吳永琴， 王志恒， 高 晶， 陳慧芬， 唐振華， 應(yīng)春妹

外陰陰道念珠菌病患者耐氟康唑白念珠菌克隆流行分析

吳永琴1， 王志恒1， 高 晶1， 陳慧芬2， 唐振華3， 應(yīng)春妹1

目的 探討上海地區(qū)外陰陰道念珠菌病的菌種分布及其主要致病菌的分子流行特點(diǎn)，并進(jìn)行菌株遺傳進(jìn)化分析。方法 收集 2015 年 8 月至 2016 年 2 月復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院、上海市第一婦嬰保健院及國際和平婦幼保健院 3 所醫(yī)院外陰陰道念珠菌病患者分離得念珠菌共 2 185 株，進(jìn)行菌種鑒定及統(tǒng)計(jì)分析，并采用 ATB FUNGUS 3 試劑盒檢測抗真菌藥物體外最低抑菌濃度，對其主要致病菌運(yùn)用多位點(diǎn)序列分型（MLST）的方法進(jìn)行分子分型，同時(shí)應(yīng)用 eBURST 和 MEGA 6.0 軟件進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。結(jié)果 2 185 株念珠菌屬中共鑒定出白念珠菌 1 988 株，光滑念珠菌 149 株，熱帶念珠菌 20 株，其他念珠菌 28 株 ；白念珠菌對氟康唑耐藥率為 6.5% ；93 株白念珠菌共檢測出 26 個(gè)二倍體序列型（DST），其中 50 株敏感菌序列型為分散分布，而 43 株耐氟康唑白念珠菌集中于同一個(gè)克隆復(fù)合體（CC 69），并處于同一個(gè)進(jìn)化樹分枝上（Clade 1）。結(jié)論 白念珠菌是上海地區(qū)3所婦產(chǎn)科醫(yī)院外陰陰道念珠菌病的主要致病菌，對三唑類藥物的耐藥率較高，而且耐氟康唑白念珠菌表現(xiàn)為 CC 69 的克隆傳播流行，需要進(jìn)行重點(diǎn)監(jiān)控。

外陰陰道念珠菌病 ； 白念珠菌 ； 多位點(diǎn)序列分型 ； 克隆流行

外陰陰道念珠菌?。╲ulvovaginal candidiasis，VVC）是由念珠菌屬感染引起的一種常見的婦科疾病。流行病學(xué)研究表明，約 75% 育齡女性一生中至少會(huì)感染 1 次 VVC，而且其中約 5%～8% 的女性會(huì)遭受復(fù)發(fā)性 VVC 的困擾[1]。念珠菌屬是女性陰道的正常寄生菌，當(dāng)陰道局部微環(huán)境發(fā)生變化，機(jī)體免疫力低下時(shí)，念珠菌屬就會(huì)過度繁殖，進(jìn)而發(fā)展為 VVC。本研究就上海3所婦產(chǎn)科?？漆t(yī)院送檢陰道分泌物標(biāo)本進(jìn)行培養(yǎng)及藥敏試驗(yàn)，分析VVC的菌種分布以及念珠菌屬的耐藥性，為臨床診治VVC提供幫助。

白念珠菌是VVC患者的主要臨床分離菌，對白念珠菌進(jìn)行基因分型對了解其分子流行特點(diǎn)和指導(dǎo)臨床防治具有重要意義。目前，主要的分子分型方法包括多位點(diǎn)序列分型（multilocus sequence typing， MLST）、脈沖場凝膠電泳、微衛(wèi)星長度多態(tài)性、隨機(jī)擴(kuò)增片段長度多態(tài)性及限制性長度多態(tài)性等[2-5]。其中 MLST 分型技術(shù)因?yàn)榉直媛矢?，重?fù)性好及易與國內(nèi)外比較等優(yōu)點(diǎn)而得到廣泛應(yīng)用。本研究選取上海3所婦產(chǎn)科?？漆t(yī)院VVC患者中分離的部分敏感和耐藥白念珠菌進(jìn)行分子分型，探討其流行規(guī)律，以便為VVC的診治提供臨床分子流行病學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源與鑒定

