畢穎敏， 沈 震， 董 棟， 吳 湜， 胡付品， 楊 帆

碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌藥物敏感性及 blaKPC基因檢出率

畢穎敏， 沈 震， 董 棟， 吳 湜， 胡付品， 楊 帆

目的 了解復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌（carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae，CRKP）對(duì)常用抗菌藥物的敏感性及 blaKPC基因的檢出率。方法 收集 2014 年 1－12 月臨床分離的 CRKP，微量肉湯稀釋法測(cè)定 CRKP 對(duì)常用抗菌藥物的敏感性 ；聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增 blaKPC基因。結(jié)果 共收集 CRKP 205 株，主要分離自呼吸道標(biāo)本（76.1%，156/205）和尿標(biāo)本（18.5%，38/205）。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，CRKP 對(duì)大多數(shù)抗菌藥物高度耐藥，除對(duì)多黏菌素 E、替加環(huán)素、甲氧芐啶-磺胺甲唑和阿米卡星的耐藥率分別為 1.5%、0.5%、51.0% 和 74.9% 外，對(duì)其他抗菌藥物的耐藥率在 85%～100% ；87.8%（180/205）菌株為 blaKPC基因陽(yáng)性株。結(jié)論 CRKP 對(duì)多黏菌素和替加環(huán)素之外的多數(shù)臨床常用抗菌藥物呈高度耐藥 ；產(chǎn)KPC 型碳青霉烯酶是CRKP 對(duì)碳青霉烯類耐藥最主要的耐藥機(jī)制。

碳青霉烯類耐藥 ； 肺炎克雷伯菌 ； 敏感性 ； blaKPC基因

近年來(lái)腸桿菌科細(xì)菌尤其是肺炎克雷伯菌對(duì)碳青霉烯類的耐藥率在全球迅速升高[1-4]，給抗菌治療帶來(lái)嚴(yán)重挑戰(zhàn)，其中碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯 菌（carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae，CRKP） 更 被 美 國(guó) CDC 列 為 緊 迫 的 威 脅（urgentthreat）（http ：//www.cdc.gov/ drugresistance/threatreport-2013/）。產(chǎn)碳青霉烯酶是腸桿菌科細(xì)菌對(duì)碳青霉烯類藥物耐藥最主要的耐藥機(jī)制， KPC 型碳青霉烯酶是我國(guó)臨床分離肺炎克雷伯菌中最常見(jiàn)的碳青霉烯酶[5]。本文通過(guò)分析復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院 CRKP菌株對(duì)常用抗菌藥物的敏感性及其blaKPC基因的檢出率，為 CRKP 感染在現(xiàn)有條件下的治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來(lái)源 收集2014年1－12月我院臨床分離的碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌（亞胺培南、美羅培南或厄他培南任一耐藥者）。剔除同一患者同一部位分離的重復(fù)菌株。按常規(guī)方法進(jìn)行菌種鑒定。藥敏試驗(yàn)質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922。

1.1.2 儀器與試劑 抗菌藥物標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。MH瓊脂、MH肉湯、陽(yáng)離子調(diào)節(jié)肉湯為英國(guó)OXOID公司產(chǎn)品；dNTPs（10 mmol/ L）、rTaq酶（5 U/μL）、10×Buffer、分子量Marker DL2000、10×Loading buffer購(gòu)自TaKaRa 生物工程有限公司，基因擴(kuò)增引物、瓊脂糖購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)有限公司。PCR擴(kuò)增儀購(gòu)自TaKaRa 生物工程有限公司，全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 藥敏試驗(yàn) 采用微量稀釋法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。多黏菌素E、替加環(huán)素藥敏結(jié)果根據(jù)歐洲抗菌藥物敏感性試驗(yàn)委員會(huì)（EUCAST）標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判讀，其他抗菌藥物藥敏試驗(yàn)結(jié)果判斷參照美國(guó)臨床與實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）2014 年標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。采用WHONET5.6 軟件進(jìn)行藥敏數(shù)據(jù)分析處理。

1.2.2 blaKPC基因檢測(cè) 煮沸法制備細(xì)菌 DNA 模板，PCR 法擴(kuò)增 blaKPC基因。擴(kuò)增 blaKPC基因通用引物序列為：KPC-F：5’-AGGACTTTGGCGGCTCCAT-3’，KPC-R ：5’-TCCCTCGAGCGCGAGTCTA-3’；反應(yīng)體系為：總體積 50 μL，上下游引物各 1 μL（10 μmol/ L），dNTPs（10 mmol/L）4 μL、10×Bufferr 為5 μL，rTaq 酶（5 U/μg）0.25 μL，高壓滅菌 ddH2O 36.75 μL， 模 板 DNA 2 μL。 每 次 反 應(yīng) 均 設(shè) 陰 性、陽(yáng)性對(duì)照。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng) 1% 瓊脂糖凝膠電泳后使用全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)觀察結(jié)果，陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DNA測(cè)序分析，根據(jù)所測(cè)序列與GenBank 中 BLAST 程序的序列進(jìn)行比對(duì)（www. ncbi.nlm.nih.gov/blast/）以確定 blaKPC基因型。

