費正華

（溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院，浙江 溫州325000）

·實驗研究·

長鏈非編碼RNA SNHG7在胃癌中的表達及功能

費正華

（溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院，浙江 溫州325000）

目的 了解長鏈非編碼RNA SNHG7在胃癌組織中的表達情況，以及對胃癌細胞增殖和凋亡的影響。方法 采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）法檢測SNHG7在82例胃癌、癌旁組織及胃癌細胞系中的表達情況，分析胃癌組織中SNHG7表達量與臨床病理參數(shù)的相關性；用siRNA干擾人胃癌BGC823細胞SNHG7表達后，分別用CCK-8法、流式細胞術檢測細胞增殖和凋亡。 結(jié)果 SNHG7在胃癌組織較癌旁組織中表達明顯升高（P＜0.01）；胃癌組織中SNHG7的表達水平與腫瘤的浸潤深度（P＜0.01），臨床分期（P＜0.01）、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P＜0.05）有關。SNHG7表達被抑制后，BGC823細胞增殖能力下降，細胞凋亡率增加（P＜0.01）。 結(jié)論 SNHG7在胃癌組織中顯著高表達，有望成為預測胃癌預后的標記物。

胃癌；長鏈非編碼RNA；SNHG7；增殖，凋亡

胃癌是一種嚴重危害人類生命安全的常見惡性腫瘤，晚期胃癌患者5年生存率不足10%，胃癌復發(fā)和轉(zhuǎn)移是其致死的主要原因，故發(fā)現(xiàn)調(diào)控胃癌細胞侵襲和遷移的相關基因，并尋找新的胃癌特異性生物標志物和藥物靶點迫在眉睫[1]。隨著對長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）了解的深入[2，3]，越來越多的lncRNA被證實在胃癌中存在異常表達，具有甲基化、組蛋白修飾、染色體重塑、剪接、轉(zhuǎn)錄及翻譯調(diào)控等多種生物學功能，與胃癌發(fā)生、發(fā)展密切相關。本課題組在對基因表達綜合（Gene Expression Omnibus，GEO）數(shù)據(jù)庫中的芯片數(shù)據(jù)GSE51575進行了基因重注釋分析，發(fā)現(xiàn)差異表達在2倍以上的lncRNA有20個，其中異常表達的長非編碼RNA SNHG7位于人類染色體9q34.3，轉(zhuǎn)錄出長為869bp的轉(zhuǎn)錄本?；谝陨闲酒Y(jié)果，作者對SNHG7作為胃癌潛在分子標志物及其功能進行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 組織標本 胃癌細胞系SGC7901、BGC823、MGC803、MKN45及正常胃黏膜上皮細胞GES-1由上海生物細胞庫提供，并收集本院2013年1月～2014年12月手術切除并經(jīng)病理確診的胃癌標本82例，所有患者術前均未接受抗腫瘤治療，年齡34～78歲，男49例，女33例。79例行D2淋巴結(jié)清掃的根治性胃切除手術，3例行姑息性手術。取距癌組織邊緣5cm以上的癌旁組織作為對照組。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑 胎牛血清、DMEM購自Gibco公司；Trizol、LipofectAmine2000試劑購自美國Invitrogen公司；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒購自TaKa Ra公司，CCK-8試劑盒、凋亡試劑盒購自南通碧云天生物科技有限公司；PCR引物由上海生工生物工程公司按以下序列合成：SNHG7引物序列:上游引物5'-CTAGGGGACTGGGCTGCT-3'，下游引物5'-AGGGTCTTAGGTTCCAGGCA-3'；βactin引物序列：上游引物5'-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3'，下游引物5'-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3'。

1.2.2 qRT-PCR 按 Trizol說明書要求提取組織總RNA，按qRT-PCR說明書要求配制50μL反應體系，并采用以下條件進行反轉(zhuǎn)錄反應: 50℃反轉(zhuǎn)錄反應30分鐘，92℃反應3分鐘變性反轉(zhuǎn)錄酶。所得到的cDNA按如下條件進行PCR擴增反應：92℃變性10秒，55℃退火20秒，68℃延伸20秒，擴增40個循環(huán)。以β-actin基因作為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計算SNHG7 mRNA相對表達量。

1.2.3 細胞轉(zhuǎn)染 取2×105對數(shù)期生長細胞接種于6孔板中，混勻。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育24小時，將si SNHG7和LipofectAmine2000分別加入Opti-MEM中，輕輕振搖5分鐘后混勻，制成轉(zhuǎn)染液，室溫靜置20分鐘后，將轉(zhuǎn)染液加入細胞中，輕輕混勻，孵育6小時后棄去轉(zhuǎn)染液，加10%FBSDMEM繼續(xù)培養(yǎng)。SNHG7干擾RNA（si SNHG7）及陰性對照 （si SNHG7-N）序列由上海生工公司合成，SNHG7特異性 siRNA （上游引物 5'-CCGATTCTTAAGTTCTGCTATTGTG-3'，下游引物5'-GCTATTGTGGTATTCTGGTGGAGAA-3'。

