周文杰，張治軍，馬娜妹

（1.廣西壯族自治區(qū)桂林食品藥品檢驗(yàn)所，廣西 桂林 541002； 2.桂林醫(yī)學(xué)院，廣西 桂林 541004）

·檢驗(yàn)檢測(cè)·

超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定動(dòng)物類藥材中4種雌激素殘留

周文杰1，張治軍1，馬娜妹2

（1.廣西壯族自治區(qū)桂林食品藥品檢驗(yàn)所，廣西 桂林 541002； 2.桂林醫(yī)學(xué)院，廣西 桂林 541004）

目的 建立同時(shí)測(cè)定動(dòng)物類藥材中4種雌激素（雌酮、己烯雌酚、己烷雌酚和己二烯雌酚）殘留的超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC－MS／MS）法。方法 樣品加β－葡萄糖醛酸酶酶解后，甲醇－乙酸鈉緩沖鹽提取，用Carb小柱和NH2小柱凈化。色譜柱為Agilent SB－C18柱（150mm×2.1mm，1.8μm），流動(dòng)相為乙腈－水，梯度洗脫，柱溫為35℃。以負(fù)離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式監(jiān)測(cè)，同位素內(nèi)標(biāo)法定量。結(jié)果 4種雌激素質(zhì)量濃度在1～200 ng／mL的范圍內(nèi)均與峰面積線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r均大于0.998 5，方法檢測(cè)限均為1.5μg／kg，平均回收率均為70% ～110%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為4.2% ～15.1%。結(jié)論 該法靈敏度高、重復(fù)性好，可用于動(dòng)物藥材中4種雌激素藥物殘留的測(cè)定。

超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜；雌酮；己烯雌酚；己烷雌酚；己二烯雌酚；殘留測(cè)定；動(dòng)物類藥材

在我國(guó)，動(dòng)物類藥材應(yīng)用歷史悠久，在中藥發(fā)展中有重要地位。隨著科技的進(jìn)步，不少藥用動(dòng)物由野生變?yōu)槿斯ゐB(yǎng)殖。這對(duì)于擴(kuò)大藥用動(dòng)物資源，保護(hù)野生瀕危動(dòng)物的品種及資源具有重要作用。在動(dòng)物的人工養(yǎng)殖過(guò)程中，普遍存在獸藥使用的問(wèn)題。例如雌激素，這類藥物在動(dòng)物養(yǎng)殖過(guò)程中常作為生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑使用，其性質(zhì)一般較穩(wěn)定，不易被降解，通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體后，仍具有較強(qiáng)的生物活性及潛在的致癌性[1]。因此，我國(guó)農(nóng)業(yè)部235號(hào)公告規(guī)定，禁止在動(dòng)物性食品中檢出己烯雌酚。目前雌激素類物質(zhì)的測(cè)定方法有液相色譜法[2]、氣相色譜 －質(zhì)譜法[3－4]、液相色譜 －質(zhì)譜法[1，5－7]，但測(cè)定的樣品主要以動(dòng)物源性食品、飼料、奶粉為主。動(dòng)物類藥材中雌激素測(cè)定尚未見(jiàn)研究報(bào)道。本試驗(yàn)中以常用動(dòng)物藥雞內(nèi)金、土鱉蟲(chóng)、地龍、水蛭為例，建立了同時(shí)測(cè)定雌酮、己二烯雌酚、己烷雌酚、己烯雌酚殘留的超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC－MS／MS)法。試驗(yàn)結(jié)果表明，該法可為檢測(cè)動(dòng)物類藥材中雌激素藥物殘留提供技術(shù)參考。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1290型Infinity超高效液相色譜儀，Agilent 6460型三重四極桿質(zhì)譜儀，帶噴射流離子聚焦電噴霧離子源（Jet－Stream ESI）(安捷倫科技有限公司)；Mettler XS205DU型電子分析天平(梅特勒中國(guó)有限公司)；Millipore synergy型超純水儀(密理博中國(guó)有限公司)；Sigma 3－30K型高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Sigma有限公司)。