收集 2015 年 8 月至 2016 年 2 月 VVC 患者分離的念珠菌菌株共 2 185 株，其中 1 223 株來自復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院，684 株來自上海市第一婦嬰保健院，278 株來自國際和平婦嬰保健院，所有菌株均分離自患者的陰道分泌物。標(biāo)本收集后立即接種科瑪嘉顯色平皿（上?？片敿挝⑸锛夹g(shù)有限公司），置于 30 ℃孵育箱中培養(yǎng) 24～48 h?？片敿物@色平皿上綠色菌落為白念珠菌，紫色為光滑念珠菌，藍(lán)灰色為熱帶念珠菌，粉紅色為克柔念珠菌，白色為其他念珠菌。并采用 API 20C AUX酵母菌鑒定系統(tǒng)（生物梅里埃公司，法國）加以鑒定。所有菌株保存于 25% 甘油 YPD 保存液中，-80 ℃冷凍保存。隨機(jī)選取 3 所醫(yī)院鑒定好的 43 株氟康唑耐藥株和 50 株氟康唑敏感株進(jìn)行分子流行分析。

1.2 藥敏試驗(yàn)

挑取平皿上的單個(gè)菌落，按照法國生物梅里埃公司 ATB FUNGUS 3 試劑盒說明書進(jìn)行體外抗真菌藥物敏感試驗(yàn)，自行判斷藥敏結(jié)果。該試劑盒測試了 5 種抗真菌藥物 ：5-氟胞嘧啶、兩性霉素 B、氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑。試驗(yàn)質(zhì)控菌株為近平滑念珠菌 ATCC 22019 和克柔念珠菌ATCC 6258。藥敏結(jié)果按照 CLSI M27-S4 折點(diǎn)判斷。隨機(jī)選取的 93株白念珠菌使用微量肉湯稀釋法進(jìn)一步驗(yàn)證藥敏結(jié)果。

1.3 MLST 分型方法及引物

參照MLST數(shù)據(jù)庫（http：//pubmlst.org/ calbicans/）中給出的7對管家基因序列進(jìn)行MLST分型，所有引物均來自該數(shù)據(jù)庫。將每個(gè)菌株的管家基因序列提交數(shù)據(jù)庫，即可得到對應(yīng)的等位基因型別，進(jìn)而確定二倍體序列型（diploid sequence type， DST）。7對管家基因序列引物見表1。

1.4 基因組提取、擴(kuò)增及測序

將 活化的 菌 種接種 于 YPD 平皿 30 ℃培 養(yǎng)24 h， 挑 取 單 個(gè) 克 隆 接 種 至 5 mL YPD 培 養(yǎng) 液 中30 ℃恒溫?fù)u床中搖菌 24 h，離心并去上清液，用無菌 PBS 洗 2次，吸凈上清液。使用玻璃珠振蕩法破壁后，采用酚氯仿法抽提基因組DNA，使用Nanodrop 2000 核酸定量分析儀檢測基因組 DNA濃度，用無菌雙蒸水稀釋至 100 ng /μL。所有 PCR反 應(yīng) 條 件 參 照 PrimeSTAR? HS DNA Polymerase試劑盒（大連寶生物工程有限公司，中國）說明書。PCR 產(chǎn)物雙向測序由北京六合華大基因科技股份有限公司上海分公司完成。

1.5 eBURST分析

將 得 到 的 DST 型 及 等 位 基 因 位 點(diǎn) 提 交eBURST v3 在 線 軟 件（http ：//eburst.mlst.net/v3/ enter_data/single/），然后進(jìn)行聚類分析。

1.6 菌株進(jìn)化關(guān)系分析

根據(jù) Odds 等[6]對 1 391 株白念珠菌的 MLST分型及構(gòu)建進(jìn)化樹的方法，將本次所有DST型別與 已 知 Clade 的 1 005 個(gè) 不 同 的 DST 型 別 一 起 分析，使用 MEGA6.0 軟件，并采用非加權(quán)組平均法（unweighted pair-group method with arithmetic means， UPGMA） 及 Bootstrap 的 1 000 次 重 復(fù)，從而繪制出系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，并得出 Clade 分群。根據(jù) Shin 等[7]建議，以 0.04 作為 p-distance 劃分Clade 分枝的閾值。

2 結(jié)果

2.1 VVC 的菌種分布和耐藥分析

3 所 醫(yī) 院 VVC 患 者 中 共 分 離 出 2 185 株 念 珠菌 屬， 其 中 白 念 珠 菌 1 988 株， 光 滑 念 珠 菌 149株，熱帶念珠菌 20 株，近平滑念珠菌 15 株，克柔念珠菌 8株，其他念珠菌 5株，見表2。3所醫(yī)院VVC患者臨床分離菌均以白念珠菌為主，其次為光滑念珠菌，菌種分布基本一致。白念珠菌對伊曲康唑耐藥率最高，達(dá)到 24.5%，對氟康唑也有一定的耐藥率。非白念珠菌對三唑類藥物耐藥率明顯高于白念珠菌，見表3。