2 結(jié)果

2.1 菌株分布

2014年 1－12 月共收集 205 株 CRKP 菌株。標(biāo)本來(lái)源分別為呼吸道標(biāo)本（76.1%，156/205）、尿 液（18.5%，38/205）、 腦 脊 液（2.0%，4/205）、傷口膿液和分泌物（2.0%，4/205）、血液（1.0%，2/205）、腹水（0.5%，1/205）。

科室分布分別為神經(jīng)外科病區(qū)（49.8%，102/ 205）（其中創(chuàng)傷病區(qū)為 37.1%、其他病區(qū)為 12.2%）、老年病區(qū)（22.9%，47/205）、重癥監(jiān)護(hù)病區(qū)（ICU）（9.3%，19/205）、特需病房（6.3%，13/205）、永和分院（3.4%，7/205）、感染病區(qū)（3.4%，7/205）、神經(jīng)內(nèi)科（2.4%，5/205）、泌尿外科（1.0%，2/205）、急 診 科（0.5%，1/205）、 腎 內(nèi) 科（0.5%，1/205）、手 外 科（0.5%，1/205）。 在 分 離 出 CRKP 患 者 中，48.8%（100/205）系外院轉(zhuǎn)入患者，其中神經(jīng)外科病 區(qū) 有 60.8%（62/102）（ 其 中 創(chuàng) 傷 病 區(qū) 有 63.2%，48/76 ；其他病區(qū)有 53.8%，14/26）由外院轉(zhuǎn)入。

2.2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 CRKP 菌株對(duì)抗菌藥物的敏感性 CRKP 菌株對(duì)亞胺培南、美羅培南、厄他培南的耐藥率分別為 97.6%、97.6%、98.5% ；對(duì)多黏菌素 E 和替加環(huán)素的耐藥率分別為 1.5% 和 0.5%，MIC90均為1 mg/L ；對(duì)甲氧芐啶-磺胺甲唑、阿米卡星的耐藥率分別為 51.0% 和 74.9%，對(duì)其他抗菌藥物的耐藥率在 85%～100%。見(jiàn)表1。

2.2.2 亞胺培南、美羅培南、多黏菌素和替加環(huán)素對(duì)CRKP的MIC的分布 205株CRKP對(duì)4種藥物的MIC值分布見(jiàn)表2。CRKP對(duì)亞胺培南、美羅培南的MIC多處于較高值，亞胺培南MIC≤4 mg/ L的菌株僅2.9%（6/205），MIC≤16 mg/L的菌株亦僅24.9%（51/205）；美羅培南MIC≤4 mg/ L的菌株僅2.0%（4/205），MIC≤16 mg/L的菌株僅有9.8%（20/205）。對(duì)多黏菌素E的MIC≤0.5 mg/L菌株占61.0%（125/205），對(duì)替加環(huán)素的MIC≤0.5 mg/L菌株占91.2%（187/205）。

2.3 blablaKPCKPC基因篩查

205 株 臨 床 CRKP 菌株 通 過(guò) PCR 擴(kuò) 增， 有87.8%（180/205）檢出 blaKPC基因。 blaKPC基因陽(yáng)性株與陰性株對(duì)慶大霉素和頭孢噻肟的耐藥率均無(wú)差異，均為 100%，兩者對(duì)其他常用抗菌藥物相對(duì)比，耐藥率均相近，見(jiàn)表3。

表1 CRKP 對(duì)臨床常用抗菌藥物的耐藥率和敏感率Table 1 Susceptibility of carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae isolates to the commonly used antimicrobial agents

表2 亞胺培南、美羅培南、多黏菌素和替加環(huán)素對(duì) CRKP 的 MIC 分布Table 2 Distribution of the MIC values of imipenem， meropenem， colistin and tigecycline against carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae [ n ( % ) ]

