標檢測

采集對象清晨空腹肘靜脈血，2 h內(nèi)送檢，測定總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein，HDL- C)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein，LDL- C)、N末端B型腦鈉肽原(NT- proBNP)。心臟彩超檢查左心室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end diastolic diameter，LVEDd)、左心室舒張末期容積(left ventricular end diastolic volume，LVEDV)、左心室收縮末期容積(left ventricular end systolic volume，LVESV)、LVEF等指標。

1.4 實時熒光定量PCR檢測1.4.1 血漿RNA提取 采集對象抗凝全血，按提取試劑盒步驟提取，采用Nano Drop 2000c評估質(zhì)量，樣品A260/A280值為2.0，提示所提取RNA滿足實驗要求。

1.4.2 miRNA逆轉錄成cDNA 按逆轉錄試劑盒步驟操作，反應體系：5×miScript HiSpec Buffer 2 μl，10×miScript Nucleics Mix 1 μl，miScript Reverse Transcriptase 1 μl，RNase- free Water 3 μl，模板RNA 3 μl。反應條件：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。反應結束后冰浴冷卻，-20 ℃保存。

1.4.3 實時熒光定量PCR反應 以cDNA為模板建立10 μl反應體系：2×SYBR Green PCR Mix 5 μl，10×miScript Universal Primer(通用下游引物)1 μl，特異性上游引物1 μl，RNase- free Water 2 μl，模板RNA 1 μl。反應條件：95 ℃ 15 min，94 ℃ 15 s、55 ℃ 30 s、70 ℃ 30 s,共40個循環(huán)。由上海生工生物工程技術服務有限公司設計合成，miR- 21上游引物為5′- TAGCTTATCAGACTGATGTTGA- 3′，miR- 214上游引物為5′- ACAGCAGGCACAGACAGGCAGT- 3′，U6引物為5′- ATTCGTGAAG CGTTCCATATTT- 3′。

以U6作內(nèi)參，結果采用相對定量(2-ΔΔCt)方法進行分析。每個樣本3個重復孔，Ct值均值作為樣本實際Ct值，減去同一樣本U6的Ct值均值，得到相對表達量ΔCT值。ICM組ΔCt值減去對照組ΔCt值得到ΔΔCT值，最后求得2-ΔΔCt值。

地音監(jiān)測中有各種異常信息，其中最重要的2個指標表現(xiàn)為地音現(xiàn)象的突然加劇或突然沉寂，這兩個異常往往與能量的不穩(wěn)定性釋放密切相關，預示的危險性的顯著變化。地音異常系數(shù)這一指標可以衡量地音活動性的異常程度，包括頻次異常系數(shù)ka和能量系數(shù)ke，其計算公式為

1.5 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 兩組血脂、血壓和心室重構等指標比較

比較兩組血脂、血壓和心室重構等臨床指標，結果顯示，兩組TC、TG、DBP及SBP比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；ICM組HDL- C、LVEF低于對照組，而LDL- C、NT- proBNP、LVEDd、LVEDV及LVESV均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

相關指標ICM組(n=33)對照組(n=33)t值P值TC/mmol·L-14．32±1．214．54±1．250．7260．470TG/mmol·L-11．46±0．791．57±0．830．5510．583HDL?C/mmol·L-10．91±0．221．04±0．232．346<0．05LDL?C/mmol·L-13．05±0．932．59±0．812．143<0．05DBP/mmHg77．5±6．376．1±6．10．9170．363SBP/mmHg125．7±8．3123．3±8．41．1680．247NT?proBNP/pg·ml-1608．1±61．4197．3±23．535．90<0．05LVEDd/mm57．3±6．544．9±6．17．99<0．05LVEDV/ml123．3±33．184．1±16．46．10<0．05LVESV/ml55．7±8．733．8±6．311．71<0．05LVEF/%45．4±7．261．7±8．58．41<0．05