1.2.4 CCK-8法檢測細胞增殖 將轉(zhuǎn)染SNHG7干擾序列和NC序列的BGC823細胞按5×103/孔接種于96孔板，每組設置6個復孔，于接種后24、48、72和96小時按照CCK8試劑盒說明檢測細胞增殖。于450nm波長處測定每組細胞的吸光度值。取6孔平均值為結(jié)果（A值），以時間為橫軸，A值為縱軸繪制細胞增殖曲線。

1.2.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡率 將2×105個細胞種于6孔板中，24小時后用不含EDTA的胰蛋白酶消化收集后，1000r/min離心5分鐘，棄上清，用預冷的PBS洗滌2次后重懸于75%乙醇，并于-20℃固定過夜，洗滌離心后加入含有10mg/L溴化丙啶（PI）和0.1%R Nase A的PBS液500μL，室溫避光染色10分鐘后，用流式細胞儀測定細胞凋亡時消化收集細胞，分別加入5μL AnnexinV-FITC和10μL碘化丙啶（PI），混勻。在室溫下，避光反應5～15分鐘檢測細胞凋亡率，以百分數(shù)表示細胞凋亡率。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料以（±s）表示，組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料采用χ2檢驗。

2 結(jié)果

2.1 GEO數(shù)據(jù)分析 芯片GSE51575分析顯示一共有125條lncRNA在胃癌組織中存在差異表達，其中有20條表達升高或下降1倍以上，詳見表1。

表1 芯片GSE51575中相對癌旁組織升高或下降1倍以上的lncRNAs

2.2 SNHG7在胃癌組織和胃癌細胞系中的表達SNHG7在胃癌組織中表達是其癌旁正常組織的2.2倍，基于以上結(jié)果，本文采用RT-PCR法檢測82例胃癌患者癌組織和配對癌旁組織的SNHG7的表達差異。結(jié)果顯示，SNHG7在胃癌組織中呈高表達，相對癌旁組織表達量的中位數(shù)為3.5倍，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見圖1。體外實驗中，胃癌細胞系SGC7901，BGC823，MGC803和MKN45的SNHG7表達均明顯高于胃上皮細胞系GES-1（P＜0.01），見圖2。其中BGC823細胞SNHG7表達較GES-1細胞升高4.5倍，故本文選擇BGC823細胞進行進一步體外實驗。

圖1 SNHG7在胃癌和癌旁組織中表達

圖2 SNHG7在胃上皮細胞和胃癌細胞系中表達

2.3 SNHG7表達水平與胃癌臨床病理特征的關系根據(jù)SNHG7在胃癌組織中位表達量 （3.5倍），將82例胃癌組織分為SNHG7高表達組（41例）和低表達組（41例）。研究發(fā)現(xiàn)，SNHG7的表達與腫瘤的浸潤深度、臨床分期和區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關，而與患者的性別、年齡、腫瘤部位、遠處轉(zhuǎn)移及腫瘤大小無明顯關系。浸潤深度T3～T4患者的SNHG7表達水平明顯高于T1～T2患者（P＜0.01）；存在區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移越多的患者SNHG7表達水平明顯高于無轉(zhuǎn)移患者 （P＜0.05）；TNMⅢ～Ⅳ期患者的SNHG7表達水平明顯高于TNMⅠ～Ⅱ期（P＜0.01），詳見表2。

2.4 干擾SNHG7表達對胃癌細胞BGC823增殖和凋亡的影響 胃癌細胞BGC823在siRNA轉(zhuǎn)染后，SNHG7下調(diào)明顯 （P＜0.01）；與對照組相比，siRNA-SNHG7組細胞72、96小時增殖明顯受到抑制 （P＜0.05）；siRNA-SNHG7組細胞凋亡比例為（15.27±2.54）%，明顯高于對照組細胞的 （4.14± 0.87）%（P＜0.01），詳見圖5。

3 討論

LncRNA為一類長度超過200bp的轉(zhuǎn)錄本，由于其自身缺乏明顯的開放閱讀框架，不參與蛋白質(zhì)的編碼功能，起初lncRNA被認為是RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄的副產(chǎn)物，是基因組轉(zhuǎn)錄的“噪音”，不具有生物功能。但后續(xù)研究顯示，lncRNA可通過染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄激活與干擾等參與包括腫瘤在內(nèi)的多種細胞內(nèi)信號調(diào)控過程[4-5]。lncRNA FENDRR在胃癌組織中表達降低，低表達的患者腫瘤浸潤更深，更容易發(fā)生局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，并與FN1、MMP2/MMP9表達改變相關[6]。CCAT1在胃癌中表達上調(diào)，該lncRNA可能通過結(jié)合到C-Myc啟動子區(qū)域，促進癌細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移能力[7]。以上研究表明LncRNA可能在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要調(diào)節(jié)作用。

