姜 暉，李開智，王紹志，付連浩，張熙潔，劉曉紅△

（1.河北省唐山市工人醫(yī)院，河北 唐山 063000； 2.河北省唐山市第二醫(yī)院，河北 唐山 063000）

·檢驗(yàn)檢測(cè)·

高效液相色譜法測(cè)定養(yǎng)陰降糖片4種成分的含量

姜 暉1，李開智2，王紹志1，付連浩1，張熙潔1，劉曉紅1△

（1.河北省唐山市工人醫(yī)院，河北 唐山 063000； 2.河北省唐山市第二醫(yī)院，河北 唐山 063000）

目的 建立同時(shí)測(cè)定養(yǎng)陰降糖片中葛根素、虎杖苷、阿魏酸和大黃素含量的高效液相色譜（HPLC）法。方法 色譜柱采用Agilent Zorbax Eclipse XDB－C18柱(150mm×4.6mm，5μm)，流動(dòng)相為乙腈(A)－甲醇(B)－0.5%H3PO4溶液(C)，梯度洗脫（0min時(shí)A 10%，B 5%，C 85%；10 min時(shí)A 20%，B 5%，C 75%；20 min時(shí)A 25%，B 5%，C 70%；30 min時(shí)A 30%，B 7%，C 53%；40 min時(shí)A 50%，B 30%，C 20%；55min時(shí)A 50%，B 30%，C 20%），流速為0.6mL／min，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為10μL，檢測(cè)波長(zhǎng)為250，306，254，320 nm。結(jié)果 葛根素、虎杖苷、阿魏酸和大黃素質(zhì)量濃度分別在42.43～678.91，150.00～2 400.00，0.39～6.26，62.50～1 000.00μg／mL范圍內(nèi)與峰面積積分值線性關(guān)系良好，平均回收率為98.59%，99.12%，98.70%，98.89%，RSD分別為0.30%，0.52%，1.79%，0.61%（n＝6）。結(jié)論 該方法分離效果好，操作簡(jiǎn)便，能較好地控制產(chǎn)品質(zhì)量。

中藥制劑；高效液相色譜法；含量測(cè)定；葛根素；虎杖苷；阿魏酸；大黃素

養(yǎng)陰降糖片收載于2015年版《中國(guó)藥典（一部）》[1]，由黃芪[2]、黨參、葛根、枸杞子、玄參、玉竹、地黃、知母、牡丹皮、川芎、虎杖[3]、五味子等12味中藥組方，具有養(yǎng)陰益氣、清熱活血的功效，用于治療糖尿病。虎杖中的虎杖苷[4]具有鎮(zhèn)咳、去痰、平喘、抗菌、清除自由基、調(diào)血脂、降低膽固醇及抗菌作用。大黃素[5]具有抗腫瘤活性，抗微生物生長(zhǎng)作用，免疫抑制作用，解痙、止咳作用，對(duì)心血管系統(tǒng)的作用，利尿作用及瀉下作用等。葛根中的葛根素[6]具有提高免疫。增強(qiáng)心肌收縮力、保護(hù)心肌細(xì)胞、降低血壓、抗血小板聚集等作用。川芎中含有的阿魏酸（阿魏酸鈉）具有抗血小板聚集、增強(qiáng)前列腺素活性、鎮(zhèn)痛、緩解血管痙攣等作用。本研究中選取虎杖[7]、葛根及川芎中的活性成分虎杖苷[8－9]、大黃素、葛根素[10]和阿魏酸，建立同步測(cè)定4種指標(biāo)成分含量的分析方法，分離效果好，操作簡(jiǎn)便，能達(dá)到較好地控制產(chǎn)品質(zhì)量的目的?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent1200系列HPLC儀（包括G1311A四元泵，G1322A脫氣機(jī)，G1316A柱溫箱，G1329A自動(dòng)進(jìn)樣器，G1315D－DAD檢測(cè)器，HPRev.B.0302化學(xué)工作站，美國(guó)Agilent公司）；摩爾純水機(jī)；真空抽濾泵（大連依利特公司）；Sartorius CP225D分析天平（德國(guó) Sartorius公司）；80－2型離心沉淀機(jī) (上海手術(shù)器械廠）；FS－150型超聲提取器（上海生析超聲儀器有限公司）；索氏提取裝置。

1.2 試藥

虎杖苷對(duì)照品（批號(hào)為111575－200502），大黃素對(duì)照品（批號(hào)為110756－200110），葛根素對(duì)照品（批號(hào)為 110752－200511），阿魏酸對(duì)照品（批號(hào)為 0773－9910），均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；養(yǎng)陰降糖片（陜西方舟制藥有限公司，批號(hào)為 130301，130801，140201）；乙腈（色譜純，美國(guó)Fisher公司）；甲醇（色譜純，天津市協(xié)和昊鵬色譜科技有機(jī)限公司）；磷酸溶液（分析純，天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠）；冰乙酸（分析純，天津市永大化學(xué)試劑有限公司）；甲酸（分析純，天津市博迪化工有限公司）；無(wú)水乙醇（分析純，天津市天大化工實(shí)驗(yàn)廠）；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：AgilentZorbaxEclipseXDB－C18柱(150mm× 4.6 mm，5μm)；流動(dòng)相：乙腈(A)－甲醇(B)－0.5% H3PO4溶液（C）[11]，梯度洗脫[12]（見表1）；流速：0.6m L／min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：虎杖苷306 nm[13]，葛根素250 nm[14]，大黃素254 nm[15]，阿魏酸320 nm[16]。