2.2 實時熒光定量PCR結果分析

目標miRNAs均需制作標準曲線，擴增效率在90%～110%之間，以保證目標miRNAs進行實時熒光定量PCR時表達結果的穩(wěn)定可靠，見圖1。miR- 21和miR- 214均成功擴增出產(chǎn)物，溶解峰均為單峰，Tm介于74.5～76.5 ℃之間，產(chǎn)物具有良好的特異性，見圖2。

A圖中濃度從左到右依次為1×109、1×107、1×105、1×103、1×101copies·μl-1

圖1 miR- 21標準曲線圖(E=107.5%，r2=0.999,Slope=-3 453)

A.miR- 21溶解曲線；B.miR- 214溶解曲線

圖2 miR- 21和miR- 214的溶解曲線

2.3 兩組血漿miRNAs表達水平比較

ICM組血漿miR- 21表達水平較對照組顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(t=6.715，P<0.001)。ICM組血漿miR- 214表達水平較對照組顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(t=6.514，P<0.001)。見表2和圖3。

表達量計算miR?21miR?214ICM組ΔCt2．153±1．0382．374±1．025對照組ΔCt0．832±0．4311．093±0．475-ΔΔCt1．029±0．3831．206±0．4122-ΔΔCt2．01±0．952．31±1．32t值6．7516．514P值<0．001<0．001

注：表中t值和P值為ICM組ΔCt和對照組ΔCt比較

圖3 兩組血漿miR- 21和miR- 214相對表達水平比較

2.4 miRNAs表達水平與臨床指標的相關性分析

將存在顯著性差異的臨床指標進行Pearson相關性分析，結果表明ICM患者血漿miR- 21及miR- 214表達水平與NT- proBNP、LVEDd、LVEDV、LVESV呈明顯正相關性(P<0.05)，與LVEF呈明顯負相關性(P<0.05)，而與HDL- C及LDL- C無直線相關性(P>0.05)。見表3。

表3 miR- 21和miR- 214的表達水平與臨床指標相關性分析

相關指標miR?21miR?214r值P值r值P值HDL?C-0．0890．414-0．1130．337LDL?C0．1350．3120．1470．283NT?proBNP0．221<0．050．233<0．05LVEDd0．225<0．050．241<0．05LVEDV0．167<0．050．174<0．05LVESV0．213<0．050．285<0．05LVEF-0．241<0．05-0．253<0．05

2.5 miRNAs對ICM的診斷價值

采用ROC曲線評估m(xù)iR- 21、miR- 214以及二者聯(lián)合對ICM的診斷價值。二者聯(lián)合診斷的ROC曲線下面積(AUC為0.865)、靈敏度(87.5%)和特異度(78.3%)均大于miR- 21和miR- 214單獨診斷，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表4和圖4。

表4 miRNAs對ICM的診斷價值

指 標AUC95%CI靈敏度/%特異度/%miR?210．7930．706～0．80177．464．3miR?2140．7210．653～0．73879．565．8miR?(21+214)0．8650．779～0．87387．578．3

圖4 miR- 21和miR- 214診斷ICM的ROC曲線

3 討 論

自首個miRNA于1993年被發(fā)現(xiàn)以來，之后在動物和人類中相繼發(fā)現(xiàn)了大量的miRNAs。miRNAs的發(fā)現(xiàn)被視為表觀遺傳學調(diào)控領域的重大突破。有證據(jù)表明，疾病引起的miRNAs改變可穩(wěn)定、特異地反映在血清或血漿中，這一特性使得miRNAs可作為疾病診斷和預后判斷的生物標志物[8- 9]。研究顯示，miRNAs在心血管系統(tǒng)中高表達，幾乎參與了所有的病理生理過程，與心肌缺血再灌注損傷、心肌肥厚、心肌細胞凋亡及心肌纖維化等心室重構過程緊密相關[10- 11]。