1.2 試藥

對(duì)照品：雌酮（批號(hào)為 100849－200501，純度為100.0%），購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；己二烯雌酚（批號(hào)為 30824，純度為 96.1%），己烷雌酚 （批號(hào)為40903，純度為99.8%），己烯雌酚（批號(hào)為31017，純度為99.5%），均購(gòu)于Dr.EhrenstorferGmbH公司；雌酮－d2（批號(hào)為C330P14，純度為99.1%），己烯雌酚－d8（批號(hào)為I415P17，純度為99.6%），均購(gòu)于C／N／D ISOTOPES公司；己二烯雌酚－d2（批號(hào)為227，純度為100.0%），購(gòu)于CEC公司；己烷雌酚－d4（批號(hào)為H295303，純度為97.0%），購(gòu)于TRC公司；β－葡萄糖醛酸酶／芳基硫酸酯酶溶液（β－葡萄糖醛酸酶≥100 000 U／m L，芳基硫酸酯酶≤20 000 U／m L，批號(hào)為W 291K121），購(gòu)于上海安譜科技有限公司。

樣品：地龍、水蛭、雞內(nèi)金、土鱉蟲(chóng)各30批，購(gòu)自不同地區(qū)藥材市場(chǎng)和藥店。

試劑：甲醇、乙腈、二氯甲烷、正己烷均為色譜純，乙酸、乙酸鈉為分析純；水為超純水（電阻率為18.2MΩ／cm）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜及質(zhì)譜條件

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Agilent SB－C18柱（150 mm×2.1mm，1.8μm）；流動(dòng)相：乙腈和水梯度洗脫(0～1 min，35%乙腈線性變化至 55%；1～5 min，55%乙腈線性變化至65%；5～8 min，維持 35%乙腈)；柱溫：35℃；流速：0.2m L／min；進(jìn)樣量：10μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件

采用帶Jet－Stream的電噴霧離子源（ESI）；干燥氣溫度：350℃；干燥氣流量：5 L／min；鞘氣溫度：250℃；鞘氣流量：11 L／min；選擇負(fù)離子掃描方式，毛細(xì)管電壓為3 500 V；多反應(yīng)檢測(cè)模式（MRM）；定量離子對(duì)、定性離子對(duì)、碎裂電壓、碰撞能量見(jiàn)表1。

表1 質(zhì)譜分析條件

2.2 溶液制備

2.2.1 混合對(duì)照品貯備液

取雌酮、己二烯雌酚、己烷雌酚和己烯雌酚對(duì)照品各10 mg，置10 m L容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，搖勻，分別得到質(zhì)量濃度為1 000μg／m L的對(duì)照品貯備液。

2.2.2 內(nèi)標(biāo)溶液

取雌酮－d2、己二烯雌酚－d2、己烷雌酚－d4、己烯雌酚－d8對(duì)照品溶液1 m L，用乙腈溶解并稀釋成質(zhì)量濃度為100 ng／mL的內(nèi)標(biāo)溶液。

2.2.3 供試品溶液

稱取粉碎后的樣品2.0 g置50m L離心管中，加入內(nèi)標(biāo)溶液100μL，加入10 m L乙酸－乙酸鈉緩沖溶液[稱取43.0 g乙酸鈉（NaAC·4H2O），加入22m L乙酸，用水溶解并稀釋至1 000m L，用乙酸調(diào)節(jié)pH至5.2]，渦旋混勻 1 min，加入 β－葡萄糖醛酸酶 100μL，于（37±1）℃震蕩酶解12 h，取出冷卻至室溫。加入20mL甲醇超聲提取30min，4℃以下10000 r／min離心10min，吸取上清液3m L置另一潔凈燒杯中，加水10mL，混勻后待凈化。

Carb小柱（500mg，6 m L）依次用6 mL二氯甲烷－甲醇溶液（7∶3，V／V）、6m L甲醇、6mL水活化；NH2小柱（500 mg，6 m L）用6 m L二氯甲烷－甲醇溶液（7∶3）活化。將待凈化液以2 m L／min的速度上樣于Carb小柱，將小柱減壓抽干，再將活化好的NH2小柱串接在Carb小柱下方，用6m L二氯甲烷－甲醇溶液（7∶3，V／V）洗脫并收集洗脫液，取下Carb小柱，再用2mL二氯甲烷－甲醇溶液（7∶3，V／V）洗脫，合并洗脫液，于35℃水浴中氮吹至干，殘?jiān)?0%乙腈1 mL溶解，渦旋振蕩30 s，過(guò)0.2μm濾膜置進(jìn)樣瓶，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

按2.1項(xiàng)下色譜及質(zhì)譜條件試驗(yàn)，在空白基質(zhì)加對(duì)照品溶液的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）質(zhì)譜圖中，在雌酮、己二烯雌酚、己烷雌酚和己烯雌酚峰附近未見(jiàn)有明顯的雜質(zhì)干擾峰。詳見(jiàn)圖1。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