分別精密吸取2.2項(xiàng)下對(duì)照品貯備液Ⅱ溶液及供試品溶液與陰性對(duì)照品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，見圖1。可見，在該色譜條件下，養(yǎng)陰降糖片中的4種待測(cè)成分可達(dá)到基線分離，分離度在相應(yīng)檢測(cè)波長(zhǎng)下均大于1.5，理論板數(shù)均大于3 000，分離效果良好。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫表

2.2 溶液制備

對(duì)照品溶液：精密稱定對(duì)照品葛根素、虎杖苷、阿魏酸和大黃素適量，用甲醇溶解并稀釋成質(zhì)量濃度分別為2 715.64，9 600.00，25.04，4 000.00μg／m L的單一成分對(duì)照品貯備液。分別精密量取葛根素對(duì)照品貯備液、虎杖苷對(duì)照品貯備液、阿魏酸對(duì)照品貯備液、大黃素對(duì)照品貯備液各1m L置容量瓶中即得混合對(duì)照品貯備液Ⅰ（葛根素678.91μg／mL，虎杖苷2 400.00μg／mL，阿魏酸6.26μg／m L，大黃素1 000.00μg／m L），精密量取混合對(duì)照品貯備液Ⅰ1mL，精密加取色譜級(jí)甲醇3m L，即得混合對(duì)照品貯備液Ⅱ（葛根素169.73μg／mL，虎杖苷600.00μg／m L，阿魏酸 1.56μg／m L，大黃素250.00μg／m L）。

1.葛根素 2.虎杖苷 3.阿魏酸 4.大黃素A.對(duì)照品溶液 B.供試品溶液 C.缺葛根陰性對(duì)照品溶液 D.缺虎杖陰性對(duì)照品溶液 E.缺川芎陰性對(duì)照品溶液圖1 高效液相色譜圖

供試品溶液：取本品約0.3 g，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加超純水溶解，超聲30min，靜置冷卻至室溫后用超純水補(bǔ)足容量，離心，0.45μm的微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

陰性對(duì)照品溶液：用免煎顆粒按處方工藝制備不含葛根、虎杖、川芎藥材的陰性樣品，依法制備陰性對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：精密量取貯備液Ⅰ適量，制備葛根素（42.43，84.86，169.73，339.46，678.91μg／m L）、虎杖苷（150.00，300.00，600.00，1 200.00，2 400.00μg／mL）、阿魏酸（0.39，0.78，1.56，3.13，6.26μg／m L）和大黃素（62.50，125.00，250.00，500.00，1 000.00μg／m L）的系列溶液。再分別精密吸取10μL注入色譜儀，以峰面積（Y）對(duì)質(zhì)量濃度（X，μg／m L）進(jìn)行線性擬合。得回歸方程，見表2。

檢測(cè)限及定量限：精密吸取貯備液Ⅱ，采用倍比稀釋的方法，檢測(cè)限按照信噪比（S／N）大于3，定量限按照信噪比（S／N）大于10的要求檢測(cè)。結(jié)果見表2。

精密度試驗(yàn)：精密吸取貯備液Ⅱ10μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積。葛根素、虎杖苷、阿魏酸和大黃素峰面積的RSD分別為 0.35%，0.96%，1.60%，1.14%（n＝6），表明儀器精密度良好。詳見表3。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密吸取同一供試品溶液10μL，分別于0，2，4，6，8，12，24 h時(shí)進(jìn)樣，測(cè)定峰面積。葛根素、虎杖苷、阿魏酸和大黃素峰面積的 RSD分別為0.23%，0.81%，1.55%，1.44%（n＝7），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。詳見表4。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批（批號(hào)為130301）樣品，依法平行制備供試品溶液6份，測(cè)定峰面積。葛根素、虎杖苷、阿魏酸和大黃素峰面積的 RSD分別為 0.80%，1.30%，1.73%，1.43%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。詳見表5。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的樣品6份，每份約0.3 g，分別精密加入一定量的葛根素、虎杖苷、阿魏酸和大黃素對(duì)照品，依法制得供試品溶液，測(cè)定含量，計(jì)算回收率，結(jié)果見表6。

表2 線性關(guān)系考察結(jié)果

表3 精密度試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

表4 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果（n＝7）

表5 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

表6 3批樣品含量測(cè)定結(jié)果(每片平均含量)

2.4 樣品含量測(cè)定

取樣品3批，依法分別制成供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算樣品含量。結(jié)果見表7。

3 討論

3.1 提取方法選擇

曾比較索氏提取和超聲提取方法，結(jié)果在相同提取時(shí)間下索氏提取法的提取率與超聲提取法無(wú)明顯區(qū)別，超聲提取簡(jiǎn)單、方便，安全性更高，故試驗(yàn)中用超聲提取。