心肌缺血后，心肌代償性肥厚、心肌細胞凋亡、心肌纖維化等心室重構過程是ICM最終進展為心力衰竭的主要病理基礎。早期病理性心肌肥厚是一種機體代償性反應，能夠維持心輸出量和平衡室壁壓力，是心肌面對壓力負荷和損傷的適應性擴張，是諸如冠心病、心律失常、高血壓等諸多心血管疾病的共同病理生理過程[12]。心肌缺血再灌注可因氧化應激、鈣超載等引起心肌細胞壞死或凋亡，壞死的心肌纖維化、心肌間質(zhì)纖維化致使心室進行性擴張、變形，收縮和舒張功能降低，最后進展為心力衰竭，所以ICM患者防止心室重構尤其重要[13]。

心肌缺血后相關基因及其相應受調(diào)節(jié)蛋白表達改變，是引起患者心室重構的病理基礎。故而，從基因或分子水平切斷心室病理性重構過程有可能為臨床預防和治療ICM后心室重構提供新的思路。近年來，與心室重構相關的諸多信號傳導通路被一一發(fā)現(xiàn)，然而尚無法完全解釋心室重構的調(diào)控機制。心室重構的發(fā)病機制包括了基因表達的再程序化過程，該過程類似于胎兒/新生兒心臟基因表達的再程序化過程。研究發(fā)現(xiàn)這個過程伴有多個心臟特異性miRNAs的表達改變，提示miRNAs在心室重構過程中扮演了重要角色。已有的研究顯示，多種miRNAs，諸如miR- 126、miR- 508- 5p、miR- 141等等與ICM的病理生理過程有關[14- 15]。

人miR- 21基因在心血管系統(tǒng)高度表達，與心室重構過程中心肌細胞凋亡和心肌纖維化的發(fā)生相關。Qin等[3- 4]的研究發(fā)現(xiàn)，miR- 21可減少心肌缺血再灌注引起的心肌細胞凋亡，減少心室重構進程。Thum等[5]的研究發(fā)現(xiàn)，miR- 21在心力衰竭患者中的表達顯著上調(diào)，抑制miR- 21的表達可促進心肌成纖維細胞凋亡而減輕心肌纖維化。miR- 214對心肌缺血再灌注損傷具有保護作用，Aurora等[6]通過對小鼠缺血再灌注的研究發(fā)現(xiàn)，敲除miR- 214基因的小鼠心肌細胞凋亡增加及心肌纖維化嚴重，并且鈣離子/鈉離子交換通道1(Ncx1)表達增加，引起心肌細胞鈣超載，推測miR- 214對心肌缺血再灌注損傷的保護機制可能是通過抑制Ncx1及其下游鈣離子信號通路調(diào)節(jié)心肌細胞鈣離子平衡，減輕心肌缺血再灌注損傷時的鈣超載。Rooij等[7]的研究發(fā)現(xiàn)，擴張性心肌病心力衰竭患者血漿miR- 214表達是正常心臟的1.6倍。本研究結果發(fā)現(xiàn)，ICM患者HDL- C、LVEF低于對照組，而LDL- C、NT- proBNP、LVEDd、LVEDV和LVESV高于對照組，提示ICM患者可能存在血脂異常和心室重構的情況。PCR檢測發(fā)現(xiàn)ICM患者血漿miR- 21及miR- 214表達水平較對照組顯著上調(diào)。Pearson相關性分析顯示，ICM患者血漿miR- 21及miR- 214表達水平與NT- proBNP、LVEDd、LVEDV、LVESV呈正相關，而與LVEF呈負相關，提示二者很可能參與了ICM患者的心室重構過程。對ICM患者血漿miRNAs表達譜變化的研究頗多，但有關miRNAs作為ICM診斷及風險評估指標的研究卻鮮有報道。為此，本研究最后通過采用ROC曲線評估了miR- 21和miR- 214在診斷ICM中的應用價值，結果發(fā)現(xiàn)，二者聯(lián)合檢測對ICM有較好的診斷效能，或可作為臨床上鑒別診斷ICM的生物標志物。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)ICM患者血漿miR- 21和miR- 214水平升高，且與NT- proBNP、LVEDd、LVEDV及LVESV呈正相關，與LVEF呈負相關，可能參與了ICM患者心室重構過程，而二者聯(lián)合檢測對ICM有較好的診斷效能，或可作為臨床上鑒別診斷ICM的生物標志物。但本研究也存在一定的局限性，如研究病例來源單一、病例數(shù)較少等，尚需多中心、大樣本、長期的實驗驗證。