3 討論

我院分離的 CRKP菌株主要來(lái)自神經(jīng)外科、老年科、ICU 等科室。神經(jīng)外科是我院的重點(diǎn)特色專科，知名度高，床位較多，有高比例的患者系由外院轉(zhuǎn)入，神經(jīng)外科創(chuàng)傷病區(qū)轉(zhuǎn)入患者比例尤其高，且入院時(shí)常已有耐藥菌感染。此外特需病區(qū)、永和分院（康復(fù)病區(qū)，收治較多神經(jīng)外科創(chuàng)傷患者）、ICU 亦有相當(dāng)比例外院轉(zhuǎn)入神經(jīng)外科患者。而老年科多為長(zhǎng)期住院、反復(fù)使用抗菌藥物患者。這提示我院CRKP防控應(yīng)以神經(jīng)外科及其關(guān)聯(lián)病區(qū)、老年科為重點(diǎn)，除消毒、隔離等常規(guī)感控措施外，應(yīng)著重于開(kāi)展轉(zhuǎn)院、轉(zhuǎn)科患者耐藥菌篩查以避免輸入性耐藥菌的傳播，減少老年科患者的抗菌藥物暴露。我院 CRKP多分離自痰等 呼 吸 道 標(biāo) 本（76.1%） 和 尿 液（18.5%） 標(biāo) 本，則提示CRKP感染主要見(jiàn)于呼吸道、尿路，呼吸機(jī)相關(guān)肺炎、導(dǎo)尿管相關(guān)尿路感染應(yīng)為CRKP感染的預(yù)防重點(diǎn)[6]。

表3 blaKPC基因陽(yáng)性與陰性 CRKP 菌株對(duì)臨床常用抗菌藥物的耐藥率和敏感率Table 3 Susceptibility of carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae isolates to antimicrobial agents in terms of blaKPCgene status

碳青霉烯類藥物這一腸桿菌科細(xì)菌感染的重要治療藥物出現(xiàn)耐藥后，腸桿菌科細(xì)菌的治療藥物選擇匱乏，在目前窘境下，基于體外藥敏試驗(yàn)、少數(shù)病例報(bào)道和專家意見(jiàn)的推薦治療策略主要為：①以多黏菌素、替加環(huán)素、碳青霉烯類等為核心藥物的聯(lián)合用藥 ；②考慮藥物組織濃度和 PK/PD特點(diǎn)，通過(guò)增加給藥劑量、給藥次數(shù)和延長(zhǎng)滴注時(shí)間等給藥方案優(yōu)化，提高藥效學(xué)達(dá)標(biāo)概率；③霧化吸入、鞘內(nèi)注射等局部用藥提高感染部位組織的藥物濃度[7-9]。

我院分離 CRKP菌株對(duì)多黏菌素 E 敏感率為 98.1%，表明多黏菌素是治療 CRKP 感染的重要 選 擇。 但 有 40.0% 菌 株 MIC 值＞0.5 mg/L， 這些患者以多黏菌素單藥治療藥效學(xué)達(dá)標(biāo)概率低，兼以多黏菌素可能在治療中發(fā)生誘導(dǎo)耐藥，因此 宜 聯(lián) 合 其 他 藥 物[10]。 我 院 分 離 CRKP 菌 株 對(duì)替加環(huán)素敏感率亦高達(dá) 98.1%，且 91.2% 菌株的MIC≤0.5 mg/L， 提 示 多 數(shù) 菌 株 在 應(yīng) 用 替 加 環(huán) 素50 mg，每天 2 次給藥方案即可藥效學(xué)達(dá)標(biāo)，但亦有報(bào)道替加環(huán)素單藥治療碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細(xì)菌（CRE）感染病死率高于聯(lián)合治療，仍宜考慮聯(lián)合其他藥物[8]。

Monte Carlo 模擬顯示在碳青霉烯類藥物對(duì)腸桿 菌 科 細(xì) 菌 MIC≤4 mg/L 甚 至 更 高 至≤16 mg/ L，通 過(guò) 增 大 美 羅 培 南 劑 量 至 每 次 2 g、 每 8 小 時(shí) 1次，每次滴注時(shí)間延長(zhǎng)至 3 h，其藥效學(xué)達(dá)標(biāo)概率仍可達(dá) 85% 以上。而臨床病例報(bào)道薈萃分析顯示MIC≤4 mg/L、8 mg/L 和＞8 mg/L 時(shí)， 碳 青 霉 烯類單藥治療的療效分別為 69%、60% 和 29%[10-11]。Daikos 等[11]因此認(rèn)為，當(dāng)碳青霉烯類對(duì)腸桿菌科細(xì)菌 MIC≤4 mg/L 時(shí)，碳青霉烯類單藥治療有效，但與其他種類抗生素（如氨基糖苷類、多黏菌素E、替加環(huán)素）聯(lián)合應(yīng)用可提高療效；當(dāng)碳青霉烯類耐藥菌株的 MIC＞4 mg/L 時(shí)，不能用碳青霉烯類單獨(dú)治療。Morrill等[12]則認(rèn)為，碳青霉烯類MIC≤16 mg/L 時(shí)，可選擇碳青霉烯類作為治療藥物之一 ；當(dāng)碳青霉烯類 MIC＞16 mg/L 時(shí)，應(yīng)考慮用其他藥物。本研究亞胺培南、美羅培南對(duì)CRKP菌 株 MIC 值≤16 mg/L 僅 分 別 占 24.9% 和 9.8%，≤4 mg/L 更 低 至 2.9% 和 2.0%， 表明 在 我 院 以 碳青霉烯類治療CRKP感染的前景堪憂。