表2 胃癌組織中SNHG7表達與臨床病理參數(shù)的關系

圖3 RT-PCR檢測SNHG7在BGC823細胞中的表達量

圖4 CCK-8法檢測SNHG7抑制后BGC823細胞的增殖

圖5 流式細胞儀檢測BGC823細胞凋亡（5A：空白載體組；5B:siRNA組）

本研究對芯片GSE51575數(shù)據(jù)進行了基因重注釋分析，發(fā)現(xiàn)SNHG7在26例胃癌組織中高表達。本文用RT-PCR法檢測了SNHG7在82例胃癌和癌旁組織中表達情況，發(fā)現(xiàn)SNHG7在胃癌組織中存在高表達，是癌旁組織表達量的3.5倍。SNHG7表達越高，腫瘤的浸潤深度越深，并具有更高的臨床分期和更多的區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，而胃癌浸潤至漿膜外、較多的區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移本身就是腫瘤惡性程度高的標志，提示胃癌組織中l(wèi)ncRNASNHG7較高表達患者術后隨訪和監(jiān)測應更嚴密，以防復發(fā)。She等[8]研究發(fā)現(xiàn)，SNHG7在肺癌組織中存在高表達，抑制SNHG7表達后，可通過增加FAIM2蛋白表達，促進肺癌A549細胞凋亡。本研究體外實驗表明，在不同胃癌細胞系中SNHG7表達均較正常胃黏膜上皮細胞GES-1高，與胃癌組織中表達一致。通過siRNA抑制胃癌細胞SNHG7表達后，72、96小時的細胞增殖能力明顯下降，而流式細胞儀檢測也進一步證明，BGC823細胞SNHG7表達抑制后，凋亡率明顯增加，達（15.27±2.54）%，顯著高于對照組的 （4.14±0.87）%。通過對GSE51575芯片中數(shù)據(jù)進行基因富集分析，發(fā)現(xiàn)細胞周期及細胞增殖相關的基因富集在SNHG7高表達的患者上，說明SNHG7可能通過抑制凋亡基因或促進增殖相關基因而調(diào)控胃癌細胞生長，為下一步研究SNHG7通過何種途徑調(diào)控胃癌細胞增殖提供理論依據(jù)。

綜上所述，本研究表明SNHG7在胃癌組織中表達上調(diào)，且與腫瘤的浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關，下調(diào)SNHG7能夠增加胃癌細胞增殖和凋亡。綜上所述，SNHG7在胃癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮癌基因的作用，有可能用于胃癌患者預后監(jiān)測和發(fā)現(xiàn)新的治療靶點。

[1] Bollschweiler E，Berlth F，Baltin C，et al.Treatment of early gastric cancer in the Western World.World JGastroenterol，2014，20（19）:5672

[2] Qi P，Du X.The long non-coding RNAs，a new cancer diagnostic and therapeutic goldmine.Mod Pathol，2013，26（2）:155

[3]Hu Y，Wang J，Qian J，et al.Long noncoding RNA GAPLINC regulates CD44-dependent cell invasiveness and associates with poor prognosis of gastric cancer.Cancer Res，2014，74（23）:6890

[4] Gupta RA，Shah N，Wang KC，et al.Long non-coding RNA HOTAIR reprograms chromatin state to promote cancer metastasis.Nature，2010，464（7291）:1071

[5] Fei ZH，Yu XJ，Zhou M，et al.Upregulated expression of long non-coding RNA LINC00982 regulates cell proliferation and its clinical relevance in patients with gastric cancer.Tumour Biol，2016，37（2）:1983

[6] Xu TP，Huang MD，Xia R，et al.Decreased expression of the long non-coding RNA FENDRR is associated with poor prognosis in gastric cancer and FENDRR regulates gastric cancer cellmetastasis by affecting fibronectin1 expression.J Hematol Oncol，2014，7:63

[7] Guo X，Hua Y.CCAT1:an oncogenic long noncoding RNA in human cancers.JCancer Res Clin Oncol，2017：143（4）：555

[8]She K，Huang J，Zhou H，et al.lncRNA-SNHG7 promotes the proliferation，migration and invasion and inhibits apoptosis of lung cancer cells by enhancing the FAIM2 expression.Oncol Rep，2016，36（5）:2673

溫州市科技局計劃項目（Y20160121）