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(本文編輯：周蘭波)

Expression of plasma miR- 21 and miR- 214 in patients with ischemic cardiomyopathy and its significance

YU Xin- qiang，ZHANG Su- chuan，LIU Min，JIANG Wei

[DepartmentofCardiovascularInternalMedicine,theAffiliatedHospitalofJianghanUniversity(theSixthHospitalofWuhan)，Wuhan430016,China]

Objective:To investigate the expression of plasma miR- 21 and miR- 214 in patients with ischemic cardiomyopathy (ICM) and its significance. Methods: 33 ICM patients (ICM group) and 33 healthy volunteers (control group) in our hospital from January 2015 to January 2016 were selected. Clinical data of plasma miR- 21 and miR- 214 levels, total cholesterol (TC), triglyceride (TG), high density lipoprotein (HDL- C), low density lipoprotein (LDL- C), diastolic blood pressure (DBP), systolic blood pressure (SBP), N- terminal- pro- B- type natriuretic peptide (NT- proBNP), left ventricular end diastolic diameter (LVEDd), left ventricular diastolic end diastolic volume (LVEDV), left ventricular end systolic volume (LVESV), left ventricular ejection ejection fraction (LVEF) were collected. The correlation between miR- 21, miR- 214 levels and above indicators were analyzed. The diagnostic value of miR- 21 and miR- 214 on ICM patients were evaluated by receiver operating curve (ROC). Results: There was no significant difference in TC, TG, DBP and SBP between ICM group and control group (P>0.05). The levels of HDL- C, LVEF were lower, while the LDL- C, NT- proBNP, LVEDd, LVEDV and LVESV were higher in ICM group than those in control group (P<0.05). The expression levels of miRNA- 21 and miRNA- 214 in ICM group were significantly higher than those in control group (P<0.001). miR- 21 and miR- 214 levels in ICM patients were positively correlated with NT- proBNP, LVEDd, LVEDV and LVESV (P<0.05), and were negatively correlated with LVEF (P<0.05). The AUC (0.865), sensitivity (87.5%) and specificity (78.3%) of combined diagnosis were higher than separate diagnosis (P<0.05). Conclusion: The levels of plasma miR- 21 and miR- 214 significantly increase in ICM patients. Plasma miR- 21 and miR- 214 are positively correlated with NT proBNP, LVEDd, LVEDV and LVESV, and negatively correlated with LVEF, which may be involved in the process of ventricular remodeling in ICM patients. Combined diagnosis has better diagnostic performance, they may be used as biomarkers for ICM diagnosis.

ischemic cardiomyopathy; miRNAs; ventricular remodeling

2016- 07- 24

2016- 12- 19

武漢市衛(wèi)生局醫(yī)學科研計劃項目{武衛(wèi)(2010)42號}

余信強(1977-),男,湖北武漢人,副主任醫(yī)師。E- mail:jkki384@126.com

蔣偉(1981-) E- mail:hhsskux123@126.com

余信強,張?zhí)K川,劉敏,等.缺血性心肌病患者血漿miR- 21和miR- 214的表達及其意義[J].東南大學學報:醫(yī)學版,2017,36(2):136- 141.

R542.2

A

1671- 6264(2017)02- 0136- 06

10.3969/j.issn.1671- 6264.2017.02.002