取混合對(duì)照品貯備液與內(nèi)標(biāo)貯備液適量，用乙腈稀釋成質(zhì)量濃度分別為1.0，2.0，5.0，10.0，20.0，50.0，100.0，200.0 ng／mL的混合對(duì)照品溶液。每份均含有10.0 ng／m L內(nèi)標(biāo)溶液，按擬訂色譜、質(zhì)譜條件測(cè)定。以對(duì)照品與內(nèi)標(biāo)的峰面積比（Y）為縱坐標(biāo)、對(duì)照品與內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量濃度比（X）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程，雌酮為 Y＝0.240 146X＋0.006 858，r＝0.999 5 (n＝8)；己二烯雌酚為 Y＝0.181 206X＋0.064 213，r＝0.998 5(n＝8)；己烷雌酚為 Y＝0.325 09X－0.037734，r＝0.9993(n＝8)；己烯雌酚為 Y＝0.164558X－0.035 598，r＝0.999 2(n＝8)。結(jié)果表明，4種雌激素質(zhì)量濃度在1～200 ng／m L范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

圖1 4種雌激素及內(nèi)標(biāo)的MRM色譜圖

2.3.3 精密度試驗(yàn)

取質(zhì)量濃度為20 ng／mL的混合對(duì)照品溶液10μL，連續(xù)進(jìn)樣 5次，按擬訂色譜、質(zhì)譜條件測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果雌酮、己二烯雌酚、己烷雌酚和己烯雌酚峰面積的 RSD分別為2.0%，2.0%，2.4%，2.7%(n＝5)，表明儀器精密度較好。

2.3.4 定量限及檢出限測(cè)定

取空白土鱉蟲(chóng)樣品2.0 g，置50mL離心管中，添加50 ng／m L的對(duì)照品溶液0.2 mL，放置一段時(shí)間，即添加量為5μg／kg，依法提取和凈化，按擬訂色譜、質(zhì)譜條件進(jìn)樣，測(cè)定。依據(jù)特征離子色譜峰信噪比 S／N＝3確定方法檢出限，S／N＝10確定方法定量限。結(jié)果測(cè)得雌酮、己二烯雌酚、己烷雌酚、己烯雌酚的檢出限均為1.5μg／kg，定量限均為5μg／kg。

2.3.5 回收率試驗(yàn)

稱取空白土鱉蟲(chóng)樣品2.0 g，置50 m L離心管中，分別添加 200 ng／mL的混合對(duì)照品溶液 0.25，0.5，1.0 m L（即添加量為 25，50，100μg／kg），放置一段時(shí)間，依法提取和凈化，按擬訂色譜、質(zhì)譜條件進(jìn)樣測(cè)定，每個(gè)質(zhì)量濃度作6次平行試驗(yàn)，計(jì)算3種濃度下的回收率和方法精密度。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 雌酮、己二烯雌酚、己烷雌酚和己烯雌酚的回收率試驗(yàn)結(jié)果(n＝6)

2.4 樣品含量測(cè)定

從醫(yī)藥公司及藥店購(gòu)買雞內(nèi)金、土鱉蟲(chóng)、地龍、水蛭藥材飲片各10批樣品進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果均未檢出4種雌激素。

3 討論

3.1 提取方法的比較

在質(zhì)譜檢測(cè)過(guò)程中，樣品的基質(zhì)效應(yīng)是不能忽視的問(wèn)題。樣品的制備方法通常包括提取與凈化2個(gè)步驟。參考相關(guān)文獻(xiàn)，采用提取后添加法[8]分別比較了以下幾種方法的基質(zhì)效應(yīng)：1）碳酸鈉溶液（100 g／L）＋乙酸乙酯提取，HLB小柱凈化[1]；2）國(guó)標(biāo)21981－2008中樣品制備方法[5]；3）純水＋乙腈＋NaCl提取，NH2小柱凈化[6]；4）乙腈提取，C18小柱凈化[7]。結(jié)果1)，3)，4)3種方法制備的樣品溶液基質(zhì)效應(yīng)很明顯，估計(jì)是因?yàn)閯?dòng)物藥材含水量少，基體組成復(fù)雜，在樣品制備過(guò)程中提出的干擾基質(zhì)多，凈化的效果不理想。而按國(guó)標(biāo)方法制備的樣品溶液可檢測(cè)到相應(yīng)的對(duì)照品色譜峰，但仍存在一定的基質(zhì)效應(yīng)。將提取液減量進(jìn)行凈化，樣品的基質(zhì)效應(yīng)基本可以消除，同時(shí)可獲得較好的回收率及靈敏度。因此，樣品的制備參照國(guó)標(biāo)方法進(jìn)行，同時(shí)將提取液減量?jī)艋?/p>