表1 MLST 分型的 7 對管家基因引物序列Table 1 Seven pairs of housekeeping gene primers for multilocus sequence typing

2.2 白念珠菌MLST 分型

本次共選取 93 株白念珠菌進(jìn)行 MLST 分型，共發(fā)現(xiàn) 26 個(gè) DST 型別，其中 50 株敏感菌檢測到了 26 個(gè) DST 型別，而 43 株耐藥株僅檢測到 5 個(gè)DST 型別。在耐藥菌株中，75% 的菌株為 DST 79型，其余 4 個(gè) DST 型分別為 DST 435、DST 1867、DST 254 和 DST 1395 ；而敏感菌株序列表現(xiàn)為分散分布，沒有檢測到主導(dǎo)的序列型。eBURST 分析顯示，敏感株 26 個(gè)不同的 DST 型分屬于 12 個(gè)克隆復(fù)合體（Clonal Complexes， CC）和 2 個(gè)獨(dú)特型；而耐藥株的 5個(gè)不同DST型均屬于同一個(gè)克隆復(fù)合體，CC 69。本次檢測到的 26 個(gè) DST 型在全球數(shù)據(jù)庫的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分枝上的分布情況見圖1。在這 93 株白念珠菌中，敏感株分布在 9個(gè)已知的進(jìn)化樹分枝上，而耐藥株均聚集在進(jìn)化枝 1（Clade 1）上。

表2 3所醫(yī)院念珠菌屬菌種分布Table 2 Distribution of Candida species in three hospitals

表3 3所醫(yī)院念珠菌屬對抗真菌藥物的耐藥率Table 3 Resistance rates of Candida species to antifungal agents in three hospitals（%）

圖1 白念珠菌系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Figure 1 Phylogenetic tree of Candida albicans

3 討論

VVC是育齡期女性的常見婦科病，診斷治療不當(dāng)，易發(fā)展為復(fù)發(fā)性 VVC，嚴(yán)重影響女性的生殖 健 康。 本 研 究 對 2 185 例 VVC 標(biāo) 本 進(jìn) 行 了 培 養(yǎng)與鑒定，結(jié)果表明上海地區(qū)VVC的致病菌以白念珠菌為主，約占 91%，非白念珠菌以光滑念珠菌為主。國內(nèi)外流行病學(xué)研究顯示，VVC的臨床分離株以白念珠菌為主，其次是光滑念珠菌[8-10]，與本研究結(jié)果一致。VVC分離的白念珠菌及其他念珠菌對抗菌藥物的敏感性較高，說明目前的抗真菌藥對VVC的致病真菌有良好的抗菌活性，這與國內(nèi)外的一些研究報(bào)道結(jié)果一致[11-12]。但也有一部分VVC患者因治療不當(dāng)會(huì)慢慢發(fā)展為復(fù)發(fā)性VVC，嚴(yán)重影響患者身心健康。需要說明的是，由于商品化試劑檢測說明書仍然使用的是 CLSI M27-S3 折點(diǎn)，本研究耐藥率統(tǒng)計(jì)可能與現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)判讀存在差異。

本研究選取了93株白念珠菌進(jìn)行MLST分型，共得到 26 個(gè) DST 型，其中 50 株敏感株包含了所有 26 個(gè) DST 型。白念珠菌基因型別具有較大的多樣性，目前數(shù)據(jù)庫有三千多個(gè)DST型，展現(xiàn)出較強(qiáng)的基因可塑性。國內(nèi)外研究結(jié)果表明不同地區(qū)及不同部位分離的白念珠菌都擁有豐富的基因型，并且大部分基因型經(jīng) eBURST 分析后分屬于不同的克隆復(fù)合體[13-15]。Moorhouse 等[16]指出，正是白念珠菌龐大的基因型別，使得白念珠菌在外界環(huán)境的選擇壓力下表現(xiàn)出頑強(qiáng)的生存能力。