3.2 超聲提取時(shí)間選擇

曾選擇超聲提取10，20，30，40，50，60 min，結(jié)果提取率相差不大，葛根素在40min的提取率相對(duì)較大，虎杖苷、阿魏酸和大黃素在30min的提取率相對(duì)較大，故本試驗(yàn)中選用30min超聲提取。

3.3 提取溶劑選擇

考察了 50%甲醇、75%甲醇、甲醇、50%甲醇－0.5%磷酸、75%甲醇－0.5%磷酸，甲醇－0.5%磷酸提取。結(jié)果以75%甲醇提取的干擾較小，且峰型也較好，磷酸的加入對(duì)色譜圖無(wú)明顯影響，故選用75%甲醇提取。

3.4 流動(dòng)相選擇

流動(dòng)相考察甲醇－水、甲醇－醋酸溶液、甲醇－甲酸溶液、甲醇－磷酸溶液、乙腈－磷酸溶液、甲醇－乙腈－磷酸溶液。結(jié)果乙腈－磷酸溶液和甲醇－乙腈－磷酸溶液對(duì)5種成分均有較好的分離，但乙腈毒性和成本高，故選擇甲醇－乙腈－磷酸溶液進(jìn)行梯度洗脫。

3.5 陰性對(duì)照品的制備

按2015年版《中國(guó)藥典(一部)》中養(yǎng)陰降糖片的制作工藝來(lái)制作陰性對(duì)照品，用免煎顆粒制作的陰性對(duì)照品的高效液相圖譜與生產(chǎn)工藝的陰性對(duì)照?qǐng)D譜雖有差異，但影響不大，考慮某些陰性對(duì)照品不易找到，按處方工藝制備陰性對(duì)照品程序比較煩瑣，所用設(shè)備不齊全及試驗(yàn)用量較少，用免煎顆粒制作陰性對(duì)照品方法簡(jiǎn)單，且不影響試驗(yàn)結(jié)果，故本試驗(yàn)用免煎顆粒制作陰性對(duì)照品。

表7 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

綜上所述，建立了同步測(cè)定養(yǎng)陰降糖片中虎杖苷、大黃素、葛根素和阿魏酸4種有效成分含量的HPLC法，經(jīng)試驗(yàn)證明，該方法精密度、準(zhǔn)確性良好，完全符合藥品檢測(cè)要求，可用于養(yǎng)陰降糖片的質(zhì)量監(jiān)測(cè)及有關(guān)研究。

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Content Determ ination of 4 Com ponents in Yangyin Jiangtang Tab lets by HPLC

Jiang Hui1,Li Kaizhi2,Wang Shaozhi1,Fu Lianhao1,Zhang Xijie1,Liu Xiaohong1
(1.Tang Shan Workers Hospital,Hebei,Tangshan,China 063000;2.The Second Hospital of Tangshan City,Hebei,Tangshan,China 063000)

Ob jective To establish an HPLC method for content determination of puerarin,polydatin,ferulic acid and emodin in Yangyin Jiangtang Tablets.M ethods The Agilent Zorbax Eclipse XDB－C18(150 mm×4.6 mm,5μm)chromatographic separation column was used,mobile phase were composed of acetonitrile(A)－methanol(B)－0.5%H3PO4(C)solution in a linear gradient elution mode(0 min: A 10%,B 5%,C 85%;10 min:A 20%,B 5%,C 75%;20 min:A 25%,B 5%,C 70%;30 min:A 30%,B 7%,C 53%;40 min: A 50%,B 30%,C 20%;55 min:A 50%,B 30%,C 20%).The flow rate was 0.6 m L／min,and the column temperature was set at 30℃,the injection volume was 10μL.The detection wave length were set at 250,306,254,320 nm.Resu lts There was a good linear relationship in a range of 42.43－678.91μg／m L for puerarin,150.00－2 400.00μg／m L for polydatin,0.39－6.26μg／mL for ferulic acid,62.50－1 000.00μg／mL for emodin,respectively.The average recovery were 98.59%,99.12%,98.70%,98.89%,respectively,the RSDs were 0.30%,0.52%,1.79%,0.61%(n＝6),respectively.Conclusion The method has good separation effect,it is simple,convenient,and can control the quality of Yangyin Jiangtang Tablets.

preparations of traditional Chinese medicine;HPLC;content determination;puerarin;polydatin;ferulic acid;emodin

2016－08－22；

2016－10－23)

10.3969／j.issn.1006－4931.2017.07.010

姜暉，碩士研究生，副主任藥師，研究方向?yàn)樗幚韺W(xué)、藥物分析學(xué)，（電話）0315－3722840（電子信箱）jianghui910＠163.com。

劉曉紅，博士研究生，碩士研究生導(dǎo)師，主任藥師，研究方向?yàn)樗幚韺W(xué)、臨床藥學(xué)和藥物分析學(xué)，（電話）0315－3722435（電子信箱）13930520000＠163.com。

R284.1

A

1006－4931(2017)07－0032－05