受 試 CRKP 對(duì) 阿 米 卡 星 的 敏 感 率 為 25.1%，且較我院 2005－2010 年分離 CRKP 敏感率（14.7%）有所上升[13]；有報(bào)道阿米卡星單藥治療 CRE 所致尿路感染療效佳，與其他藥物聯(lián)合治療血流感染等可提高臨床療效和細(xì)菌清除率[12]，因此在其藥敏提示敏感時(shí)，亦可作為治療藥物之一，尤其是血液、尿路等氨基糖苷類藥物濃度較高部位的感染。我院分離 CRKP 對(duì)甲氧芐啶-磺胺甲唑的敏感率為 49.0%，但鑒于該藥為抑菌劑，目前僅有口服制劑供應(yīng)，且缺乏治療CRKP的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)，其治療 CRKP感染的地位尚不明確。受試菌株對(duì)環(huán)丙沙星的敏感率為 12.6%，且環(huán)丙沙星在肺部等組織濃度亦較高，但鑒于環(huán)丙沙星治療 CRE感染的臨床經(jīng)驗(yàn)缺乏，宜慎用環(huán)丙沙星等氟喹諾酮類治療CRKP感染。

腸桿菌科細(xì)菌對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥的主要機(jī)制是產(chǎn)碳青霉烯酶，其中以KPC 型碳青霉烯酶為主，且在全球廣泛分布[14]，少數(shù)菌株為產(chǎn)ESBL 和 /或 AmpC 酶合并外膜孔蛋白缺失等。本次實(shí)驗(yàn) 87.8%（180/205）菌株檢出 blaKPC基因， 較我 院 2005－2010 年 CRKP 中 blaKPC基 因 檢 出 率 70.6%（77/109） 進(jìn) 一 步 升 高[13]。 一 項(xiàng) 對(duì) 國(guó) 內(nèi) 13所醫(yī)院分離的 95 株 CRKP 的研究結(jié)果顯示[15]，全部細(xì)菌均產(chǎn)生 KPC 型碳青霉烯酶。這些說(shuō)明 KPC是碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細(xì)菌的主要耐藥機(jī)制。提示頭孢他啶-阿維巴坦等碳青霉烯酶抑制劑復(fù)方制劑有望在治療CRKP感染中發(fā)揮重要作用，應(yīng)盡快引進(jìn)[16]?？傊?，在當(dāng)前國(guó)內(nèi)無(wú)多黏菌素、頭孢他啶-阿維巴坦供應(yīng)情況下，CRKP 的治療選擇有限、成本高且療效不可靠，應(yīng)著重防控其傳播。

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Susceptibility and prevalence of blaKPCgene in carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae

BI Yingmin, SHEN Zhen, DONG Dong, WU Shi, HU Fupin, YANG Fan.
（Institute of Antibiotics, Huashan Hospital, Fudan University, key Laboratory of Clinical Pharmacology of Antibiotics, Ministry of Health, Shanghai 200040, China）

Objective To examine the antimicrobial susceptibility and prevalence of blaKPCgene in carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae (CRKP) strains isolated in Huashan Hospital, Fudan University. Methods The CRKP strains isolated in Huashan Hospital from January to December of 2014 were included in this study. The MICs of antibiotics were determined using CLSI broth dilution method. The blaKPCgene was amplif i ed by polymerase chain reaction (PCR). Results A total of 205 CRKP strains were isolated, mainly from respiratory tract (76.1%, 156/205) and urine specimens (18.5%, 38/205). Antimicrobial susceptibility test indicated that CRKP isolates had higher resistance rates (85% - 100%) to the antimicrobial agents except colistin (1.5%), tigecycline (0.5%), trimethoprim-sulfamethoxazole (51.0%) and amikacin (74.9%). Most (87.8%, 180/205) of the CRKP strains were positive for blaKPCgene. Conclusions CRKP are mostly isolated from patients with lower respiratory tract infection and/or urinary tract infection in Huashan Hospital. The strains were highly resistant to the antibacterial agents tested except colistin and tigecycline. Production of KPC-type carbapenemase is the common mechanism of carbapenem resistance in these K. pneumoniae isolates.

carbapenem-resistant; Klebsiella pneumoniae; antimicrobial susceptibility; blaKPCgene

R378

：A

：1009-7708 ( 2017 ) 03-0298-05

10.16718/j.1009-7708.2017.03.014

2016-11-02

2016-11-21

復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院抗生素研究所，衛(wèi)生部抗生素臨床藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200040。

畢穎敏（1989—），女，碩士研究生，主要從事細(xì)菌耐藥性及耐藥機(jī)制研究。

楊帆，E-mail：fanyang9@fudan.edu.cn。