43 株耐氟康唑白念珠菌僅檢測到 5 個(gè) DST型，其中 DST 79 占 75%，而且所有序列型都屬于CC 69 克隆復(fù)合體，呈現(xiàn)出耐藥株的克隆流行。這與敏感菌株序列型的離散分布明顯不同，正如上文所述，三唑類藥物的選擇壓力使得白念珠菌序列型朝著優(yōu)勢序列型方向發(fā)展。同時(shí)，通過系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹的繪制，我們也同樣發(fā)現(xiàn)所有耐藥株都處于同一個(gè)進(jìn)化樹分枝上（Clade 1）。Odds 等[6]最早將全球數(shù)據(jù)繪制成系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化圖譜，并發(fā)現(xiàn)全球流行的菌株主要集中在進(jìn)化樹分枝 Clade 1至 Clade 4。Ge 等[17]證實(shí)了陰道分離的白念珠菌基因型別的多樣性，與本研究中敏感菌在進(jìn)化樹上表現(xiàn)的多樣性分布基本一致。目前還沒有關(guān)于耐氟康唑白念珠菌在系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹上獨(dú)特分布的報(bào)道，本研究揭示了其在進(jìn)化樹上集中分布的特點(diǎn)。

綜上所述，上海地區(qū)VVC的致病菌以白念珠菌為主，且白念珠菌對三唑類藥物有一定的耐藥率。白念珠菌是一種機(jī)會(huì)致病性真菌，其基因組可塑性強(qiáng)，在面對環(huán)境壓力時(shí)有很強(qiáng)的適應(yīng)能力[18]。本研究發(fā)現(xiàn)的敏感菌和耐藥菌 DST 型不同分布的特點(diǎn)以及耐藥菌株的 CC 69 克隆流行趨勢也間接驗(yàn)證了這一理論。因此，調(diào)查VVC患者的菌種分布及耐藥特點(diǎn)可以幫助臨床診治疾病；同時(shí)，對白念珠菌的分子分型可以更好地指導(dǎo)臨床用藥和治療VVC。

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Clonal dissemination of fluconazole-resistant Candida albicans strains isolated from vulvovaginal candidiasis

WU Yongqin, WANG Zhiheng, GAO Jing, CHEN Huifen, TANG Zhenhua, YING Chunmei.
（Department of Laboratory Medicine, Obstetrics and Gynecology Hospital of Fudan University, Shanghai 200011, China）

Objective To investigate the distribution and molecular epidemiology of Candida strains isolated from vulvovaginal candidiasis in Shanghai, and conduct molecular phylogenetic analysis of the strains. Methods Candida pathogens were collected from the patients with vulvovaginal candidiasis during the period from August 2015 to February 2016 in Obstetrics and Gynecology Hospital of Fudan University, Shanghai First Maternity and Infant Hospital, and International Peace Maternity and Child Health Hospital. All the strains were identified and statistically analyzed. ATB FUNGUS 3 kit was used to determine the minimum inhibitory concentration of antifungal agents against these strains in vitro. Molecular typing was conducted using multilocus sequence typing (MLST) method. Phylogenetic analysis was carried out by eBURST and MEGA 6 software. Results Of the 2 185 strains of Candida, 1 988 were identif i ed as Candida albicans, 149 Candida glabrata, 20 Candida tropicalis and 28 other Candida species. Overall, 6.5% of the Candida albicans strains were resistant to fl uconazole. Twenty-six diploid sequence types (DSTs) were identified among the 93 strains of Candida albicans analyzed, including 50 fluconazole-susceptible strains with sporadic genotypes, but 43 fl uconazole-resistant strains clustered as one clonal complex (CC 69) on the same branch (MLST Clade 1) of phylogenetic tree. Conclusions Candida albicans was the main pathogen of vulvovaginal candidiasis in the three obstetrics & gynecology hospitals in Shanghai, which showed slightly higher resistance to fluconazole. It is necessary to monitor the spread of fl uconazole-resistant Candida albicans in these hospitals, especially clonal dissemination of CC 69 clone.

vulvovaginal candidiasis; Candida albicans; multilocus sequence typing; clonal dissemination

R379.4

：A

：1009-7708 ( 2017 ) 03-0321-05

10.16718/j.1009-7708.2017.03.017

2016-10-14

2016-11-21

上海申康醫(yī)院發(fā)展中心市級(jí)醫(yī)院臨床輔助科室能力建設(shè)項(xiàng)目（SHDC22014016）。

1. 復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200011；2. 上海市第一婦嬰保健院檢驗(yàn)科；3. 國際和平婦幼保健院檢驗(yàn)科。

吳永琴（1991—），男，碩士研究生，主要從事臨床微生物的分子流行和耐藥機(jī)制研究。

應(yīng)春妹，E-mail：ycmzh2012@163.com。