3.2 色譜和質(zhì)譜條件的優(yōu)化

以目標(biāo)化合物的靈敏度與分離度為考察指標(biāo)，分別比較乙腈－0.1%乙酸、乙腈－水、乙腈－10mmol／L乙酸銨（含0.1%甲酸）為流動(dòng)相的效果，結(jié)果通過(guò)調(diào)整洗脫梯度，3種流動(dòng)相對(duì)4種組分的分離效果相當(dāng)。而以乙腈－水為流動(dòng)相時(shí)，各組分可獲得最大的靈敏度，因此確定以乙腈－水為流動(dòng)相，梯度洗脫。

配制10μg／m L的雌酮、己二烯雌酚、己烷雌酚、己烯雌酚對(duì)照品溶液及雌酮－d2、己二烯雌酚－d2、己烷雌酚－d4、己烯雌酚－d8內(nèi)標(biāo)溶液，按國(guó)標(biāo)[5]方法，選擇在負(fù)離子模式下對(duì)各目標(biāo)化合物的母離子和子離子進(jìn)行掃描，對(duì)碎裂電壓、碰撞能量和離子化溫度等質(zhì)譜條件分別進(jìn)行優(yōu)化，以達(dá)到理想的結(jié)果。優(yōu)化結(jié)果見(jiàn)2.2項(xiàng)下質(zhì)譜條件。

綜上所述，本研究建立的方法，操作相對(duì)簡(jiǎn)單，結(jié)果準(zhǔn)確，靈敏度高，可用于雞內(nèi)金、土鱉蟲(chóng)、地龍、水蛭動(dòng)物類藥材中雌激素的測(cè)定。

[1]徐英江，田秀慧，張秀珍，等.超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)水產(chǎn)品中8種雌激素的測(cè)定[J].分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2010，29（2）：152－156.

[2]肖 晶，邵 兵，吳永寧，等.用高壓液相色譜法檢測(cè)罐裝食品中類雌激素雙酚 A和烷基酚[J].中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2007，41（6）：449－452.

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[5]GB／T 21981－2008，動(dòng)物源食品中激素多殘留檢測(cè)方法液相色譜－質(zhì)譜／質(zhì)譜法[S].

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Determ ination of 4 Estrogens Residue in Anim al M edicinal Herbs by UPLC－M S／M S

Zhou Wenjie1，Zhang Zhijun1，Ma Namei2
（1.Guilin Institute for Food and Drug Control，Guilin，Guangxi，China 541002； 2.Guilin Medical University，Guilin，Guangxi，China 541004）

Ob jective To establish an ultra performance liquid chromatography－tandem mass spectrometry（UPLC－MS／MS）method for determination of 4 estrogens（estrone，diethylstilbestrol，hexoestrol，dienoestrol）residue in animal medicinal herbs.M ethods The sample was enzymolyzed by addingβ－glycuronidase，extrated by methanol－sodiumacelate butler satt，purified by Carb and NH2pillaret.The extract was separated on an Agilent SB－C18column（150 mm×2.1 mm，1.8μm）with gradient elution using a mobile phase consisting of acetonitrile－water.The column temperature was 35℃.The multiple reaction monitoring（MRM）was used for monitoring，and the isotope internal standard method was used for quantifying.Results The calibration curve for 4 estrogens displayed good linearity in the range of 1－200 ng／m L（r＞0.998 5）.The limit of detection of the proposed method was 1.5μg／kg，the recoveries were 70% －110%，RSD was 4.2% －15.1%.Conclusion The method has high sensitivity and good reproducibility，which can be suitable for the determination of 4 estrogens residue in animal medicinal herbs.

UPLC－MS／MS；estrone；diethylstilbestrol；hexoestrol；dienoestrol；residue delermination；animal medicinal herbs

R914.1；R931.74

A

1006－4931(2017)08－0017－04

2017－01－06)

10.3969／j.issn.1006－4931.2017.08.005

廣西食品藥品監(jiān)督管理局科研項(xiàng)目[桂食藥監(jiān)科評(píng)[2 0 1 5]2 0號(hào)]。

周文杰（1985－），男，主管藥師，主要從事藥品質(zhì)量控制研究，（電子信箱）44508397＠qq.com。